等電點(diǎn)電泳原理步驟詳細(xì)

（優(yōu)選）等電點(diǎn)電泳原理步驟詳細(xì)/當(dāng)前第1頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)講課內(nèi)容

IEFE定義

1

IEFE的特點(diǎn)

2

IEFE的基本原理3

IEFE的應(yīng)用4

血紅蛋白的等電聚焦電泳（實(shí)驗(yàn)）

5當(dāng)前第2頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)一、IEFE定義

IEFE一種利用具有pH梯度的支持介質(zhì)分離等電點(diǎn)（isoelectricpoint，pI)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。

Isoelectricfocusing(IEF),isatechniqueforseparatingdifferentmoleculesbytheirelectricchargedifferences.當(dāng)前第3頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)

等電聚焦(Isoelectricfocusing,IEF)就是在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)(Carrierampholyte)，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由陽極到陰極逐步增加的pH梯度，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚焦于其相當(dāng)?shù)牡入婞c(diǎn)位置上，也就是說被聚焦于一個(gè)狹的區(qū)帶中，電泳技術(shù)中的等電點(diǎn)聚焦也稱為聚焦電泳。

當(dāng)前第4頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)講課內(nèi)容

IEFE定義

1

IEFE的特點(diǎn)

2

IEFE的基本原理3

IEFE的應(yīng)用4

血紅蛋白的等電聚焦電泳（實(shí)驗(yàn)）

5當(dāng)前第5頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)二、IEFE的特點(diǎn)

（一）優(yōu)點(diǎn)HighResolutionHighSensitivity

GoodReproduction當(dāng)前第6頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)（二）缺點(diǎn)1.要求用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質(zhì)可能發(fā)生沉淀。2.樣品中的成分必須停留在其pI，不適用在pI不溶或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)。當(dāng)前第7頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)分辨率(resolution)較不連續(xù)PAGE更高，特別適合于分離分子量(molecuarweight,MW)相同而電荷(electriccharge)不同的生物大分子。

QM=——6r當(dāng)前第8頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)講課內(nèi)容

IEFE定義

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IEFE的特點(diǎn)

2

IEFE的基本原理3

IEFE的應(yīng)用4

血紅蛋白的等電聚焦電泳（實(shí)驗(yàn)）

5當(dāng)前第9頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)三、IEFE的基本原理當(dāng)前第10頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)蛋白質(zhì)分子在不同pH下的解離狀態(tài)

NH3+NH3+NH2PPPCOOHCOO-COO-

pH＜pIpH＝pIpH＞pI

當(dāng)前第11頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)

在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)(carrierampholytes)

，當(dāng)通入直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極(anode)到負(fù)極(cathode)逐漸增加的pH梯度，正極附近是低pH區(qū)，負(fù)極附近是高pH區(qū)。當(dāng)前第12頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)蛋白質(zhì)分子的電聚焦過程

+pI1

pI2

pH=pIpI3

pIn-

abc

蛋白質(zhì)分子在負(fù)極端蛋白質(zhì)分子在正極端蛋白質(zhì)樣品中各組分聚焦成區(qū)帶

—+當(dāng)前第13頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)

在這個(gè)從正極到負(fù)極pH逐漸增加的直流電場中，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入這個(gè)環(huán)境，不同的蛋白質(zhì)帶上不同性質(zhì)和數(shù)量的電荷，向著一定方向移動(dòng)，遷移到與其相同的等電點(diǎn)位置上停留下來，即被聚焦于一個(gè)狹的區(qū)帶中，得以分離。TheproteinsbecomefocusedintosharpstationarybandswitheachproteinpositionedatapointinthepHgradientcorrespondingtoitspI.

當(dāng)前第14頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)當(dāng)前第15頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)進(jìn)行IEFE必須具備3個(gè)條件：①有一個(gè)在電泳條件下基本穩(wěn)定、重復(fù)性良好的pH梯度②有一個(gè)抗對流的電泳材料，使已經(jīng)分離的樣品不再重新混合③電泳后有適當(dāng)?shù)姆椒▉龛b定分離的區(qū)帶當(dāng)前第16頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)（一）pH梯度的建立

用多種兩性電解質(zhì)(ampholytes)混合物建立穩(wěn)定良好的pH梯度當(dāng)前第17頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)1.理想的載體兩性電解質(zhì)（Carrierampholytes）應(yīng)具備的特征：

①分子量要小，以便與被分離大分子物質(zhì)分離；②化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的緩沖能力；④在pI處具有足夠的電導(dǎo)，導(dǎo)電性均勻；⑤兩性電解質(zhì)載體的數(shù)目要足夠多；⑥可溶性好；⑦對280nm的紫外光沒有或僅有很低的吸光度，不干擾樣品的測定。當(dāng)前第18頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)2.載體兩性電解質(zhì)的合成

本質(zhì)：一系列脂肪族(aliphaticampholytes)多氨基多羧酸同系物和異構(gòu)體，具有很多既不相同又十分接近相互連接的pI值。pH范圍：pH3~10丙烯酸+多乙烯多胺

Ampholine（LKB）加成反應(yīng)當(dāng)前第19頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)當(dāng)前第20頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)3.pH梯度的形成

載體兩性電解質(zhì)(Carrierampholytes)是一系列不同分子的兩性電解質(zhì)的混合物,在通電后，它們各自遷移到適當(dāng)位置形成一個(gè)連續(xù)的pH梯度(pHgradient)。

當(dāng)前第21頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)

㈠沒通電時(shí)的變化所有的載體兩性電解質(zhì)(Carrierampholytes)分子都荷電，只是溶液中荷正電和荷負(fù)電的基團(tuán)數(shù)目相等，凈電荷(netcharge)為零。當(dāng)前第22頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)㈡引入電場時(shí)的變化載體兩性電解質(zhì)(carrierampholytes)分子將向陰極(cathode)或陽極(anode)遷移，帶有最低等電點(diǎn)的分子（荷最多的負(fù)電）將最快地向陽極遷移。當(dāng)它達(dá)到凈電荷是零的位置時(shí)才停止。其次一些低pI的載體兩性電解質(zhì)分子（荷其次多的負(fù)電）也將向陽極移動(dòng)，直到它的凈電荷被減少到零才停止。當(dāng)前第23頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)㈢電泳結(jié)束后的變化

所有的載體兩性電解質(zhì)(carrierampholytes)分子以增加pI級數(shù)的辦法將分別在陽、陰極之間到達(dá)它們自己的位置而給出一個(gè)pI梯度。當(dāng)前第24頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)當(dāng)前第25頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)電解槽中，通電后，正負(fù)兩極都會(huì)發(fā)生電極反應(yīng)：正極端反應(yīng)：6H2O→O2+4H3O++4e-負(fù)極端反應(yīng)：4H2O+4e-→2H2+4OH-在負(fù)極引起pH值的升高，在正極pH下降，另外在電極槽的正極端放的是酸性溶液，負(fù)極端放的是堿性溶液造成了在電極附近pH的急劇變化當(dāng)前第26頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)

由于載體兩性電解質(zhì)(carrierampholytes)是一系列不同分子的兩性電解質(zhì)的混合物所組成的，設(shè)其中某一成分為A，它的pI=pH’，當(dāng)環(huán)境中的pH>pH’時(shí)，它帶負(fù)電荷，朝正極移動(dòng)。當(dāng)前第27頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)

當(dāng)環(huán)境pH<pH’時(shí)，它帶正電荷，朝負(fù)極移動(dòng)，直至移動(dòng)到它的等電點(diǎn)處，在那里聚集。由于兩性電解質(zhì)A在它的pI處具有一定的緩沖能力，因此在它附近形成一個(gè)pH穩(wěn)定區(qū)域。當(dāng)前第28頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)

同樣載體兩性電解質(zhì)(carrierampholytes)中各種兩性電解質(zhì)也會(huì)各自遷移到它們的等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)處，由于它們的數(shù)量足夠多，各自的等電點(diǎn)相差很小，從而形成一個(gè)pH梯度。當(dāng)前第29頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)當(dāng)前第30頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)當(dāng)前第31頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)（二）支持介質(zhì)(medium)的選擇

作用：防止擴(kuò)散抗對流liquidmedium：蔗糖、Ficollgelmedium：agarose、sephadex、PAG當(dāng)前第32頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)（三）聚焦后的檢測方法各種染色法掃描與定量其它檢測方法當(dāng)前第33頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)講課內(nèi)容

IEFE定義

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IEFE的特點(diǎn)

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IEFE的基本原理3

IEFE的應(yīng)用4

血紅蛋白的等電聚焦電泳（實(shí)驗(yàn)）

5當(dāng)前第34頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)四、IEFE的應(yīng)用

ApplicationsofIEF1.分析分離制備蛋白質(zhì)、多肽①區(qū)分人血清蛋白②測出異常免疫球蛋白③基因分型④csf中寡克隆區(qū)帶的檢測2.測定pI可鑒定蛋白質(zhì)、多肽3.雙相電泳中，IEF作為第一相當(dāng)前第35頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)雙向電泳（two-dimensionalelectrophoresis,2-DE）當(dāng)前第36頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)考馬斯亮藍(lán)銀染當(dāng)前第37頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)講課內(nèi)容

IEFE定義

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IEFE的特點(diǎn)

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IEFE的基本原理3

IEFE的應(yīng)用4

血紅蛋白的等電聚焦電泳（實(shí)驗(yàn)）

5當(dāng)前第38頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)實(shí)驗(yàn)血紅蛋白的等電聚焦電泳Hb具有四條多肽鏈

（α、β、γ、δ）

當(dāng)前第39頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)HbA正常成人血中主要的Hb成分。HbA2

正常成人Hb中的一個(gè)次要成分，當(dāng)

胎兒出生時(shí)，其濃度不到1%，以后

稍增多，在正常成人中其平均值自

2.2%至2.6%左右，最高范圍一般

不超過3.5%。

當(dāng)前第40頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)

HbF1866年發(fā)現(xiàn)，是胎兒和初生兒的Hb的主要成分，足月的初生嬰兒血中大約有70-80%為HbF，其余為HbA。嬰兒出生后不久，HbF的濃度迅速減少，同時(shí)HbA相應(yīng)增多，絕大多數(shù)正常人于出生后6個(gè)月至2年后，HbF便降至成人的正常濃度，以后HbF一直存在。當(dāng)前第41頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)[器材]

電泳儀凝膠玻管三角燒杯10cm長針頭當(dāng)前第42頁\共有46頁\編于星期六\18點(diǎn)[試劑