高效液相色譜法測定固體飲料中γ-氨基丁酸含量

高效液相色譜法測定固體飲料中Y-氨基丁酸含量固體吳蓉;周瑋;何慧園【摘要】建立了一種快速準(zhǔn)確地測定固體飲料中Y-氨基丁酸含量的高效液相色譜分析方法:采用丹磺酰氯(Dansyl-Cl)為柱前衍生化試劑，色譜柱為AgilentEclipseXDB-C18,流動相為25mmol/L乙酸鈉(pH=6.0)和乙腈的混合溶液(體積比為68:32),流速為1.0mL/min,柱溫30^,等度洗脫,紫外檢測波長216nm.結(jié)果表明,該方法的線性范圍為0.0025mg/mL~0.1mg/mL,R2=0.9995,線性關(guān)系良好，檢出限2.514ng,平行試驗(yàn)6次Y-氨基丁酸質(zhì)量濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.89%,3個不同濃度的加標(biāo)回收率在96.00%~102.39%之間,回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.80%~2.87%之間.與傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法相比,該方法具有基線穩(wěn)定，靈敏度高，線性范圍廣，回收率高及重現(xiàn)性好等特點(diǎn).【期刊名稱】《食品工程》【年(卷)，期】2016(000)004【總頁數(shù)】5頁(P59-63)【關(guān)鍵詞】固體飲料;Y-氨基丁酸;高效液相色譜;丹磺酰氯【作者】吳蓉;周瑋;何慧園【作者單位】江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,江蘇南京210000;江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇南京210000;江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,江蘇南京210000【正文語種】中文【中圖分類】TS278Y-氨基丁酸（Y-aminobutyricacid,GABA），又名氨酪酸或哌啶酸，是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸，在自然界中的分布極為廣泛，在動植物及微生物中均有存在。GABA對哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抑制作用，能參與多種代謝活動，具有重要的生理功能。GABA在人體內(nèi)作為神經(jīng)傳導(dǎo)的主要介質(zhì)，具有促進(jìn)血管擴(kuò)張降血壓、促進(jìn)睡目眠增強(qiáng)記憶力、鎮(zhèn)靜神經(jīng)抗焦慮、預(yù)防及治療癲癇病、加強(qiáng)腦代謝預(yù)防老年癡呆癥等作用。在上世紀(jì)80年代，日本利用植物富集法首次研發(fā)了GABA茶功能性食品。隨后，富含GABA的發(fā)芽糙米實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)。目前，GABA已被廣泛地應(yīng)用于飲料、果醬、糕點(diǎn)、餅干、調(diào)味品等食品中，開發(fā)出各種適合不同人群及年齡段的產(chǎn)品，具有極其廣闊的發(fā)展前景。目前國內(nèi)外關(guān)于GABA的測定方法主要有比色法、氨基酸分析儀法、薄層掃描法、放射性受體法、高效液相色譜法等。由于GABA對電化學(xué)、紫外、可見光及熒光的響應(yīng)強(qiáng)度低，直接測定非常困難，需要將其衍生化處理后再測定，因此，柱前衍生-高效液相色譜法已成為測定GABA的主要方法。近年來，常用的GABA衍生化方法主要有法丹磺酰氯（DNS）法、2,4-二硝基氟苯（FDNB）法、6-氨基喹琳基-N-羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯（AQC）法、鄰苯二甲醛（OAP）法。由于FDNB毒性太強(qiáng)、靈敏度低，AQC價格昂貴，OAP反應(yīng)不穩(wěn)定且數(shù)據(jù)重現(xiàn)性差，因此采用DNS作為GABA測定的衍生化試劑。與傳統(tǒng)的DNS法相比，本試驗(yàn)優(yōu)化了DNG的使用濃度，節(jié)約了成本，提高了回收率。本文旨在以DNS為衍生化試劑，建立一種能夠快速、準(zhǔn)確地測定固體飲料中GABA含量的高效液相色譜分析方法。1.1材料與試劑固體飲料，南京市生產(chǎn)廠家。硼酸，分析純，南京化學(xué)試劑一廠；丹磺酰氯，純度＞98%，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；冰乙酸，優(yōu)級純，南京化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸鈉，分析純，蘇彤化學(xué)試劑有限公司；乙腈，色譜純，德國默克股份兩合公司；甲醇，色譜純，德國默克股份兩合公司；水，超純水；Y-氨基丁酸，純度＞99%,SIGMA公司。1.2儀器與設(shè)備2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；2996二極管陣列檢測器，美國Waters公司；XS205DU電子分析天平，美國梅特勒-托利多儀器公司；XW-80A混合渦旋儀，上海青浦瀘西儀器廠；SB25-12DTDN超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。1.3方法1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備準(zhǔn)確稱取0.1g（精確至0.0001g）GABA，用超純水溶解并定容至10mL,經(jīng)超聲波溶解后，振蕩混勻，配制成質(zhì)量濃度為10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用超純水按上述步驟將10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋成0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。1.3.2樣品溶液的制備準(zhǔn)確稱取0.05g~0.50g粉碎試樣（精確至0.0001g）,用純水溶解并定容至100mL,經(jīng)超聲波溶解后，振蕩混勻，用孔徑0.22pm濾膜過濾，收集濾液，作為衍生化樣品溶液，備用。1.3.3硼酸緩沖溶液的制備準(zhǔn)確稱取2.47g硼酸（精確至0.0001g）,加純水80mL超聲溶解，用氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至10.2，并用水定容至100mL,配制成0.4mol/L的硼酸緩沖溶液。1.3.4DNS衍生液的制備準(zhǔn)確稱取15mgDNS，用乙腈溶解并定容至10mL，經(jīng)超聲波溶解后，振蕩混勻，配制成1.5mg/mL的DNS溶液。避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。1.3.5柱前衍生化反應(yīng)準(zhǔn)確吸取1.3.2中的樣品溶液50",加入150"0.4mol/L硼酸緩沖溶液和300pL1.5mg/mL的DNS衍生液，渦旋混勻，靜置反應(yīng)2min后，過孔徑0.22pm濾膜，進(jìn)樣。標(biāo)準(zhǔn)溶液同步衍生化，步驟同上，標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生后的質(zhì)量濃度分別為0.0025mg/mL、0.005mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL。1.3.6高效液相色譜分析條件色譜柱：AgilentEclipseXDB-C18(4.6pmx150mm,5pm);流動相：流動相A為25mmol/L的乙酸鈉溶液，用2%的醋酸調(diào)pH值至6.0±0.2;流動相B為乙月青；等度洗脫，其中A：B=68:32;流速1mL/min;柱溫30°C;進(jìn)樣量10pL;檢測波長216nm。1.4數(shù)據(jù)分析HPLC色譜圖采用WatersEmpower工作站采集，使用Empower2Software軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin8.0進(jìn)行繪圖制作。2.1流動相的選擇及優(yōu)化依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，GABA的測定可以采用乙酸鈉-乙青或磷酸緩沖溶液-甲醇為流動相，但其方法均采用梯度洗脫程序，不僅基線不穩(wěn)而且洗脫時間長。因此，本試驗(yàn)在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，采用等度洗脫，以25mmol/L的乙酸鈉溶液(pH=6.0)-乙青為流動相，該方法準(zhǔn)確度高，且基線噪音小，能達(dá)到有效地分離效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)乙酸鈉溶液與乙青的體積比調(diào)至68:32,可以在15min內(nèi)有效地分離GABA,GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖1所示，保留時間為6.4min,分離效果良好。2.2最大吸收波長的確定為了提高方法的靈敏度，選擇合適的檢測波長至關(guān)重要。本試驗(yàn)采用0.1mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.5進(jìn)行衍生化反應(yīng)，與沒有添加GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白液做對比，結(jié)果見圖2。經(jīng)光譜分析后，GABA有3個最大吸收波長。同一濃度不同波長下的GABA標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖3所示，由響應(yīng)強(qiáng)度分析可得，取GABA衍生物的最大吸收波長216nm為最適檢測波長。2.3GABA的定性分析在1.3.6的色譜條件下，采用1.3.5的方法，對沒有添加GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白液、樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行衍生化反應(yīng)，色譜圖見圖4。由圖4可知，GABA的保留時間為6.4min，基線平穩(wěn)，分離效果好，雜質(zhì)峰對目標(biāo)物的測定無干擾。2.4標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線的繪制將質(zhì)量濃度分別為0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.3.5進(jìn)行衍生化反應(yīng)，在1.3.6的色譜條件下測定，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，衍生后標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X（mg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性回歸方程為Y=6.7411X106X-7970.3，回歸系數(shù)R2=0.9995。結(jié)果表明，GABA的質(zhì)量濃度在0.0025mg/mL~0.1mg/mL之間時，利用本試驗(yàn)方法測定的結(jié)果呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，以3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算檢出限為2.514ng，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。2.5精密度試驗(yàn)對同一種固體飲料進(jìn)行平行試驗(yàn)共6次，計(jì)算樣品中GABA的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，GABA衍生物峰面積的RSD為0.89%,GABA質(zhì)量濃度的RSD為0.89%。2.6回收率試驗(yàn)分別稱取同一質(zhì)量濃度的固體飲料樣品3份，按照樣品溶液中GABA質(zhì)量濃度的80%、100%、120%進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，按照1.3.6的色譜條件及1.3.5的試驗(yàn)方法，測定樣品中GABA的質(zhì)量濃度，計(jì)算回收率、平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果如表2所示。由表2可知，本試驗(yàn)方法的回收率在96.00%~102.39%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.80%~2.87%之間。GABA在自然界中分布廣泛，但在不同物質(zhì)中的含量差別較大。本試驗(yàn)采用柱前衍生-高效液相色譜法測定固體飲料中GABA的含量，在傳統(tǒng)的DNS法基礎(chǔ)上，采用等度洗脫，實(shí)現(xiàn)樣品與衍生化試劑的快速分離；選擇最優(yōu)檢測波長，提高靈敏度；優(yōu)化DNS的濃度，提高回收率。OAP作為一種廣譜的衍生化試劑，近年來被廣泛采用，但其穩(wěn)定性較差，因此，本方法采用DNS作衍生化試劑，不僅能達(dá)到OAP的效果，而且能彌補(bǔ)其存在的不足。同時與FDNB法及AQC法相比較，該方法成本低、衍生化過程簡單、檢測線性范圍廣、精密度高且重現(xiàn)性好。采用本方法測定固體飲料中的GABA，回收率范圍在96.00%~102.39%之間，為后續(xù)食品中GABA的測定提供了有力的平臺，也為GABA的測定奠定了應(yīng)用基礎(chǔ)?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】[1]楊勝遠(yuǎn)，陸兆新，呂風(fēng)霞，等.Y-氨基丁酸的生理功能和研究開發(fā)進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2005,26(9):546-551.[2]程威威，周婷，吳躍，等.高效液相色譜法測定發(fā)芽糙米中Y-氨基丁酸含量[J].食品科學(xué)，2014,35(12):98-101.[3]PATILSB,KHANMK.Germinatedbrownriceasavalueaddedriceproduct:Areview[J].JournalofFoodScienceandTechnologyMysore,2011,48(6):661-667.[4]DEFEUDISFV.y-Aminobutyricacidandcardiovascularfunction[J].Experientia,1983,39(8):845-849.[5]楊藻宸.藥理學(xué)和藥物治療學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2000.[6]PERRYTL,HANSENS.Aminoacidabnormalitiesinepileptogenicfoci[J].Neurology,1981,31(7):872-876.[7]OKADAT,SUGISHITAT,MURAKAMIT,etal.EffectofthedefattedricegermenrichedwithGABAforsleeplessness,depression,autonomicdisorderbyoraladministration[J].NipponShokuhinKagakuKogakuKaishi,2000,47(8):596-603.[8]LEVENTHALAG,WangY,PuM,eta