細(xì)胞與組織化學(xué)

細(xì)胞與組織化學(xué)第一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第一章概述第一節(jié)概述第二節(jié)組織細(xì)胞化學(xué)的發(fā)展史第二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)概述

1.組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)

組織化學(xué)是研究整個(gè)組織，而細(xì)胞化學(xué)是研究單個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞和組織化學(xué)中的科學(xué)技術(shù)為細(xì)胞和組織中定位特定的化合物提供了方法。

Eg.組織切片與目標(biāo)酶的底物一起孵育，這一反應(yīng)的產(chǎn)物與存在于孵育混合物中的色素發(fā)生反應(yīng)。如果樣品在孵育前固定的很好，且固定過程沒有對(duì)酶造成損傷，那么這個(gè)過程將會(huì)使組織薄片中含酶的細(xì)胞在顯微鏡下顯現(xiàn)。若顯微鏡具有更高的分辨率，還可以將含有該酶的亞細(xì)胞器顯現(xiàn)。組織化學(xué)（histochemistry)和細(xì)胞化學(xué)（cytochemistry）技術(shù)的基本原理是在組織切片上或被檢材料上，加一定試劑，使它與組織或細(xì)胞中待檢物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)成為有色沉淀物，以用光鏡觀察，若為重金屬沉淀，可以用電鏡觀察，稱電鏡組織化學(xué)（electronmicroscopehistochemistry)。這種方法可用于檢測細(xì)胞內(nèi)的酶類、糖類、脂類。核酸與某些多屬元素等。如進(jìn)一步應(yīng)用顯微分光光度計(jì)等測定標(biāo)本中沉淀物的強(qiáng)度，則能較精確地進(jìn)行定量研究。

2.研究組織、細(xì)胞傳統(tǒng)的化學(xué)方法第三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三糖類顯示法最常用于顯示細(xì)胞、組織內(nèi)的多糖和蛋白多糖的方法是過碘酸-雪夫反應(yīng)（periodicacidSchiff，PAS反應(yīng))?；驹硎牵禾潜粡?qiáng)氧化劑過碘酸（HIO4)氧化后，形成2-醛基；后者與Schiff試劑中的無色品紅亞硫酸復(fù)合物結(jié)合，形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物,PAS反應(yīng)陽性部位即表示多糖的存在。

酶類顯示

細(xì)胞內(nèi)含有多種酶,每一種酶可催化一定的化學(xué)反應(yīng)。酶的顯示法是通過顯示酶的活性來表明酶的存在，而不是酶的本身。將具有酶活性的組織放人含有一定底物的溶液中孵育，底物經(jīng)酶的作用形成初級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物，它再與某種捕捉劑相反應(yīng),形成顯微鏡下可視性沉淀,即最終反應(yīng)產(chǎn)物。

如欲顯示細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶,先將切片放入含有酶底物(常用β-甘油磷酸鈉)的溶液（PH5.0)中孵育，底物經(jīng)酶的作用，水解并釋放出磷酸；用捕捉劑硝酸鉛與磷酸反應(yīng)，形成微細(xì)的磷酸鉛沉淀，此時(shí)，可在電鏡下檢出；如再用硫化銨處理時(shí)，磷酸鉛被置換成硫化鋁沉淀，可在光鏡下見到。

第四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三脂類顯示脂類物質(zhì)包括脂肪與類脂。標(biāo)本可用甲醛固定、冷凍切片、用油紅、蘇丹Ⅲ、蘇內(nèi)Ⅵ、蘇丹黑B、尼羅藍(lán)等脂溶性染料染色；亦可用餓酸固定兼染色，脂類呈黑色。

核酸顯示法

顯示DNA的傳統(tǒng)方法為Feulgen反應(yīng)。切片先經(jīng)稀鹽酸處理后，使細(xì)胞內(nèi)DNA水解，打開DNA分子中膠氧核糖核酸和嘌呤堿之間的連接鍵，使其釋放出醛基，再用Schiff試劑處理，形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物。

如用甲基綠-派若寧反應(yīng)，可同時(shí)顯示細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA甲基綠與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合呈藍(lán)綠色，派若寧與核仁及胞質(zhì)內(nèi)的RNA結(jié)合呈紅色。

第五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三3．現(xiàn)代意義的細(xì)胞與組織化學(xué)

包括電鏡細(xì)胞化學(xué),免疫細(xì)胞化學(xué),顯微放射自顯影,流式細(xì)胞術(shù),細(xì)胞染色體DNA原位雜交，胞內(nèi)ca2+測量等。細(xì)胞是一個(gè)生命體，組織的構(gòu)成也是由細(xì)胞組成，在研究生命規(guī)律及探索生命規(guī)律的過程中，要應(yīng)用到許多技術(shù)和方法，從而產(chǎn)生了組織和細(xì)胞化學(xué)等學(xué)科。第六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三其發(fā)展過程為:1.早期：用放大鏡看細(xì)胞及組織的形態(tài)。（局限于對(duì)細(xì)胞及組織進(jìn)行形態(tài)描述）2.后期：由于近代物理學(xué)、化學(xué)及生物等學(xué)科的發(fā)展，為人們研究細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)及組織切片方法提供了豐富的知識(shí)和條件，觀察細(xì)胞的生命規(guī)律及組織切片需建立和應(yīng)用的手段，到現(xiàn)在已經(jīng)經(jīng)歷了一個(gè)漫長的發(fā)展過程，并取得了長足的進(jìn)步。如放射免疫技術(shù)，電鏡細(xì)胞化學(xué)，免疫細(xì)胞化學(xué)，顯微放射自顯影等技術(shù)已應(yīng)運(yùn)而生。第二節(jié)組織細(xì)胞化學(xué)的發(fā)展史第七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第二章組織學(xué)的研究方法

第一節(jié)概述第二節(jié)組織學(xué)制片概述第三節(jié)取材和固定第四節(jié)固定后的處理第五節(jié)染色及染色方法第八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)概述

組織學(xué)（histofogy）是應(yīng)用顯微鏡研究機(jī)體微細(xì)結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能的科學(xué)，是在解剖學(xué)的基礎(chǔ)上從宏觀到微觀發(fā)展形成的，故又被稱為顯微解剖學(xué)（microscopicanatomy）。組織學(xué)的研究內(nèi)容，首先要研究組成機(jī)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能單位——細(xì)胞；繼而研究在細(xì)胞及其產(chǎn)物所組成的基本組織（primarytissue）——上皮組織。結(jié)締組織、肌肉組織和神經(jīng)組織；在此基礎(chǔ)上研究各器官系統(tǒng)的微細(xì)結(jié)構(gòu)及其有關(guān)功能.第九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三組織學(xué)是重要的基礎(chǔ)課程，只有對(duì)機(jī)體微細(xì)結(jié)構(gòu)的深入了解才可能透徹地闡明其功能；組織學(xué)的研究極大地促進(jìn)了生理學(xué)的發(fā)展、生物化學(xué)的進(jìn)步也促進(jìn)了組織學(xué)的發(fā)展，例如，將生物化學(xué)及分子生物學(xué)的原理用于組織學(xué)而建立起組織化學(xué)及分子細(xì)胞學(xué)，將免疫學(xué)的原理用于組織學(xué)而建立起免疫組織化學(xué)等。從而使人們得知各種細(xì)胞與組織的化學(xué)組成、分子結(jié)構(gòu)及其基本生命現(xiàn)象，這些知識(shí)已成為現(xiàn)代組織學(xué)的重要組成部分。第十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)組織學(xué)制片概述

1.組織學(xué)制片方法非切片法

直接取物體進(jìn)行觀察，不用切片機(jī)，不經(jīng)切片手續(xù)而制成切片的方法。包括：a.整體封藏法eg水螅雞胚蛙胚b.涂片法針對(duì)液體或半液體。Eg血液骨髓腹水c.活體標(biāo)本觀察法eg蛙口腔黏膜的纖毛運(yùn)動(dòng)細(xì)胞吞噬d.分離法eg分離三種肌細(xì)胞神經(jīng)纖維脊髓前角神經(jīng)細(xì)胞e.鋪片法eg腸系膜可觀察肥大細(xì)胞彈力纖維膠元纖維等f.磨片法eg骨組織或牙齒

切片法需依靠切片機(jī)將組織切成薄片的方法。第十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三2.組織切片制作流程：殺死、取材與固定、洗滌、脫水、透明、透入、包埋、切片、貼片、染色、封藏。第十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第三節(jié)取材和固定1.取材與固定（組織切片制作的關(guān)鍵步驟）

取材：首先動(dòng)物組織需從動(dòng)物體中取出。方法有多種,主要是視材料的種類，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體大小及觀察的目的而定。殺死的方法：大的個(gè)體(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)用刀，斧頭，麻醉等方法.

小的個(gè)體（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物）采用大號(hào)剪刀或斷頭法等。取材注意事項(xiàng)：取材需速度快，取材以后，應(yīng)立即進(jìn)行固定。否則細(xì)胞會(huì)自溶。魚殺死后2小時(shí)再烹調(diào)比剛處理完就烹調(diào)的味道要更鮮美。這是細(xì)胞自溶導(dǎo)致的結(jié)果。第十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三固定

固定的目的：防止組織腐敗及自溶。將所需要的物質(zhì)原位沉淀、保存，盡量使各種成分保持與原來（活著）的狀況相仿。3.沉淀下來以后，會(huì)造成組織的折光率的變化。即增加折光性，并使易染色。4.通過固定以后,使組織產(chǎn)生硬化現(xiàn)象,有利于切片的制作。2．固定的對(duì)象

構(gòu)成細(xì)胞的主要物質(zhì)是蛋白質(zhì),它分散在細(xì)胞內(nèi),所以固定的對(duì)象是蛋白質(zhì)。第十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三作為固定劑的化學(xué)試劑必須具有能凝固或沉淀蛋白質(zhì),脂肪等成分,并具有強(qiáng)的滲透力.固定劑必須具備的性質(zhì):1)迅速滲入組織殺死原生質(zhì)(滲透速度要快),即很快能將細(xì)胞殺死,固定不會(huì)使組織很快產(chǎn)生變化。2)滲透要均勻。(使組織內(nèi)外盡量保持一致)3)盡量避免出現(xiàn)膨脹和收縮狀況。4)盡量避免使組織塊變形,卷曲。5)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固,沉淀。6)增加折光性,媒染作用和染色能力。7)使組織變硬,適于切片,但又不至于使材料堅(jiān)硬而松脆。8)固定以后,又能有保存組織的特性(如用福爾馬林浸泡)。3．組成固定劑的性質(zhì)和條件第十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三4.固定劑的作用方式（三種）1)使蛋白質(zhì)變性.蛋白質(zhì)變性會(huì)成為沉淀物質(zhì),其是不可逆的.例：酒精使蛋白質(zhì)變性不是與蛋白質(zhì)形成化合物，而是使蛋白質(zhì)脫水而使之變性。2）固定劑與蛋白質(zhì)發(fā)生化合作用，改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生沉淀。3）使蛋白質(zhì)凍膠化，固定液與蛋白質(zhì)間起了化學(xué)上的結(jié)合，改變了分子結(jié)構(gòu)，不產(chǎn)生沉淀，是使蛋白質(zhì)凝膠化，并不溶與水。第十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三5.固定劑的媒染效果

生活細(xì)胞大多不易染色，但經(jīng)過固定后便易染色，這是由于固定劑與蛋白質(zhì)相結(jié)合，同時(shí)也能與染料分子結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)著色。6.固定劑的穿透率。穿透率要強(qiáng)，迅速，才能在短時(shí)間內(nèi)使組織內(nèi)外都得到固定。第十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三7.取材和固定應(yīng)注意事項(xiàng)1）固定的材料要新鮮。組織會(huì)產(chǎn)生自溶。夏天不超過2-4小時(shí)。材料取出后應(yīng)立即固定,有些組織自溶很快。冬天不超過12小時(shí)。2）取材的部位要準(zhǔn)確。（要清楚所需的材料位于動(dòng)物體內(nèi)哪個(gè)位置）3）取材工具要鋒利，動(dòng)作需仔細(xì)。4）切取的組織塊必須小而薄，一般取0.3-0.5mm厚的組織塊進(jìn)行固定。5）清洗。如小腸組織需清洗其內(nèi)的黏液及食物殘?jiān)?，才能投入到固定劑?nèi)。6）組織塊附加標(biāo)記的方法。組織塊取得較多并放在同一容器內(nèi)，易發(fā)生混淆。應(yīng)加標(biāo)簽以區(qū)別之，并注明固定液，材料，日期等。7）固定劑的用量。固定組織，一般所采用的固定液體積為組織塊的10-15倍，容器勿過小，材料勿太多。第十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三8.常見固定劑的性質(zhì)及使用-)單純固定劑A甲醛（純甲醛為一種氣體）溶于水成為甲醛水溶液或稱福爾馬林。市面上出甲醛濃度通常為37-40%。甲醛使用時(shí)，需采用新鮮的。放置時(shí)間較長的甲醛會(huì)變成多聚甲醛，為強(qiáng)的還原劑。其不可與氧化劑混合使用。作為固定劑的優(yōu)點(diǎn)：滲透力強(qiáng)，使組織收縮少。固定均勻，能較好的固定脂肪。神經(jīng)及髓鞘，且能固定高爾基體，線粒體。缺點(diǎn)：不能固定白蛋白和核蛋白。B乙醇（為無色透明的液體)其可與水混合。優(yōu)點(diǎn):可以沉淀白蛋白,球蛋白,核蛋白.穿透力強(qiáng),滲透力較弱。缺點(diǎn):不宜作低溫固定.酒精濃度超過50%可溶解組織內(nèi)的脂肪.類脂體,血色素等。C醋酸（具刺激味的無色液體)固定組織通常用5%的HAC。PH2-6.防止細(xì)胞自溶。優(yōu)點(diǎn):其能沉淀核蛋白,是種好的染色質(zhì)固定劑.穿透速度快.固定時(shí)間較短,通常1小時(shí)即可。缺點(diǎn):其不能沉淀白蛋白、球蛋白使組織膨脹,高濃度HAC會(huì)破壞線粒體和高爾基。第十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三D苦味酸(常見的一種酸)為一種強(qiáng)酸,黃色結(jié)晶.其在干燥空氣中激烈晃動(dòng),會(huì)發(fā)生爆炸,苦味酸的運(yùn)輸以溶解在水中的飽和苦味酸,濃度為1%。作為固定液的優(yōu)點(diǎn):能沉淀所有的蛋白質(zhì),穿透力強(qiáng)。缺點(diǎn):使組織收縮。E重鉻酸鉀(橙紅色的結(jié)晶,強(qiáng)氧化劑,不可與還原劑(酒精)等混用.重鉻酸鉀溶液中加醋酸后,產(chǎn)生鉻酸,才能使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。優(yōu)點(diǎn):穿透力較強(qiáng)。缺點(diǎn):使組織產(chǎn)生一點(diǎn)膨脹。F.鋨酸(四養(yǎng)化鋨)為黃色的結(jié)晶,為強(qiáng)的氧化劑。優(yōu)點(diǎn):其為脂肪及類脂體的唯一的固定劑,能將線粒體及高爾基體固定成為黑色.穿透速度慢,可保持組織柔軟。缺點(diǎn):較難固定組織,毒性高,易損傷眼睛及黏膜,價(jià)格昂貴。G氯化汞:通稱升汞,劇毒,呈白色粉末狀,以針狀結(jié)晶為最純,能沉淀一切蛋白質(zhì)(包括核蛋白)。優(yōu)點(diǎn):其對(duì)蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的沉淀作用,能充分固定細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。第二十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三二)混合固定液１.Bouin液苦味酸飽和水溶液甲醛冰醋酸該固定液滲透力強(qiáng),使組織收縮少.固定時(shí)間12-24小時(shí).２.Carnoy液無水乙醇氯仿冰醋酸對(duì)組織穿透速度快,多用于糖原,脫氧核糖核酸固定.３.Zenker液重鉻酸鉀升汞雙蒸水冰醋酸采用該液,須脫汞處理.４.Helly液重鉻酸鉀升汞雙蒸水甲醛第二十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第四節(jié)固定后的處理

1.洗滌洗滌的目的

組織在固定后一定要把滲入組織里面的固定液洗去，然后進(jìn)行下一個(gè)過程，為防止組織中留有較多的固定劑影響脫水劑，甚至可在組織中發(fā)生沉淀或結(jié)晶而影響觀察，特別是對(duì)陳舊性標(biāo)本更應(yīng)注意流水沖洗，盡可能減少組織中的酸性程度和甲醛色素。對(duì)于混合性固定液，更應(yīng)及時(shí)洗滌，有利于脫水，切片和染色。第二十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三洗滌的方法1．固定劑以水配置者用流水沖洗，可使組織中固定液隨時(shí)溢出和隨時(shí)洗去。大的動(dòng)物組織沖洗時(shí)間為24小時(shí)左右，小動(dòng)物組織沖洗時(shí)間為2-10小時(shí)。沖洗的時(shí)間基本根據(jù)固定的時(shí)間而定,新鮮的標(biāo)本固定時(shí)間短,需及時(shí)脫水者,沖洗時(shí)間短.固定時(shí)間短。2固定劑含乙醇者一般不要求沖洗，如需沖洗必須采用與固定劑溶度相近的乙醇沖洗。3特殊固定液洗滌法

1）重鉻酸鉀流水沖洗12-24小時(shí)，或用亞硫酸，或用1%含氯水溶液進(jìn)行洗滌。

2）鋨酸流水沖洗12-24小時(shí)，務(wù)必沖干凈。

3）苦味酸用50%或70%乙醇浸泡。盡量洗去黃色。

4）氯化汞用0.5%碘酒溶液反復(fù)加入到70%乙醇中，直至黃色不再褪去為止.再用硫代硫酸鈉或70%乙醇洗去碘。第二十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三2.常用脫水劑

乙醇

為常用的脫水劑。脫水能力強(qiáng)，并能使組織硬化。一般的脫水順序是70%、80%、90%、95%I、95%II、無水乙醇I、無水乙醇II、無水乙醇III。應(yīng)注意的是脫水必須在有蓋的瓶子內(nèi)進(jìn)行。

丙酮

沸點(diǎn)為56℃，脫水作用比乙醇強(qiáng)，但對(duì)組織塊的收縮較大。脫水時(shí)間通常為1-3小時(shí)。

正丁醇

為無色液體，沸點(diǎn)100-118℃，微溶于水。一般使用方法為：組織塊經(jīng)固定及沖洗后先入50%-70%-80%乙醇中脫水，然后轉(zhuǎn)入正丁醇12-24小時(shí)浸蠟。

叔丁醇

是異丁醇的一種，無毒，熔點(diǎn)為25℃。電鏡上常用的中間脫水劑。第二十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三3.透明透明的目的在制片過程中有兩次透明，第一次是脫水以后的透明；第二次透明是染色后的切片透明。組織塊透明的目的是便于浸蠟包埋，切片透明目的是有利于光線的透過，便于顯微鏡的觀察。透明劑的種類

1二甲苯

2甲苯

3苯

4香柏油第二十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三4.浸蠟與包埋5.包埋6.切片7.貼片8.染色第二十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第五節(jié)染色及染色方法

1.天然染料

蘇木精

本身不作為染料，其氧化產(chǎn)物蘇木紅才作為染料。氧化的方式：

1）

自然氧化作用

2）

化學(xué)氧化作用

卡紅靛蘭地衣紅巴西木素第二十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三2.人工合成染料

生色團(tuán)與助色團(tuán)酸性、堿性與中性染料

1)酸性染料（陰離子染料）生色團(tuán)位于其分子的陰離子處。2)堿性染料（陽離子染料）生色團(tuán)位于其分子的陽離子處。

第二十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三3.異染現(xiàn)象

染料離子以某種方式使它對(duì)所吸收的波長有所改變，因而觀察到被染的組織顯示與該染料本身顏色不一樣，此現(xiàn)象為異染現(xiàn)象。

4.熒光染料

是指需要經(jīng)過波長很短（低于400nm）的紫外線照射激發(fā)以后而發(fā)出熒光的一類特殊染料。第二十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第三章光鏡標(biāo)本制作

組織學(xué)的研究方法很多，并隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，又不斷創(chuàng)建新技術(shù)，在應(yīng)用中要根據(jù)研究的目的和內(nèi)容，選用相應(yīng)的方法才能獲得預(yù)期的效果。這里僅就最常用、最基本的一些方法做簡要介紹。第一節(jié)涂片、鋪片、磨片標(biāo)本的制備第二節(jié)切片標(biāo)本的制備第三十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)涂片、鋪片、磨片標(biāo)本的制備

1.涂片標(biāo)本的制備涂片（smear）法是常用的一種方法，如血液等可直接涂于載玻片上制成涂片標(biāo)本，干燥后進(jìn)行固定、染色及封固。2.鋪片標(biāo)本的制備（stretchedpreparation）用于疏松結(jié)締組織、神經(jīng)等柔軟組織或腸系膜等薄層組織，可將其鋪于載玻片上，撕開、展平制成鋪片標(biāo)本，待干燥后進(jìn)行固定染色。

第三十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三3.磨片標(biāo)本的制備（groundsection）用于堅(jiān)硬組織的標(biāo)本制作，如骨和牙等堅(jiān)硬組織除用酸（如稀硝酸）脫鈣后再按常規(guī)制成切片標(biāo)本外，也可直接將其磨成薄的磨片標(biāo)本進(jìn)行觀察。第三十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)切片標(biāo)本的制備

觀察機(jī)體各部的微細(xì)結(jié)構(gòu)時(shí)，首先要制成薄片，就是切片法，其中以石蠟切片（Paraffinsection）最為常見。第三十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三其制備程序大致如下:①取材與固定：取材要盡量新鮮動(dòng)物材料。取得新鮮材料后，切成適當(dāng)?shù)男K1.0立方厘米大?。┝⒓赐度牍潭▌╢ixative）中進(jìn)行固定，使組織中蛋白質(zhì)迅速凝固，防止組織自溶或腐敗，以保持生活狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)。常用的固定劑有甲醛、酒精、醋酸、苦味酸、餓酸等。②脫水（dehydtation）、透明（clearing）與包埋（embedding）:把固定好的材料用乙醇將組織內(nèi)的水分脫掉，經(jīng)二甲苯透明后，再浸入已融化的石蠟中進(jìn)行浸透、包埋。③切片（section）與染色（staining）：用切片機(jī)（microtome）切成5～10μm的薄片，貼于載玻片上，脫蠟后進(jìn)行染色，最常用的染色法是蘇木精（hematoxylin,haematoxylin)和伊紅（eosin）染色簡稱HE染色。配制后的蘇木精染液呈堿性，可使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的核糖體等染成藍(lán)紫色，稱嗜堿性（basophilia)；伊紅是酸性染料，可使多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染成粉紅色，稱嗜酸性（acidophilia）；耐堿性和酸性染液親合力都不強(qiáng)的，稱為中性（neutroPhilia）；④封固（mounting）：切片經(jīng)脫水、透明后，于切片上滴加中性樹膠和蓋片進(jìn)行封固后，貼標(biāo)簽備用。

第三十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三除HE染色外，還有多種染色方法。有的能特異性的顯示細(xì)胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)，如使用雷鎖辛品紅（resorcin-fuchsin)染液顯示組織內(nèi)的彈性纖維；有的細(xì)胞經(jīng)重鉻酸鹽處理后，呈棕褐色，稱嗜鉻性（chromaffinity）；有的組織成分經(jīng)硝酸銀處理時(shí)，可使硝酸銀還原，形成銀微粒附著在組織中呈棕黑色，該特性稱為親銀性（argentaffin）；有的組織結(jié)構(gòu)成分，本身不能使硝酸銀還原，需加還原劑方能使硝酸銀還原，形成棕褐色很微粒附著在組織結(jié)構(gòu)上，這種性質(zhì)稱為嗜銀性（argyrophilia）；如肥大細(xì)胞中的顆粒經(jīng)甲苯胺藍(lán)（tofuidineblue）等堿性染料染色后,呈紫紅色，這種現(xiàn)象稱異染性(metachromasia），其原理可能是染料在溶液中以單體存在時(shí)呈藍(lán)色，當(dāng)它與顆粒中具有大量陰離子的多糖成分耦合后，聚合成多聚體而呈紫紅色。

第三十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三除石蠟切片外，在制作較大結(jié)構(gòu)（如眼球、睪丸等）的切片時(shí)，常用火棉膠包埋法；骨和牙等堅(jiān)硬的組織，可用弱酸（稀硝酸）脫鈣后，用石蠟或火棉膠切片（celloidinsection）法制成切片標(biāo)本；還有，為了較好地保存細(xì)胞內(nèi)的酶活性或盡快制成切片標(biāo)本的需要，可選用冷凍切片（frozensection），它是將組織先在低溫下快速凍結(jié)，經(jīng)直接切片后進(jìn)行染色，或?qū)⒔M織塊置入液氮（-196℃）內(nèi)快速冷凍，用恒冷箱切片（cryostatsection）后進(jìn)行染色。第三十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三

第四章光學(xué)顯微技術(shù)第一節(jié)光鏡技術(shù)第二節(jié)電子顯微鏡技術(shù)

第三十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)光鏡技術(shù)幾種特殊顯微鏡術(shù):相差顯微鏡干涉微分相差顯微鏡熒光顯微鏡暗視野顯微鏡共焦激光掃描顯微鏡第三十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三相差顯微鏡是用于觀察生活細(xì)胞或未經(jīng)染色細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。生活細(xì)胞無色透明，細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)間的反差很小，在一般光學(xué)顯微鏡下難以觀察到細(xì)胞的輪廓及內(nèi)部結(jié)構(gòu)，必須使用相差顯微鏡。相差顯微鏡的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是：①裝有不同大小環(huán)狀光闌的聚光器。②物鏡內(nèi)裝有位相板。③中心望遠(yuǎn)鏡裝置。相差顯微鏡的基本原理是通過上述裝置。把透過標(biāo)本的可見光的相位差變成振幅差，從而提高了標(biāo)本內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間的對(duì)比度，使標(biāo)本中的結(jié)構(gòu)清晰可辨。

第三十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三若觀察生長在培養(yǎng)瓶中的生活細(xì)胞，則需應(yīng)用倒置相差顯微鏡（invertedphasecon-trastmicrosope）。它與相差顯微鏡基本相同，它的特點(diǎn)是物鏡安裝在載物臺(tái)的下方，光源及長焦距聚光器安裝在載物臺(tái)的上方；可以對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行長時(shí)間觀察、拍照、攝電影及錄像等以記錄生活細(xì)胞的行為。

第四十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三干涉微分相差顯微鏡基本原理與相差顯微鏡非常相似，但它有一裝有分光器的聚光器，利用分光器將光束分為兩組，一組光束通過被檢物，另一束則通過周圍介質(zhì)，旋轉(zhuǎn)檢偏器，光的干涉形成光程差，可隨旋轉(zhuǎn)，兩光束形成不同的角度，于是被檢物呈現(xiàn)出不同顏色，致使生活細(xì)胞如同染上顏色一樣，故又稱為光染色。它與相差顯微鏡相比，除有鮮艷的顏色外，在細(xì)胞周圍不出現(xiàn)明亮的暈環(huán)。

第四十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三熒光顯微鏡

是用以觀察細(xì)胞及組織內(nèi)熒光物質(zhì)的分布。它是裝有、能產(chǎn)生紫外線（短波長）的光源及系列濾片裝置的顯微鏡。由于紫外線的照射，標(biāo)本中的熒光物質(zhì)吸收光能后，呈現(xiàn)出不同顏色的熒光，這是自發(fā)熒光，如維生素A呈綠色熒光、心肌細(xì)胞內(nèi)脂褐素呈棕黃色～金黃色熒光。但是,細(xì)胞內(nèi)的某些成分只有與熒光素結(jié)合后，在紫外線的激發(fā)下，始可呈現(xiàn)一定顏色的熒光；如應(yīng)吖啶橙（熒光素）處理細(xì)胞后，細(xì)胞核內(nèi)的DNA呈綠～黃綠色熒光，細(xì)胞質(zhì)及核仁內(nèi)的RNA呈桔黃～桔紅色熒光。利用熒光染色法及熒光顯微鏡可以觀察組織、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)某些成分含量的變化，并探討細(xì)胞的功能狀態(tài)?；蛴脽晒馑貥?biāo)記免疫球蛋白，進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)研究。第四十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三暗視野顯微鏡

特點(diǎn)是該顯微鏡具有暗視野聚光器，使光線不直接進(jìn)人物鏡，故呈暗視野。該顯微鏡適用于觀察細(xì)胞內(nèi)微小顆粒，例如線粒體、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)等。人眼的分辨力為200um,普通光鏡為0.2um，而暗視野顯微鏡的分辨力為其50倍，為004um.第四十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三共焦激光掃描顯微鏡

是80年代初研制成功的一種高光敏度、高分辨率的新型儀器。它的主要特點(diǎn)是：①以激光作為光源。②采用共焦成像系統(tǒng)．③掃描、顯示及記錄系統(tǒng)。激光具有發(fā)散角小、方向性好的優(yōu)點(diǎn)，光束通過聚焦后落在樣品（如細(xì)胞等）的不同深度；在不同方向、不同深度的平面上進(jìn)行聚焦掃描，從而得到一系列不同層次的清晰圖像。平面間隔最小約600～800nm；利用微機(jī)圖像合成系統(tǒng)可重建細(xì)胞的三維圖像，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體視學(xué)的定量分析研究；CLSM可以更精確地檢測、識(shí)別，組織或細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)結(jié)構(gòu)及其變化。由此，CLSM又有細(xì)胞CT之稱。第四十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)電子顯微鏡技術(shù)目前，電子顯微鏡技術(shù)（electronmicroscopy)已成為研究機(jī)體微細(xì)結(jié)構(gòu)的重要手段。常用的有透射電鏡（transmissionelectronmicroscope，TEM）和掃描電子顯微鏡（scanningelectronmicroscope,SEM）。與光鏡相比電鏡用電子束代替了可見光，用電磁透鏡代替了光學(xué)透鏡并使用熒光屏將肉眼不可見電子束成像。

第四十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三成像原理

透射電鏡技術(shù)掃描電鏡術(shù)冷凍蝕刻復(fù)型術(shù)冷凍割斷術(shù)第四十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三透射電鏡技術(shù)透射電鏡是以電子束透過樣品經(jīng)過聚焦與放大后所產(chǎn)生的物像，投射到熒光屏上或照相底片上進(jìn)行觀察。透射電鏡的分辨率為0.1～0.2nm，放大倍數(shù)為幾萬～幾十萬倍。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，必須制備更薄的超薄切片（通常為50～100nm）。其制備過程與石蠟切片相似，但要求極嚴(yán)格。要在機(jī)體死亡后的數(shù)分鐘釣取材，組織塊要小(1立方毫米以內(nèi)），常用戊二醛和餓酸進(jìn)行雙重固定樹脂包埋,用特制的超薄切片機(jī)（ultramicrotome）切成超薄切片，再經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛等進(jìn)行電子染色。第四十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三電子束投射到樣品時(shí)，可隨組織構(gòu)成成分的密度不同而發(fā)生相應(yīng)的電子發(fā)射，如電子束投射到質(zhì)量大的結(jié)構(gòu)時(shí)，電子被散射的多，因此投射到熒光屏上的電子少而呈暗像，電子照片上則呈黑色。稱電子密度高（electrondense）。反之，則稱為電子密度低（electronlucent）。

第四十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三掃描電鏡術(shù)

掃描電鏡是用極細(xì)的電子束在樣品表面掃描，將產(chǎn)生的二次電子用特制的探測器收集，形成電信號(hào)運(yùn)送到顯像管，在熒光屏上顯示物體。（細(xì)胞、組織）表面的立體構(gòu)像，可攝制成照片。

掃描電鏡樣品用戊二醛和餓酸等固定，經(jīng)脫水和臨界點(diǎn)干燥后,再于樣品表面噴鍍薄層金膜，以增加二波電子數(shù)。掃描電鏡能觀察較大的組織表面結(jié)構(gòu)，由于它的景深長，1mm左右的凹凸不平面能清所成像，故放樣品圖像富有立體感。第四十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三冷凍蝕刻復(fù)型術(shù)

冷凍蝕刻復(fù)型（freezeetchreplica）是電鏡樣品的一種制備技術(shù)，以顯示細(xì)胞、組織微細(xì)結(jié)構(gòu)的立體構(gòu)像。其樣品制備步驟如下：①冷凍：先把組織浸入含有20％～30％的甘油生理鹽水的冷凍保護(hù)劑中，以防止冰晶形成和提高冷凍速度，然后把組織放入液氮（-196℃)內(nèi)快速凍結(jié)；②斷裂在低溫真空內(nèi)，把凍結(jié)的組織用鋼刀劈開，斷裂面常為組織、細(xì)胞的薄弱部位，如膜的雙層類脂質(zhì)分子的疏水極之間余下部分的表面要觀察的部位冷凍蝕刻③蝕刻：在真空內(nèi)將溫度回升到-100℃，使斷裂面的冰

升華，形成凹凸不平的形態(tài)；④復(fù)型:

在斷裂面以45°角噴鍍一層鉑膜，以增加圖像的反差和立體感，再噴鍍一層碳膜以加固鉑膜。然后用次氯酸鈉等腐蝕液除去組織，撈取復(fù)型膜在透射電鏡下觀察。

第五十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三冷凍蝕刻復(fù)型技術(shù)是研究細(xì)胞膜相結(jié)構(gòu)的重要手段。細(xì)胞膜的雙層類脂質(zhì)層被劈分開后，其外層的內(nèi)表面稱胞質(zhì)外面或E面（extracellularface，E-face）；其內(nèi)層的外表面稱胞質(zhì)面或P面（plasllllcface，P-face）；在P面?？梢娫S多直徑6～9nm的膜內(nèi)粒子，而E面則較少。一般認(rèn)為腹內(nèi)粒子是細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)膜相結(jié)構(gòu)中的鑲嵌蛋白質(zhì)粒子的圖像，膜內(nèi)粒子的數(shù)量與分布隨膜的功能狀態(tài)而變化。因此，可應(yīng)用冷凍蝕刻復(fù)型求研究膜結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。

第五十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三冷凍割斷術(shù)（freezecracking)

將固定組織經(jīng)過處理后。置于特制的冷凍臺(tái)上，浸于二甲基亞砜中，低溫下將組織割斷，斷面噴鍍合金，在掃描電鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)斷面的立體圖像。第五十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三

第五章一般組織細(xì)胞化學(xué)

現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展是靠形態(tài)觀察結(jié)合生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究來推動(dòng)的，沒有這些相關(guān)學(xué)科的發(fā)展也就沒有現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)。組織化學(xué)或細(xì)胞化學(xué)染色（histochemicalorcytochemicalstaining）是利用染色劑可同細(xì)胞的某種成分發(fā)生反應(yīng)而著色的原理，對(duì)某種成分進(jìn)行定性或定位研究的技術(shù)。利用這種方法對(duì)細(xì)胞的各種成分幾乎都能顯示，包括有無機(jī)物、醛、蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸、酶等。第五十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三1.固定

目的是將細(xì)胞與組織的結(jié)構(gòu)和化學(xué)物質(zhì)雙重地保存下來，固定細(xì)胞與組織的方法有：物理固定：如血膜空氣快速干燥、冷凍干燥或直接冷凍切片?；瘜W(xué)固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑均能對(duì)組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和其中的某些化學(xué)物質(zhì)加以固定保存。不同化學(xué)試劑所保存的化學(xué)成分、對(duì)酶活性的影響、保存結(jié)構(gòu)的細(xì)膩度均不相同。因此，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和組化反應(yīng)，選擇最佳的固定方法和固定劑。如顯示多糖常用乙醇固定，而顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。第五十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三2.顯示方法

金屬沉淀法：利用金屬化合物在反應(yīng)過程中生成有色沉淀，借以辨認(rèn)所檢查的物質(zhì)或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。偶氮偶聯(lián)法：酚類化合物與偶氮染料結(jié)合后可以形成耐曬染料。Schiff反應(yīng)：細(xì)胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。這種反應(yīng)通常用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應(yīng)）。聯(lián)苯胺反應(yīng)：過氧化物酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無色的聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。普魯士藍(lán)反應(yīng)：三價(jià)鐵與酸性亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍(lán)。Formazane反應(yīng)：顯示脫氫酶?！癗adi”反應(yīng)：顯示細(xì)胞色素氧化酶。脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。第五十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第六章免疫組織細(xì)胞化學(xué)

免疫細(xì)胞與組織化學(xué)（immunocytochemistry）是根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對(duì)抗原進(jìn)行定位測定的技術(shù)?？乖饕獮榇蠓肿踊蚺c大分子相結(jié)合的小分子；抗體則是由漿細(xì)胞針對(duì)特定的抗原分泌的γ球蛋白。如果將抗體結(jié)合上標(biāo)記物，再與組織中的抗原發(fā)生反應(yīng)，即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組織中的部位

。第五十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)

抗體的分類及其特性第二節(jié)免疫組織化學(xué)的基本原理

第三節(jié)

抗原抗體的制備第五十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)

抗體的分類及其特性

1.

抗體的分類

單克隆抗體多克隆抗體基因工程抗體第五十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三2.抗體的特性

親和力指抗原決定簇和同源抗體結(jié)合位點(diǎn)間的反應(yīng)力，即分子間吸引與排斥力的總和?？贵w與抗原結(jié)合的專一性和交叉性

1）抗原-抗體反應(yīng)的專一性：指針對(duì)抗原決定簇的抗體不能與第二種抗原決定蔟互補(bǔ)，即一種抗體只能與一種抗原決定蔟反應(yīng)。2）當(dāng)抗原A的某些抗原決定蔟與第二種抗原B中的某些抗原決定蔟相同時(shí)，一部分抗體A會(huì)與抗原B進(jìn)行反應(yīng)。抗體效價(jià)

指抗體在保持其最佳特異性染色，并且具備最小背景條件下的最高稀釋倍數(shù)?？贵w的穩(wěn)定性其穩(wěn)定性受鹽濃度及pH等因素的影響。第五十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)免疫組織化學(xué)的基本原理

免疫組織化學(xué)是免疫學(xué)與組織化學(xué)相結(jié)合的一個(gè)分支學(xué)科、以免疫學(xué)的抗原-抗體反應(yīng)為理論基礎(chǔ)。一其全過程包括：

A抗體的制備：

1）抗原的提取和純化。2）免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合（單克隆抗體）。3）抗體效價(jià)檢測和提取。4）標(biāo)記抗體。

B抗原的檢測：1）細(xì)胞和組織切片的制備。2）免疫組織化學(xué)反應(yīng)和顯色。

C觀察和記錄結(jié)果。第六十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三二基本理論包括：1.抗原-抗體反應(yīng)2.免疫標(biāo)記化學(xué)反應(yīng)3.呈色化學(xué)反應(yīng)第六十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第三節(jié)抗原與抗體的制備1.抗原

凡進(jìn)入機(jī)體后能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一系列免疫反應(yīng),包括產(chǎn)生抗體和形成致敏的免疫細(xì)胞,并能與抗體或致敏細(xì)胞產(chǎn)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)稱為抗原.2.抗體是指機(jī)體在抗原的刺激下所產(chǎn)生的對(duì)抗抗原的特異性球蛋白,也稱免疫球蛋白.按化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)可分為IgGIgDIgMIgAIgE五類.一抗原的提取

(一)材料的選擇及預(yù)處理

(二)細(xì)胞的粉碎

1.物理法

a高速組織搗碎機(jī)b玻璃勻漿c超聲波處理法d反復(fù)凍融法

e冷熱交替法

2.化學(xué)和生物化學(xué)法a自溶法b溶菌酶處理法第六十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三(三)抗原的提取1蛋白質(zhì)和酶的提取2核酸的提取3活性多肽及遞質(zhì)的提取(四)抗原的分離與純化1.蛋白質(zhì)分離純化的一些方法1）鹽析法2）有機(jī)溶劑沉淀法3）等電點(diǎn)沉淀法4）吸附法（五）抗原的濃縮1.蒸發(fā)法2.冰凍法3吸收法二、免疫抗原的制備一）載體二）偶聯(lián)劑三）制備過程第六十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三抗體的制備一、抗血清的制備一）用于免疫的動(dòng)物二）免疫途徑三）佐劑四）免疫方法五）抗血清的采集與保存六）抗血清質(zhì)量的評(píng)價(jià)

1.效價(jià)指血清中所含抗體的濃度或含量。

2.特異性測定

3.親和力

第六十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三二、單克隆抗體的制備

（一）動(dòng)物的選擇與免疫

1.動(dòng)物的選擇

2免疫方案

1）可溶性抗原免疫抗原性較弱，需加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。

初次免疫（3周后）第二次免疫（3周后）第三次免疫（2-3周后）加強(qiáng)免疫（3天后）取脾融合第六十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三

2）顆粒原免疫性強(qiáng)，不加佐劑。

初次免疫（2-3周后）第二次免疫（3周后）加強(qiáng)免疫（融合前三天）取脾融合(二)細(xì)胞融合1.細(xì)胞融合前的準(zhǔn)備

(1)骨髓瘤細(xì)胞的選擇

(2)飼養(yǎng)細(xì)胞2.細(xì)胞融合的步驟

(1)制備飼養(yǎng)層細(xì)胞

(2)制備免疫脾細(xì)胞

(3)制備骨髓瘤細(xì)胞

(4)融合第六十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三

（三）選擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測（四）雜交瘤的克隆化（五）雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)舒（六）單克隆抗體的大量生產(chǎn)（七）單克隆抗體的鑒定第六十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第四節(jié)免疫組織化學(xué)技術(shù)的分類一、根據(jù)標(biāo)記物是否與特異性第一抗體結(jié)合分類1.直接法

將標(biāo)記物與第一抗體結(jié)合后，直接加到細(xì)胞或組織上，在適當(dāng)條件下，抗體與抗原反應(yīng)。

2.間接法

與（待檢物）抗原特異性結(jié)合的第一抗體未被標(biāo)記，而第二抗體以熒光素、酶或膠體金等標(biāo)記。第六十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。熒光素標(biāo)記的稱為免疫熒光法（immunofluorescenttechnique）常用的螢光素有異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate）、羅丹明（rhodamine）等。酶標(biāo)記的稱為酶標(biāo)免疫法（enzyme-labeledantibodymethod），常用的酶有辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase），酶與底物發(fā)生反應(yīng)后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。抗體與抗原的結(jié)合方法可分為直接法和間接法兩種，直接法是將帶有標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)，顯示出抗原存在的部位。而間接法則是在抗體抗原初級(jí)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，再用帶標(biāo)記的次級(jí)抗體同初級(jí)抗體反應(yīng)，從而使初級(jí)反應(yīng)得到放大，顯示增強(qiáng)。第六十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三二、根據(jù)標(biāo)記物或呈色物的不同分類(一)免疫熒光法(二)免疫酶組織化學(xué)法第七十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三免疫酶組織化學(xué)法是抗原抗體的特異性與酶的高效催化作用相結(jié)合的一種免疫標(biāo)記法。通過用酶標(biāo)記抗原或抗體的示蹤，對(duì)呈色反應(yīng)后的有色化合物進(jìn)行分光光密度的測定，可對(duì)免疫陽性產(chǎn)物做半定量的分析。此方法被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。其研究方法及分類如下：

1．常用的標(biāo)記酶1)辣根過氧化物酶（HRP）2)堿性磷酸酶3)葡萄糖氧化酶第七十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三2．非標(biāo)記抗體免疫酶法

將所用抗體均不做標(biāo)記，利用二抗作為橋，將一抗和終抗體連接起來，其中終抗體為抗酶抗體，來自與一抗相同的動(dòng)物種屬，為將酶免疫動(dòng)物后得到。目前最常用是未標(biāo)記酶法是將橋抗體與一抗和標(biāo)記的檢測試劑復(fù)合物連接起來，后者包括氧化物酶-抗過氧化物酶復(fù)合物、堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶復(fù)合物以及抗生物素蛋白-生物素-氧化物酶復(fù)合物。（1）PAP法(2)雙橋PAP法(3)APAAP法第七十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三3．親和免疫組織化學(xué)技術(shù)（1）抗生物素蛋白-生物素技術(shù)

1）橋連抗生物素蛋白-生物素技術(shù)（BRAB）

2）抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合法（2）葡萄球菌A蛋白法其能與某些動(dòng)物IgG的Fc段非特異性結(jié)合，將SPA替代橋抗體，把酶、熒光素等標(biāo)記在SPA上，標(biāo)記的SPA就可直接檢測組織細(xì)胞內(nèi)的IgG成分或免疫化合物。（3）凝集素法其具有與特定糖基專一結(jié)合的特性，用酶、膠體金等標(biāo)記凝集素，利用其能與細(xì)胞糖基和細(xì)胞膜上的微細(xì)結(jié)構(gòu)。（4）酶標(biāo)鏈酶抗生素蛋白-生物素法（LSAB）（5）鏈酶抗生素蛋白-過氧化物酶法（SP）是根據(jù)鏈酶抗生素蛋白-過氧化物酶法連接系統(tǒng)設(shè)計(jì)應(yīng)用于檢測組織和細(xì)胞內(nèi)抗原的一種高敏方法第七十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三4．放射自顯影標(biāo)記法放射自顯影術(shù)（radioautography；autoradiography）用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。其原理是將放射性同位素（如14C和3H）標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時(shí)間后，將標(biāo)本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)一定時(shí)間的放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光。然后經(jīng)過顯影、定影處理顯示還原的黑色銀顆粒，即可得知標(biāo)本中標(biāo)記物的準(zhǔn)確位置和數(shù)量，放射自顯影的切片還可再用染料染色，這樣便可在顯微鏡下對(duì)標(biāo)記上放射性的化合物進(jìn)行定位或相對(duì)定量測定。第七十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三這種技術(shù)與電鏡樣品處理，則為電鏡放射自顯影。由于有機(jī)大分子均含有碳、氫原子，故實(shí)驗(yàn)室一般常選用14C和3H標(biāo)記。14C和3H均為弱放射性同位素，半衰期長，14C為5730年，3H為12.5年。一般常用3H胸腺嘧啶脫氧核苷（3H-TDR）來顯示DNA，用3H尿嘧啶核苷（3H-UDR）顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，研究多糖則用3H甘露糖、3H巖藻糖等。第七十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三5．膠體金法用膠體金顆粒作為示蹤物或探針標(biāo)記抗體，利用抗原-抗體的特異性反應(yīng)，從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)外的或細(xì)胞表面的多糖、糖蛋白、多肽、激素和核酸等生物大分子予以精確定位。第七十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第七章原位雜交組織化學(xué)分子雜交技術(shù)（molecularhybridization）是在研究DNA分子復(fù)性變化基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種技術(shù)。其原理是，具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。第七十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三（一）、原位雜交（insituhybridization）用來檢測染色體上的特殊DNA序列。最初是使用帶放射性的DNA探針，通過放射自顯影來顯示位置。后來又發(fā)明了免疫探針法，將探針核苷酸的側(cè)鏈加以改造，探針雜交后，其側(cè)鏈可被帶有熒光標(biāo)記的抗體所識(shí)別，從而顯示出位置（圖2-21）。圖2-21人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片(來自)第七十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三（二）、Southern雜交是體外分析特異DNA序列的方法，操作時(shí)先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用標(biāo)記的探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。第七十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)探針制備一、

探針的來源

1.克隆分離

2.建立基因文庫

3.人工合成

4.反向合成

二、探針標(biāo)記

1.同位素標(biāo)記(1)缺口平移(或缺口翻譯)標(biāo)記法(2)末端標(biāo)記法,適用于寡核苷酸探針的標(biāo)記(3)隨機(jī)引物法第八十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三2非同位素標(biāo)記法（１）半抗原標(biāo)記法最常用的是將地高辛連在NTP或dUTP上，或隨機(jī)啟動(dòng)延伸法標(biāo)記RNA或DNA探針，雜交后用羊地高辛抗體的Fab段與堿性磷酸酶的復(fù)合物檢測，用NBT及X－磷酸鹽顯色．（２）直接標(biāo)記法將特定的酶或蛋白質(zhì)直接標(biāo)記RNA或DNA分子上，然后以酶促顯色反應(yīng)或特異性蛋白質(zhì)染色做檢測系統(tǒng)．（３）生物素標(biāo)記法將生物素用酶學(xué)方法或化學(xué)方法連接在核酸探針上，分子雜交后利用抗生物素對(duì)生物素具有高度親和力的特性，用標(biāo)記的生物素蛋白或鏈酶抗生素蛋白進(jìn)行檢測．

第八十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)原位雜交的組織標(biāo)本制作１冰凍切片新鮮組織取材后迅速驟冷，制成冰凍切片．２石蠟切片一般用Bouin固定液固定組織．３載玻片處理第八十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第三節(jié)雜交組織化學(xué)反應(yīng)１雜交前切片的預(yù)處理２雜交是核酸探針與組織或細(xì)胞內(nèi)靶核酸以氫鍵方式通過互補(bǔ)堿基結(jié)合過程，兩個(gè)單鏈RNA分子之間，單鏈DNA和RNA之間或兩個(gè)單鏈RNA之間均可形成雜交體。３雜交后處理與探針顯示第八十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第八章細(xì)胞分離技術(shù)

（一）、差速離心（differentialcentrifugation）

在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器（圖2-22）。在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體、最后為核蛋白體。由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復(fù)2～3次效果會(huì)好一些。差速離心只用于分離大小懸殊的細(xì)胞，更多用于分離細(xì)胞器。通過差速離心可將細(xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過密度梯離心再行分離純化。

第八十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三圖2-22速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀圖2-22速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀

第八十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三（二）、密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種（圖2-23）。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高；2）PH中性或易調(diào)為中性；3）濃度大時(shí)滲透壓不大；4）對(duì)細(xì)胞無毒。第八十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三圖2-23

A等速度沉降，B等密度沉降第八十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三1、速度沉降

速度沉降（velocitysedimentation）主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。這種降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。

生物顆粒（細(xì)胞或細(xì)器）在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。第八十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三2、等密度沉降

等密度沉降（isopycnicsedimentation）適用于分離密度不等的顆粒。細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長時(shí)間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。等密度沉降通常在較高密度的介質(zhì)中進(jìn)行。介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度，而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度，不能太平緩。第八十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三再者，這種方法所需要的力場通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速離心，離心時(shí)間也較長。大的離心力、長的離心時(shí)間都對(duì)細(xì)胞不利。大細(xì)胞比小細(xì)胞更易受高離心力的損傷，而且停留在等密度介質(zhì)中的細(xì)胞比處在移動(dòng)中的細(xì)胞受到更大的損傷。因此，這種方法適于分離細(xì)胞器，而不太適于分離和純化細(xì)胞。第九十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三二、流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)是對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。在分析或分選過程中，包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%（圖2-24）。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì)（flowcytometer）。第九十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三圖2-24用流式細(xì)胞計(jì)分選細(xì)胞第九十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三三、細(xì)胞電泳

在一定PH值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞電泳（cellelectrophoresis）。引起細(xì)胞電泳的電位值稱為ξ電位。各種細(xì)胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動(dòng)速度不同。在恒定的電場條件下，同種細(xì)胞的電泳速度相當(dāng)穩(wěn)定，因而可通過測定電泳速度來推算出細(xì)胞的ξ電位。ξ電位常因細(xì)胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)而異，因此在診斷疾病上有一定價(jià)值。此外由于不同類型的細(xì)胞在電場中的泳動(dòng)速度不同，細(xì)胞電泳尚可用來分離不同種類的細(xì)胞，例如可把淋巴樣細(xì)胞與造血細(xì)胞分開。第九十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第九章細(xì)胞培養(yǎng)與組織工程一、細(xì)胞培養(yǎng)高等生物是由多細(xì)胞構(gòu)成的整體，在整體條件下要研究單個(gè)細(xì)胞或某一群細(xì)胞在體內(nèi)（invivo）的功能活動(dòng)是十分困難的。但是如果把活細(xì)胞拿到體外（invitro）培養(yǎng)進(jìn)行觀察和研究，則要方便得多。活細(xì)胞離體后要在一定的生理?xiàng)l件下才能存活和進(jìn)行生理活動(dòng)，特別是高等動(dòng)植物細(xì)胞要求的生存條件極其嚴(yán)格，稍有不適就要死亡。所以細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（cellculture）就是選用最佳生存條件對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞的生存環(huán)境與植物細(xì)胞差別很大，因而二者的培養(yǎng)方法很不相同。第九十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)方式大致可分為兩種（圖2-25）：一種是群體培養(yǎng)（massculture），將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細(xì)胞層；另一種是克隆培養(yǎng)（clonalculture），，將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個(gè)細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過生長增殖每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克隆（clone）。第九十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三一個(gè)細(xì)胞克隆中的所有細(xì)胞均來源于同一個(gè)祖先細(xì)胞。此外，為了制取細(xì)胞產(chǎn)品而設(shè)計(jì)了轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)法，使用大容量的圓培養(yǎng)瓶，在培養(yǎng)過程中不斷地轉(zhuǎn)動(dòng)，使培養(yǎng)的細(xì)胞始終處于懸浮狀態(tài)之中而不貼壁。第九十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三圖2-25群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）第九十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三正常細(xì)胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限，只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無限生長下去。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細(xì)胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細(xì)胞。目前世界上許多實(shí)驗(yàn)室所廣泛傳用的HeLa細(xì)胞系就是1951年從一位名叫HenriettaLacks的婦女身上取下的宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)而成。此細(xì)胞系一直延用至今。第九十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三1．

原代培養(yǎng)（primaryculture）：從動(dòng)物機(jī)體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長比較緩慢，而且繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內(nèi)）停止生長，需要從更換培養(yǎng)基。將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)（Passage）。2．

細(xì)胞株（cellstrain）：從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群，能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。第九十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三3．

細(xì)胞系（cellline）：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在培養(yǎng)條件下可無限繁殖。

4．

克?。╟lone）：亦稱無性繁殖系或簡稱無性系。對(duì)細(xì)胞來說，克隆是指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。第一百頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)主要有如下幾種技術(shù)：

1．

組織培養(yǎng)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織（圖2-26），如果條件適宜，可培養(yǎng)出再生植株。用于研究植物的生長發(fā)育、分化和遺傳變異；進(jìn)行無性繁殖；制取代謝產(chǎn)物。

2．

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：在愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種培養(yǎng)技術(shù)。適合于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。第一百零一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三3．

原生質(zhì)體培養(yǎng)：脫壁后的植物細(xì)胞稱為原生質(zhì)體（protoplast），其特點(diǎn)是：①比較容易攝取外來的遺傳物質(zhì)，如DNA；②便于進(jìn)行細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞；③與完整細(xì)胞一樣具有全能性