基因工程的原理和技術(shù)

第一章第二節(jié)基因工程的原理和技術(shù)要求：1、概述基因工程的原理。

2、概述基因工程基本操作的幾個(gè)步驟。一、基因工程的基本原理讓人們感興趣的基因（目的基因）在宿主細(xì)胞（受體細(xì)胞）中穩(wěn)定和高效地表達(dá)。實(shí)際包括目的基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。從而實(shí)現(xiàn)對生物性狀的定向改造。利用大腸桿菌合成大量的人胰島素?；疽兀耗康幕?？受體細(xì)胞？需要用到的工具酶？需要用到的工具？要實(shí)現(xiàn)該過程需要哪些步驟？獲得目的基因形成重組DNA分子將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞篩選含有目的基因的受體細(xì)胞目的基因的表達(dá)二、基因工程的基本操作步驟P61.若目的基因的序列已知（如已確定基因的脫氧核苷酸序列）則可用游離脫氧核苷酸在DNA自動(dòng)合成儀上直接合成相應(yīng)的基因。DNA合成儀思考，若已知某個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列，能否用上述方法合成該蛋白質(zhì)的基因？請說明理由。蛋白質(zhì)的氨基酸序列→mRNA的核苷酸序列→基因的脫氧核苷酸序列由此推斷出來的基因的脫氧核苷酸序列不唯一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增目的基因：PCR技術(shù)：在體外的小試管中通過酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)1、定義：2、條件：DNA模板、DNA聚合酶（Taq酶）、4種游離的脫氧核苷酸、兩種引物PolymeraseChainReaction2.逆（反）轉(zhuǎn)錄法：目的基因的mRNA單鏈DNA雙鏈DNA（即目的基因）逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR技術(shù)擴(kuò)增過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成_______

b、復(fù)性（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈2.若基因的序列未知從基因文庫中獲取目的基因：基因文庫：把某種生物體的基因組DNA用限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，將酶切片段插入到載體DNA分子中，所有這些重組DNA分子分別導(dǎo)入受體菌，這些受體菌包含這個(gè)生物體的整個(gè)基因組，也就是構(gòu)成了這個(gè)生物體的基因文庫。將單個(gè)菌落放入細(xì)胞培養(yǎng)板基因庫與基因文庫的區(qū)別？從基因文庫中獲取目的基因（二）形成重組DNA分子①注意：并不是一定要用相同的限制性核酸內(nèi)切酶處理目的基因和載體DNA，為什么？②注意：目的基因與質(zhì)粒形成的重組DNA分子又可稱為“含目的基因的重組質(zhì)粒”③思考：用相同的限制性核酸內(nèi)切酶處理目的基因和載體，目的基因和載體可能自身環(huán)化，如何避免？通常用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和載體DNADNA連接酶連接目的基因和載體DNA

形成重組DNA分子用相同的限制性核酸內(nèi)切酶處理目的基因和載體，目的基因和載體可能自身環(huán)化，如何避免？小型環(huán)狀DNA雙酶切法(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用的受體細(xì)胞：動(dòng)植物細(xì)胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌、酵母菌等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。注意：1、培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)應(yīng)該選用動(dòng)物體內(nèi)的哪種細(xì)胞作為受體細(xì)胞？

2、培育轉(zhuǎn)基因植物呢？受精卵受精卵和體細(xì)胞都可以方法導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入大腸桿菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法——顯微注射法——

用CaCl2處理增加大腸桿菌細(xì)胞壁的通透性

目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞整合到受體細(xì)胞的染色體上目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達(dá)1.農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物。Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的染色體上2.轉(zhuǎn)化基因槍法花粉管通道法利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的重組DNA分子打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。常用的金屬顆粒有鎢粉粒子和金粉粒子。顯微注射法（microinjection）是利用管尖極細(xì)（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射針，將含有目的基因的表達(dá)載體直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細(xì)胞中，然后藉由宿主基因組序列可能發(fā)生的重組、缺失、復(fù)制或易位等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi)。(四)篩選含有目的基因的受體細(xì)胞前三步的處理十分繁鎖，為保證目的基因得到有效利用，通常用大量的受體細(xì)胞來接受重組DNA分子。這樣，處理的受體細(xì)胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中篩選出來。(四)篩選含有目的基因的受體細(xì)胞檢測辦法——通過標(biāo)記基因等1種抗性基因2種抗性基因基因工程中質(zhì)粒的特點(diǎn)：具有標(biāo)記基因思考：當(dāng)目的基因分別重組在質(zhì)粒中1、2、3的位置及未重組的質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞中后，受體細(xì)胞的抗性有何區(qū)別？T12如何判斷目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后是否表達(dá)？篩選得到的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)，目的基因能夠和質(zhì)粒一起在宿主菌內(nèi)大量擴(kuò)增。練習(xí)（07北京理綜）利用外源基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，可生產(chǎn)人類所需要的產(chǎn)品，下列各項(xiàng)中能說明目的基因完成了在受體細(xì)胞中表達(dá)的是A、棉花二倍體細(xì)胞中檢測到細(xì)菌的抗蟲基因B、大腸桿菌中檢測到人胰島素基因及其mRNAC、山羊乳腺細(xì)胞中檢測到人生長激素DNA序列D、酵母菌細(xì)胞中提取到人干擾素蛋白(五）目的基因的表達(dá)D個(gè)體水平鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定等分子水平鑒定：抗原-抗體雜交“篩選含有目的基因的細(xì)胞”后發(fā)現(xiàn)受體細(xì)胞仍不能合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，可能的原因是什么？從轉(zhuǎn)錄翻譯入手1.基因工程的含義及核心：2.基因工程的工具：3.限制性核酸內(nèi)切酶的含義及作用特點(diǎn)：判斷：限制性核酸內(nèi)切酶能識(shí)別和切割RNA4.DNA連接酶的作用：T45.質(zhì)粒的含義、特性、作用：①對宿主細(xì)胞無害②能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存③能使目的基因表達(dá)④具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。（如抗生素的抗性基因、具有顏色反應(yīng)的基因等）⑤有多個(gè)限制酶酶切位點(diǎn)×判斷：1.質(zhì)粒只存在于細(xì)菌中2.重組質(zhì)粒中應(yīng)該含有限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)×也可存在于真菌細(xì)胞、線粒體內(nèi)、葉綠體內(nèi)3.將ada（腺苷酸脫氨酶基因）通過質(zhì)粒pET28b導(dǎo)入大腸桿菌并成功表達(dá)腺苷酸脫氨酶，下列敘述錯(cuò)誤的是A.每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞至少含有一個(gè)重組質(zhì)粒B.每個(gè)重組質(zhì)粒至少含一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)C.每個(gè)限制核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)至少插入一個(gè)adaD.每個(gè)插入的ada至少表達(dá)一個(gè)腺苷酸脫氨酶分子C4.如果質(zhì)粒和目的基因接反了，會(huì)影響目的基因的表達(dá)嗎？6.基因工程的原理：7.描述基因工程的五個(gè)基本操作步驟：第一節(jié)1~9BCAABBBDA第二節(jié)8（1）質(zhì)粒DNA重組DNA分子（2）限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶（3）CaCl2

（4）②④9（1）氨基酸（氨基酸和單糖）

脫氧核苷酸（2）干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病毒蛋白抑制病毒基因的翻譯過程（或病毒蛋白質(zhì)的合成）核酸（DNA或RNA）（3）質(zhì)粒DNA分子的不同基因之間具有相對獨(dú)立性第二節(jié)18（1）限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶（2）轉(zhuǎn)錄翻譯19（2005·天津理綜·31）限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制性內(nèi)切酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。在質(zhì)粒上有酶Ⅰ的一個(gè)切點(diǎn)，在目的基因的兩側(cè)各有1個(gè)酶Ⅱ的切點(diǎn)。①請畫出質(zhì)粒被限制酶Ⅰ切