細胞與組織化學

細胞與組織化學第一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第一章概述第一節(jié)概述第二節(jié)組織細胞化學的發(fā)展史第二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)概述

1.組織化學和細胞化學

組織化學是研究整個組織，而細胞化學是研究單個細胞。細胞和組織化學中的科學技術為細胞和組織中定位特定的化合物提供了方法。

Eg.組織切片與目標酶的底物一起孵育，這一反應的產物與存在于孵育混合物中的色素發(fā)生反應。如果樣品在孵育前固定的很好，且固定過程沒有對酶造成損傷，那么這個過程將會使組織薄片中含酶的細胞在顯微鏡下顯現。若顯微鏡具有更高的分辨率，還可以將含有該酶的亞細胞器顯現。組織化學（histochemistry)和細胞化學（cytochemistry）技術的基本原理是在組織切片上或被檢材料上，加一定試劑，使它與組織或細胞中待檢物質發(fā)生化學反應成為有色沉淀物，以用光鏡觀察，若為重金屬沉淀，可以用電鏡觀察，稱電鏡組織化學（electronmicroscopehistochemistry)。這種方法可用于檢測細胞內的酶類、糖類、脂類。核酸與某些多屬元素等。如進一步應用顯微分光光度計等測定標本中沉淀物的強度，則能較精確地進行定量研究。

2.研究組織、細胞傳統(tǒng)的化學方法第三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三糖類顯示法最常用于顯示細胞、組織內的多糖和蛋白多糖的方法是過碘酸-雪夫反應（periodicacidSchiff，PAS反應)?；驹硎牵禾潜粡娧趸瘎┻^碘酸（HIO4)氧化后，形成2-醛基；后者與Schiff試劑中的無色品紅亞硫酸復合物結合，形成紫紅色反應產物,PAS反應陽性部位即表示多糖的存在。

酶類顯示

細胞內含有多種酶,每一種酶可催化一定的化學反應。酶的顯示法是通過顯示酶的活性來表明酶的存在，而不是酶的本身。將具有酶活性的組織放人含有一定底物的溶液中孵育，底物經酶的作用形成初級反應產物，它再與某種捕捉劑相反應,形成顯微鏡下可視性沉淀,即最終反應產物。

如欲顯示細胞內酸性磷酸酶,先將切片放入含有酶底物(常用β-甘油磷酸鈉)的溶液（PH5.0)中孵育，底物經酶的作用，水解并釋放出磷酸；用捕捉劑硝酸鉛與磷酸反應，形成微細的磷酸鉛沉淀，此時，可在電鏡下檢出；如再用硫化銨處理時，磷酸鉛被置換成硫化鋁沉淀，可在光鏡下見到。

第四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三脂類顯示脂類物質包括脂肪與類脂。標本可用甲醛固定、冷凍切片、用油紅、蘇丹Ⅲ、蘇內Ⅵ、蘇丹黑B、尼羅藍等脂溶性染料染色；亦可用餓酸固定兼染色，脂類呈黑色。

核酸顯示法

顯示DNA的傳統(tǒng)方法為Feulgen反應。切片先經稀鹽酸處理后，使細胞內DNA水解，打開DNA分子中膠氧核糖核酸和嘌呤堿之間的連接鍵，使其釋放出醛基，再用Schiff試劑處理，形成紫紅色反應產物。

如用甲基綠-派若寧反應，可同時顯示細胞內的DNA和RNA甲基綠與細胞核中的DNA結合呈藍綠色，派若寧與核仁及胞質內的RNA結合呈紅色。

第五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三3．現代意義的細胞與組織化學

包括電鏡細胞化學,免疫細胞化學,顯微放射自顯影,流式細胞術,細胞染色體DNA原位雜交，胞內ca2+測量等。細胞是一個生命體，組織的構成也是由細胞組成，在研究生命規(guī)律及探索生命規(guī)律的過程中，要應用到許多技術和方法，從而產生了組織和細胞化學等學科。第六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三其發(fā)展過程為:1.早期：用放大鏡看細胞及組織的形態(tài)。（局限于對細胞及組織進行形態(tài)描述）2.后期：由于近代物理學、化學及生物等學科的發(fā)展，為人們研究細胞內結構及組織切片方法提供了豐富的知識和條件，觀察細胞的生命規(guī)律及組織切片需建立和應用的手段，到現在已經經歷了一個漫長的發(fā)展過程，并取得了長足的進步。如放射免疫技術，電鏡細胞化學，免疫細胞化學，顯微放射自顯影等技術已應運而生。第二節(jié)組織細胞化學的發(fā)展史第七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第二章組織學的研究方法

第一節(jié)概述第二節(jié)組織學制片概述第三節(jié)取材和固定第四節(jié)固定后的處理第五節(jié)染色及染色方法第八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)概述

組織學（histofogy）是應用顯微鏡研究機體微細結構及其相關功能的科學，是在解剖學的基礎上從宏觀到微觀發(fā)展形成的，故又被稱為顯微解剖學（microscopicanatomy）。組織學的研究內容，首先要研究組成機體的形態(tài)結構與功能單位——細胞；繼而研究在細胞及其產物所組成的基本組織（primarytissue）——上皮組織。結締組織、肌肉組織和神經組織；在此基礎上研究各器官系統(tǒng)的微細結構及其有關功能.第九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三組織學是重要的基礎課程，只有對機體微細結構的深入了解才可能透徹地闡明其功能；組織學的研究極大地促進了生理學的發(fā)展、生物化學的進步也促進了組織學的發(fā)展，例如，將生物化學及分子生物學的原理用于組織學而建立起組織化學及分子細胞學，將免疫學的原理用于組織學而建立起免疫組織化學等。從而使人們得知各種細胞與組織的化學組成、分子結構及其基本生命現象，這些知識已成為現代組織學的重要組成部分。第十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)組織學制片概述

1.組織學制片方法非切片法

直接取物體進行觀察，不用切片機，不經切片手續(xù)而制成切片的方法。包括：a.整體封藏法eg水螅雞胚蛙胚b.涂片法針對液體或半液體。Eg血液骨髓腹水c.活體標本觀察法eg蛙口腔黏膜的纖毛運動細胞吞噬d.分離法eg分離三種肌細胞神經纖維脊髓前角神經細胞e.鋪片法eg腸系膜可觀察肥大細胞彈力纖維膠元纖維等f.磨片法eg骨組織或牙齒

切片法需依靠切片機將組織切成薄片的方法。第十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三2.組織切片制作流程：殺死、取材與固定、洗滌、脫水、透明、透入、包埋、切片、貼片、染色、封藏。第十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第三節(jié)取材和固定1.取材與固定（組織切片制作的關鍵步驟）

取材：首先動物組織需從動物體中取出。方法有多種,主要是視材料的種類，實驗動物個體大小及觀察的目的而定。殺死的方法：大的個體(實驗動物)用刀，斧頭，麻醉等方法.

小的個體（實驗動物）采用大號剪刀或斷頭法等。取材注意事項：取材需速度快，取材以后，應立即進行固定。否則細胞會自溶。魚殺死后2小時再烹調比剛處理完就烹調的味道要更鮮美。這是細胞自溶導致的結果。第十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三固定

固定的目的：防止組織腐敗及自溶。將所需要的物質原位沉淀、保存，盡量使各種成分保持與原來（活著）的狀況相仿。3.沉淀下來以后，會造成組織的折光率的變化。即增加折光性，并使易染色。4.通過固定以后,使組織產生硬化現象,有利于切片的制作。2．固定的對象

構成細胞的主要物質是蛋白質,它分散在細胞內,所以固定的對象是蛋白質。第十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三作為固定劑的化學試劑必須具有能凝固或沉淀蛋白質,脂肪等成分,并具有強的滲透力.固定劑必須具備的性質:1)迅速滲入組織殺死原生質(滲透速度要快),即很快能將細胞殺死,固定不會使組織很快產生變化。2)滲透要均勻。(使組織內外盡量保持一致)3)盡量避免出現膨脹和收縮狀況。4)盡量避免使組織塊變形,卷曲。5)使細胞內蛋白質凝固,沉淀。6)增加折光性,媒染作用和染色能力。7)使組織變硬,適于切片,但又不至于使材料堅硬而松脆。8)固定以后,又能有保存組織的特性(如用福爾馬林浸泡)。3．組成固定劑的性質和條件第十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三4.固定劑的作用方式（三種）1)使蛋白質變性.蛋白質變性會成為沉淀物質,其是不可逆的.例：酒精使蛋白質變性不是與蛋白質形成化合物，而是使蛋白質脫水而使之變性。2）固定劑與蛋白質發(fā)生化合作用，改變了蛋白質的結構，產生沉淀。3）使蛋白質凍膠化，固定液與蛋白質間起了化學上的結合，改變了分子結構，不產生沉淀，是使蛋白質凝膠化，并不溶與水。第十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三5.固定劑的媒染效果

生活細胞大多不易染色，但經過固定后便易染色，這是由于固定劑與蛋白質相結合，同時也能與染料分子結合，從而使蛋白質著色。6.固定劑的穿透率。穿透率要強，迅速，才能在短時間內使組織內外都得到固定。第十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三7.取材和固定應注意事項1）固定的材料要新鮮。組織會產生自溶。夏天不超過2-4小時。材料取出后應立即固定,有些組織自溶很快。冬天不超過12小時。2）取材的部位要準確。（要清楚所需的材料位于動物體內哪個位置）3）取材工具要鋒利，動作需仔細。4）切取的組織塊必須小而薄，一般取0.3-0.5mm厚的組織塊進行固定。5）清洗。如小腸組織需清洗其內的黏液及食物殘渣，才能投入到固定劑內。6）組織塊附加標記的方法。組織塊取得較多并放在同一容器內，易發(fā)生混淆。應加標簽以區(qū)別之，并注明固定液，材料，日期等。7）固定劑的用量。固定組織，一般所采用的固定液體積為組織塊的10-15倍，容器勿過小，材料勿太多。第十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三8.常見固定劑的性質及使用-)單純固定劑A甲醛（純甲醛為一種氣體）溶于水成為甲醛水溶液或稱福爾馬林。市面上出甲醛濃度通常為37-40%。甲醛使用時，需采用新鮮的。放置時間較長的甲醛會變成多聚甲醛，為強的還原劑。其不可與氧化劑混合使用。作為固定劑的優(yōu)點：滲透力強，使組織收縮少。固定均勻，能較好的固定脂肪。神經及髓鞘，且能固定高爾基體，線粒體。缺點：不能固定白蛋白和核蛋白。B乙醇（為無色透明的液體)其可與水混合。優(yōu)點:可以沉淀白蛋白,球蛋白,核蛋白.穿透力強,滲透力較弱。缺點:不宜作低溫固定.酒精濃度超過50%可溶解組織內的脂肪.類脂體,血色素等。C醋酸（具刺激味的無色液體)固定組織通常用5%的HAC。PH2-6.防止細胞自溶。優(yōu)點:其能沉淀核蛋白,是種好的染色質固定劑.穿透速度快.固定時間較短,通常1小時即可。缺點:其不能沉淀白蛋白、球蛋白使組織膨脹,高濃度HAC會破壞線粒體和高爾基。第十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三D苦味酸(常見的一種酸)為一種強酸,黃色結晶.其在干燥空氣中激烈晃動,會發(fā)生爆炸,苦味酸的運輸以溶解在水中的飽和苦味酸,濃度為1%。作為固定液的優(yōu)點:能沉淀所有的蛋白質,穿透力強。缺點:使組織收縮。E重鉻酸鉀(橙紅色的結晶,強氧化劑,不可與還原劑(酒精)等混用.重鉻酸鉀溶液中加醋酸后,產生鉻酸,才能使蛋白質產生沉淀。優(yōu)點:穿透力較強。缺點:使組織產生一點膨脹。F.鋨酸(四養(yǎng)化鋨)為黃色的結晶,為強的氧化劑。優(yōu)點:其為脂肪及類脂體的唯一的固定劑,能將線粒體及高爾基體固定成為黑色.穿透速度慢,可保持組織柔軟。缺點:較難固定組織,毒性高,易損傷眼睛及黏膜,價格昂貴。G氯化汞:通稱升汞,劇毒,呈白色粉末狀,以針狀結晶為最純,能沉淀一切蛋白質(包括核蛋白)。優(yōu)點:其對蛋白質有較強的沉淀作用,能充分固定細胞質和細胞核。第二十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三二)混合固定液１.Bouin液苦味酸飽和水溶液甲醛冰醋酸該固定液滲透力強,使組織收縮少.固定時間12-24小時.２.Carnoy液無水乙醇氯仿冰醋酸對組織穿透速度快,多用于糖原,脫氧核糖核酸固定.３.Zenker液重鉻酸鉀升汞雙蒸水冰醋酸采用該液,須脫汞處理.４.Helly液重鉻酸鉀升汞雙蒸水甲醛第二十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第四節(jié)固定后的處理

1.洗滌洗滌的目的

組織在固定后一定要把滲入組織里面的固定液洗去，然后進行下一個過程，為防止組織中留有較多的固定劑影響脫水劑，甚至可在組織中發(fā)生沉淀或結晶而影響觀察，特別是對陳舊性標本更應注意流水沖洗，盡可能減少組織中的酸性程度和甲醛色素。對于混合性固定液，更應及時洗滌，有利于脫水，切片和染色。第二十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三洗滌的方法1．固定劑以水配置者用流水沖洗，可使組織中固定液隨時溢出和隨時洗去。大的動物組織沖洗時間為24小時左右，小動物組織沖洗時間為2-10小時。沖洗的時間基本根據固定的時間而定,新鮮的標本固定時間短,需及時脫水者,沖洗時間短.固定時間短。2固定劑含乙醇者一般不要求沖洗，如需沖洗必須采用與固定劑溶度相近的乙醇沖洗。3特殊固定液洗滌法

1）重鉻酸鉀流水沖洗12-24小時，或用亞硫酸，或用1%含氯水溶液進行洗滌。

2）鋨酸流水沖洗12-24小時，務必沖干凈。

3）苦味酸用50%或70%乙醇浸泡。盡量洗去黃色。

4）氯化汞用0.5%碘酒溶液反復加入到70%乙醇中，直至黃色不再褪去為止.再用硫代硫酸鈉或70%乙醇洗去碘。第二十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三2.常用脫水劑

乙醇

為常用的脫水劑。脫水能力強，并能使組織硬化。一般的脫水順序是70%、80%、90%、95%I、95%II、無水乙醇I、無水乙醇II、無水乙醇III。應注意的是脫水必須在有蓋的瓶子內進行。

丙酮

沸點為56℃，脫水作用比乙醇強，但對組織塊的收縮較大。脫水時間通常為1-3小時。

正丁醇

為無色液體，沸點100-118℃，微溶于水。一般使用方法為：組織塊經固定及沖洗后先入50%-70%-80%乙醇中脫水，然后轉入正丁醇12-24小時浸蠟。

叔丁醇

是異丁醇的一種，無毒，熔點為25℃。電鏡上常用的中間脫水劑。第二十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三3.透明透明的目的在制片過程中有兩次透明，第一次是脫水以后的透明；第二次透明是染色后的切片透明。組織塊透明的目的是便于浸蠟包埋，切片透明目的是有利于光線的透過，便于顯微鏡的觀察。透明劑的種類

1二甲苯

2甲苯

3苯

4香柏油第二十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三4.浸蠟與包埋5.包埋6.切片7.貼片8.染色第二十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第五節(jié)染色及染色方法

1.天然染料

蘇木精

本身不作為染料，其氧化產物蘇木紅才作為染料。氧化的方式：

1）

自然氧化作用

2）

化學氧化作用

卡紅靛蘭地衣紅巴西木素第二十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三2.人工合成染料

生色團與助色團酸性、堿性與中性染料

1)酸性染料（陰離子染料）生色團位于其分子的陰離子處。2)堿性染料（陽離子染料）生色團位于其分子的陽離子處。

第二十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三3.異染現象

染料離子以某種方式使它對所吸收的波長有所改變，因而觀察到被染的組織顯示與該染料本身顏色不一樣，此現象為異染現象。

4.熒光染料

是指需要經過波長很短（低于400nm）的紫外線照射激發(fā)以后而發(fā)出熒光的一類特殊染料。第二十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第三章光鏡標本制作

組織學的研究方法很多，并隨著科學技術的發(fā)展，又不斷創(chuàng)建新技術，在應用中要根據研究的目的和內容，選用相應的方法才能獲得預期的效果。這里僅就最常用、最基本的一些方法做簡要介紹。第一節(jié)涂片、鋪片、磨片標本的制備第二節(jié)切片標本的制備第三十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)涂片、鋪片、磨片標本的制備

1.涂片標本的制備涂片（smear）法是常用的一種方法，如血液等可直接涂于載玻片上制成涂片標本，干燥后進行固定、染色及封固。2.鋪片標本的制備（stretchedpreparation）用于疏松結締組織、神經等柔軟組織或腸系膜等薄層組織，可將其鋪于載玻片上，撕開、展平制成鋪片標本，待干燥后進行固定染色。

第三十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三3.磨片標本的制備（groundsection）用于堅硬組織的標本制作，如骨和牙等堅硬組織除用酸（如稀硝酸）脫鈣后再按常規(guī)制成切片標本外，也可直接將其磨成薄的磨片標本進行觀察。第三十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)切片標本的制備

觀察機體各部的微細結構時，首先要制成薄片，就是切片法，其中以石蠟切片（Paraffinsection）最為常見。第三十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三其制備程序大致如下:①取材與固定：取材要盡量新鮮動物材料。取得新鮮材料后，切成適當的小塊1.0立方厘米大?。┝⒓赐度牍潭▌╢ixative）中進行固定，使組織中蛋白質迅速凝固，防止組織自溶或腐敗，以保持生活狀態(tài)下的結構。常用的固定劑有甲醛、酒精、醋酸、苦味酸、餓酸等。②脫水（dehydtation）、透明（clearing）與包埋（embedding）:把固定好的材料用乙醇將組織內的水分脫掉，經二甲苯透明后，再浸入已融化的石蠟中進行浸透、包埋。③切片（section）與染色（staining）：用切片機（microtome）切成5～10μm的薄片，貼于載玻片上，脫蠟后進行染色，最常用的染色法是蘇木精（hematoxylin,haematoxylin)和伊紅（eosin）染色簡稱HE染色。配制后的蘇木精染液呈堿性，可使細胞核內的染色質及細胞質內的核糖體等染成藍紫色，稱嗜堿性（basophilia)；伊紅是酸性染料，可使多數細胞的細胞質染成粉紅色，稱嗜酸性（acidophilia）；耐堿性和酸性染液親合力都不強的，稱為中性（neutroPhilia）；④封固（mounting）：切片經脫水、透明后，于切片上滴加中性樹膠和蓋片進行封固后，貼標簽備用。

第三十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三除HE染色外，還有多種染色方法。有的能特異性的顯示細胞內某些結構，如使用雷鎖辛品紅（resorcin-fuchsin)染液顯示組織內的彈性纖維；有的細胞經重鉻酸鹽處理后，呈棕褐色，稱嗜鉻性（chromaffinity）；有的組織成分經硝酸銀處理時，可使硝酸銀還原，形成銀微粒附著在組織中呈棕黑色，該特性稱為親銀性（argentaffin）；有的組織結構成分，本身不能使硝酸銀還原，需加還原劑方能使硝酸銀還原，形成棕褐色很微粒附著在組織結構上，這種性質稱為嗜銀性（argyrophilia）；如肥大細胞中的顆粒經甲苯胺藍（tofuidineblue）等堿性染料染色后,呈紫紅色，這種現象稱異染性(metachromasia），其原理可能是染料在溶液中以單體存在時呈藍色，當它與顆粒中具有大量陰離子的多糖成分耦合后，聚合成多聚體而呈紫紅色。

第三十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三除石蠟切片外，在制作較大結構（如眼球、睪丸等）的切片時，常用火棉膠包埋法；骨和牙等堅硬的組織，可用弱酸（稀硝酸）脫鈣后，用石蠟或火棉膠切片（celloidinsection）法制成切片標本；還有，為了較好地保存細胞內的酶活性或盡快制成切片標本的需要，可選用冷凍切片（frozensection），它是將組織先在低溫下快速凍結，經直接切片后進行染色，或將組織塊置入液氮（-196℃）內快速冷凍，用恒冷箱切片（cryostatsection）后進行染色。第三十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三

第四章光學顯微技術第一節(jié)光鏡技術第二節(jié)電子顯微鏡技術

第三十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)光鏡技術幾種特殊顯微鏡術:相差顯微鏡干涉微分相差顯微鏡熒光顯微鏡暗視野顯微鏡共焦激光掃描顯微鏡第三十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三相差顯微鏡是用于觀察生活細胞或未經染色細胞的形態(tài)結構。生活細胞無色透明，細胞內各種結構間的反差很小，在一般光學顯微鏡下難以觀察到細胞的輪廓及內部結構，必須使用相差顯微鏡。相差顯微鏡的結構特點是：①裝有不同大小環(huán)狀光闌的聚光器。②物鏡內裝有位相板。③中心望遠鏡裝置。相差顯微鏡的基本原理是通過上述裝置。把透過標本的可見光的相位差變成振幅差，從而提高了標本內各種結構之間的對比度，使標本中的結構清晰可辨。

第三十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三若觀察生長在培養(yǎng)瓶中的生活細胞，則需應用倒置相差顯微鏡（invertedphasecon-trastmicrosope）。它與相差顯微鏡基本相同，它的特點是物鏡安裝在載物臺的下方，光源及長焦距聚光器安裝在載物臺的上方；可以對體外培養(yǎng)細胞進行長時間觀察、拍照、攝電影及錄像等以記錄生活細胞的行為。

第四十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三干涉微分相差顯微鏡基本原理與相差顯微鏡非常相似，但它有一裝有分光器的聚光器，利用分光器將光束分為兩組，一組光束通過被檢物，另一束則通過周圍介質，旋轉檢偏器，光的干涉形成光程差，可隨旋轉，兩光束形成不同的角度，于是被檢物呈現出不同顏色，致使生活細胞如同染上顏色一樣，故又稱為光染色。它與相差顯微鏡相比，除有鮮艷的顏色外，在細胞周圍不出現明亮的暈環(huán)。

第四十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三熒光顯微鏡

是用以觀察細胞及組織內熒光物質的分布。它是裝有、能產生紫外線（短波長）的光源及系列濾片裝置的顯微鏡。由于紫外線的照射，標本中的熒光物質吸收光能后，呈現出不同顏色的熒光，這是自發(fā)熒光，如維生素A呈綠色熒光、心肌細胞內脂褐素呈棕黃色～金黃色熒光。但是,細胞內的某些成分只有與熒光素結合后，在紫外線的激發(fā)下，始可呈現一定顏色的熒光；如應吖啶橙（熒光素）處理細胞后，細胞核內的DNA呈綠～黃綠色熒光，細胞質及核仁內的RNA呈桔黃～桔紅色熒光。利用熒光染色法及熒光顯微鏡可以觀察組織、細胞的結構、細胞內某些成分含量的變化，并探討細胞的功能狀態(tài)?；蛴脽晒馑貥擞浢庖咔虻鞍?，進行免疫熒光細胞化學研究。第四十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三暗視野顯微鏡

特點是該顯微鏡具有暗視野聚光器，使光線不直接進人物鏡，故呈暗視野。該顯微鏡適用于觀察細胞內微小顆粒，例如線粒體、細菌運動等。人眼的分辨力為200um,普通光鏡為0.2um，而暗視野顯微鏡的分辨力為其50倍，為004um.第四十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三共焦激光掃描顯微鏡

是80年代初研制成功的一種高光敏度、高分辨率的新型儀器。它的主要特點是：①以激光作為光源。②采用共焦成像系統(tǒng)．③掃描、顯示及記錄系統(tǒng)。激光具有發(fā)散角小、方向性好的優(yōu)點，光束通過聚焦后落在樣品（如細胞等）的不同深度；在不同方向、不同深度的平面上進行聚焦掃描，從而得到一系列不同層次的清晰圖像。平面間隔最小約600～800nm；利用微機圖像合成系統(tǒng)可重建細胞的三維圖像，可對細胞進行體視學的定量分析研究；CLSM可以更精確地檢測、識別，組織或細胞內的微細結構及其變化。由此，CLSM又有細胞CT之稱。第四十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)電子顯微鏡技術目前，電子顯微鏡技術（electronmicroscopy)已成為研究機體微細結構的重要手段。常用的有透射電鏡（transmissionelectronmicroscope，TEM）和掃描電子顯微鏡（scanningelectronmicroscope,SEM）。與光鏡相比電鏡用電子束代替了可見光，用電磁透鏡代替了光學透鏡并使用熒光屏將肉眼不可見電子束成像。

第四十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三成像原理

透射電鏡技術掃描電鏡術冷凍蝕刻復型術冷凍割斷術第四十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三透射電鏡技術透射電鏡是以電子束透過樣品經過聚焦與放大后所產生的物像，投射到熒光屏上或照相底片上進行觀察。透射電鏡的分辨率為0.1～0.2nm，放大倍數為幾萬～幾十萬倍。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，必須制備更薄的超薄切片（通常為50～100nm）。其制備過程與石蠟切片相似，但要求極嚴格。要在機體死亡后的數分鐘釣取材，組織塊要小(1立方毫米以內），常用戊二醛和餓酸進行雙重固定樹脂包埋,用特制的超薄切片機（ultramicrotome）切成超薄切片，再經醋酸鈾和檸檬酸鉛等進行電子染色。第四十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三電子束投射到樣品時，可隨組織構成成分的密度不同而發(fā)生相應的電子發(fā)射，如電子束投射到質量大的結構時，電子被散射的多，因此投射到熒光屏上的電子少而呈暗像，電子照片上則呈黑色。稱電子密度高（electrondense）。反之，則稱為電子密度低（electronlucent）。

第四十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三掃描電鏡術

掃描電鏡是用極細的電子束在樣品表面掃描，將產生的二次電子用特制的探測器收集，形成電信號運送到顯像管，在熒光屏上顯示物體。（細胞、組織）表面的立體構像，可攝制成照片。

掃描電鏡樣品用戊二醛和餓酸等固定，經脫水和臨界點干燥后,再于樣品表面噴鍍薄層金膜，以增加二波電子數。掃描電鏡能觀察較大的組織表面結構，由于它的景深長，1mm左右的凹凸不平面能清所成像，故放樣品圖像富有立體感。第四十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三冷凍蝕刻復型術

冷凍蝕刻復型（freezeetchreplica）是電鏡樣品的一種制備技術，以顯示細胞、組織微細結構的立體構像。其樣品制備步驟如下：①冷凍：先把組織浸入含有20％～30％的甘油生理鹽水的冷凍保護劑中，以防止冰晶形成和提高冷凍速度，然后把組織放入液氮（-196℃)內快速凍結；②斷裂在低溫真空內，把凍結的組織用鋼刀劈開，斷裂面常為組織、細胞的薄弱部位，如膜的雙層類脂質分子的疏水極之間余下部分的表面要觀察的部位冷凍蝕刻③蝕刻：在真空內將溫度回升到-100℃，使斷裂面的冰

升華，形成凹凸不平的形態(tài)；④復型:

在斷裂面以45°角噴鍍一層鉑膜，以增加圖像的反差和立體感，再噴鍍一層碳膜以加固鉑膜。然后用次氯酸鈉等腐蝕液除去組織，撈取復型膜在透射電鏡下觀察。

第五十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三冷凍蝕刻復型技術是研究細胞膜相結構的重要手段。細胞膜的雙層類脂質層被劈分開后，其外層的內表面稱胞質外面或E面（extracellularface，E-face）；其內層的外表面稱胞質面或P面（plasllllcface，P-face）；在P面?？梢娫S多直徑6～9nm的膜內粒子，而E面則較少。一般認為腹內粒子是細胞膜和細胞內膜相結構中的鑲嵌蛋白質粒子的圖像，膜內粒子的數量與分布隨膜的功能狀態(tài)而變化。因此，可應用冷凍蝕刻復型求研究膜結構與功能的關系。

第五十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三冷凍割斷術（freezecracking)

將固定組織經過處理后。置于特制的冷凍臺上，浸于二甲基亞砜中，低溫下將組織割斷，斷面噴鍍合金，在掃描電鏡下觀察組織結構斷面的立體圖像。第五十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三

第五章一般組織細胞化學

現代細胞生物學發(fā)展是靠形態(tài)觀察結合生物化學和分子生物學研究來推動的，沒有這些相關學科的發(fā)展也就沒有現代細胞生物學。組織化學或細胞化學染色（histochemicalorcytochemicalstaining）是利用染色劑可同細胞的某種成分發(fā)生反應而著色的原理，對某種成分進行定性或定位研究的技術。利用這種方法對細胞的各種成分幾乎都能顯示，包括有無機物、醛、蛋白質、糖類、脂類、核酸、酶等。第五十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三1.固定

目的是將細胞與組織的結構和化學物質雙重地保存下來，固定細胞與組織的方法有：物理固定：如血膜空氣快速干燥、冷凍干燥或直接冷凍切片?；瘜W固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑均能對組織細胞結構和其中的某些化學物質加以固定保存。不同化學試劑所保存的化學成分、對酶活性的影響、保存結構的細膩度均不相同。因此，要根據實驗要求和組化反應，選擇最佳的固定方法和固定劑。如顯示多糖常用乙醇固定，而顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。第五十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三2.顯示方法

金屬沉淀法：利用金屬化合物在反應過程中生成有色沉淀，借以辨認所檢查的物質或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應產物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。偶氮偶聯法：酚類化合物與偶氮染料結合后可以形成耐曬染料。Schiff反應：細胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。這種反應通常用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應）。聯苯胺反應：過氧化物酶分解H202。產生新生氧，后者再將無色的聯苯胺氧化成聯苯胺藍，進而變成棕色化合物。普魯士藍反應：三價鐵與酸性亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍。Formazane反應：顯示脫氫酶。“Nadi”反應：顯示細胞色素氧化酶。脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。茚三酮反應：顯示蛋白質。第五十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第六章免疫組織細胞化學

免疫細胞與組織化學（immunocytochemistry）是根據免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結合，對抗原進行定位測定的技術?？乖饕獮榇蠓肿踊蚺c大分子相結合的小分子；抗體則是由漿細胞針對特定的抗原分泌的γ球蛋白。如果將抗體結合上標記物，再與組織中的抗原發(fā)生反應，即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組織中的部位

。第五十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)

抗體的分類及其特性第二節(jié)免疫組織化學的基本原理

第三節(jié)

抗原抗體的制備第五十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)

抗體的分類及其特性

1.

抗體的分類

單克隆抗體多克隆抗體基因工程抗體第五十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三2.抗體的特性

親和力指抗原決定簇和同源抗體結合位點間的反應力，即分子間吸引與排斥力的總和?？贵w與抗原結合的專一性和交叉性

1）抗原-抗體反應的專一性：指針對抗原決定簇的抗體不能與第二種抗原決定蔟互補，即一種抗體只能與一種抗原決定蔟反應。2）當抗原A的某些抗原決定蔟與第二種抗原B中的某些抗原決定蔟相同時，一部分抗體A會與抗原B進行反應?？贵w效價

指抗體在保持其最佳特異性染色，并且具備最小背景條件下的最高稀釋倍數。抗體的穩(wěn)定性其穩(wěn)定性受鹽濃度及pH等因素的影響。第五十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)免疫組織化學的基本原理

免疫組織化學是免疫學與組織化學相結合的一個分支學科、以免疫學的抗原-抗體反應為理論基礎。一其全過程包括：

A抗體的制備：

1）抗原的提取和純化。2）免疫動物或細胞融合（單克隆抗體）。3）抗體效價檢測和提取。4）標記抗體。

B抗原的檢測：1）細胞和組織切片的制備。2）免疫組織化學反應和顯色。

C觀察和記錄結果。第六十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三二基本理論包括：1.抗原-抗體反應2.免疫標記化學反應3.呈色化學反應第六十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第三節(jié)抗原與抗體的制備1.抗原

凡進入機體后能誘發(fā)機體產生一系列免疫反應,包括產生抗體和形成致敏的免疫細胞,并能與抗體或致敏細胞產生特異性反應的物質稱為抗原.2.抗體是指機體在抗原的刺激下所產生的對抗抗原的特異性球蛋白,也稱免疫球蛋白.按化學結構的特點可分為IgGIgDIgMIgAIgE五類.一抗原的提取

(一)材料的選擇及預處理

(二)細胞的粉碎

1.物理法

a高速組織搗碎機b玻璃勻漿c超聲波處理法d反復凍融法

e冷熱交替法

2.化學和生物化學法a自溶法b溶菌酶處理法第六十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三(三)抗原的提取1蛋白質和酶的提取2核酸的提取3活性多肽及遞質的提取(四)抗原的分離與純化1.蛋白質分離純化的一些方法1）鹽析法2）有機溶劑沉淀法3）等電點沉淀法4）吸附法（五）抗原的濃縮1.蒸發(fā)法2.冰凍法3吸收法二、免疫抗原的制備一）載體二）偶聯劑三）制備過程第六十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三抗體的制備一、抗血清的制備一）用于免疫的動物二）免疫途徑三）佐劑四）免疫方法五）抗血清的采集與保存六）抗血清質量的評價

1.效價指血清中所含抗體的濃度或含量。

2.特異性測定

3.親和力

第六十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三二、單克隆抗體的制備

（一）動物的選擇與免疫

1.動物的選擇

2免疫方案

1）可溶性抗原免疫抗原性較弱，需加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。

初次免疫（3周后）第二次免疫（3周后）第三次免疫（2-3周后）加強免疫（3天后）取脾融合第六十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三

2）顆粒原免疫性強，不加佐劑。

初次免疫（2-3周后）第二次免疫（3周后）加強免疫（融合前三天）取脾融合(二)細胞融合1.細胞融合前的準備

(1)骨髓瘤細胞的選擇

(2)飼養(yǎng)細胞2.細胞融合的步驟

(1)制備飼養(yǎng)層細胞

(2)制備免疫脾細胞

(3)制備骨髓瘤細胞

(4)融合第六十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三

（三）選擇雜交瘤細胞及抗體檢測（四）雜交瘤的克隆化（五）雜交瘤細胞的凍存與復舒（六）單克隆抗體的大量生產（七）單克隆抗體的鑒定第六十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第四節(jié)免疫組織化學技術的分類一、根據標記物是否與特異性第一抗體結合分類1.直接法

將標記物與第一抗體結合后，直接加到細胞或組織上，在適當條件下，抗體與抗原反應。

2.間接法

與（待檢物）抗原特異性結合的第一抗體未被標記，而第二抗體以熒光素、酶或膠體金等標記。第六十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三常用的標記物有熒光素和酶。熒光素標記的稱為免疫熒光法（immunofluorescenttechnique）常用的螢光素有異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate）、羅丹明（rhodamine）等。酶標記的稱為酶標免疫法（enzyme-labeledantibodymethod），常用的酶有辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase），酶與底物發(fā)生反應后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。抗體與抗原的結合方法可分為直接法和間接法兩種，直接法是將帶有標記的抗體與抗原反應，顯示出抗原存在的部位。而間接法則是在抗體抗原初級反應的基礎上，再用帶標記的次級抗體同初級抗體反應，從而使初級反應得到放大，顯示增強。第六十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三二、根據標記物或呈色物的不同分類(一)免疫熒光法(二)免疫酶組織化學法第七十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三免疫酶組織化學法是抗原抗體的特異性與酶的高效催化作用相結合的一種免疫標記法。通過用酶標記抗原或抗體的示蹤，對呈色反應后的有色化合物進行分光光密度的測定，可對免疫陽性產物做半定量的分析。此方法被廣泛應用于醫(yī)學和生物學的各個領域。其研究方法及分類如下：

1．常用的標記酶1)辣根過氧化物酶（HRP）2)堿性磷酸酶3)葡萄糖氧化酶第七十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三2．非標記抗體免疫酶法

將所用抗體均不做標記，利用二抗作為橋，將一抗和終抗體連接起來，其中終抗體為抗酶抗體，來自與一抗相同的動物種屬，為將酶免疫動物后得到。目前最常用是未標記酶法是將橋抗體與一抗和標記的檢測試劑復合物連接起來，后者包括氧化物酶-抗過氧化物酶復合物、堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶復合物以及抗生物素蛋白-生物素-氧化物酶復合物。（1）PAP法(2)雙橋PAP法(3)APAAP法第七十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三3．親和免疫組織化學技術（1）抗生物素蛋白-生物素技術

1）橋連抗生物素蛋白-生物素技術（BRAB）

2）抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復合法（2）葡萄球菌A蛋白法其能與某些動物IgG的Fc段非特異性結合，將SPA替代橋抗體，把酶、熒光素等標記在SPA上，標記的SPA就可直接檢測組織細胞內的IgG成分或免疫化合物。（3）凝集素法其具有與特定糖基專一結合的特性，用酶、膠體金等標記凝集素，利用其能與細胞糖基和細胞膜上的微細結構。（4）酶標鏈酶抗生素蛋白-生物素法（LSAB）（5）鏈酶抗生素蛋白-過氧化物酶法（SP）是根據鏈酶抗生素蛋白-過氧化物酶法連接系統(tǒng)設計應用于檢測組織和細胞內抗原的一種高敏方法第七十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三4．放射自顯影標記法放射自顯影術（radioautography；autoradiography）用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。其原理是將放射性同位素（如14C和3H）標記的化合物導入生物體內，經過一段時間后，將標本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，經一定時間的放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光。然后經過顯影、定影處理顯示還原的黑色銀顆粒，即可得知標本中標記物的準確位置和數量，放射自顯影的切片還可再用染料染色，這樣便可在顯微鏡下對標記上放射性的化合物進行定位或相對定量測定。第七十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三這種技術與電鏡樣品處理，則為電鏡放射自顯影。由于有機大分子均含有碳、氫原子，故實驗室一般常選用14C和3H標記。14C和3H均為弱放射性同位素，半衰期長，14C為5730年，3H為12.5年。一般常用3H胸腺嘧啶脫氧核苷（3H-TDR）來顯示DNA，用3H尿嘧啶核苷（3H-UDR）顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質，研究多糖則用3H甘露糖、3H巖藻糖等。第七十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三5．膠體金法用膠體金顆粒作為示蹤物或探針標記抗體，利用抗原-抗體的特異性反應，從而對細胞內外的或細胞表面的多糖、糖蛋白、多肽、激素和核酸等生物大分子予以精確定位。第七十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第七章原位雜交組織化學分子雜交技術（molecularhybridization）是在研究DNA分子復性變化基礎上發(fā)展起來的一種技術。其原理是，具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當條件下通過氫鍵結合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補關系。第七十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三（一）、原位雜交（insituhybridization）用來檢測染色體上的特殊DNA序列。最初是使用帶放射性的DNA探針，通過放射自顯影來顯示位置。后來又發(fā)明了免疫探針法，將探針核苷酸的側鏈加以改造，探針雜交后，其側鏈可被帶有熒光標記的抗體所識別，從而顯示出位置（圖2-21）。圖2-21人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片(來自)第七十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三（二）、Southern雜交是體外分析特異DNA序列的方法，操作時先用限制性內切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經凝膠電泳分離后，轉移到醋酸纖維薄膜上，再用標記的探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認出與探針互補的特殊核苷序列。第七十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)探針制備一、

探針的來源

1.克隆分離

2.建立基因文庫

3.人工合成

4.反向合成

二、探針標記

1.同位素標記(1)缺口平移(或缺口翻譯)標記法(2)末端標記法,適用于寡核苷酸探針的標記(3)隨機引物法第八十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三2非同位素標記法（１）半抗原標記法最常用的是將地高辛連在NTP或dUTP上，或隨機啟動延伸法標記RNA或DNA探針，雜交后用羊地高辛抗體的Fab段與堿性磷酸酶的復合物檢測，用NBT及X－磷酸鹽顯色．（２）直接標記法將特定的酶或蛋白質直接標記RNA或DNA分子上，然后以酶促顯色反應或特異性蛋白質染色做檢測系統(tǒng)．（３）生物素標記法將生物素用酶學方法或化學方法連接在核酸探針上，分子雜交后利用抗生物素對生物素具有高度親和力的特性，用標記的生物素蛋白或鏈酶抗生素蛋白進行檢測．

第八十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)原位雜交的組織標本制作１冰凍切片新鮮組織取材后迅速驟冷，制成冰凍切片．２石蠟切片一般用Bouin固定液固定組織．３載玻片處理第八十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第三節(jié)雜交組織化學反應１雜交前切片的預處理２雜交是核酸探針與組織或細胞內靶核酸以氫鍵方式通過互補堿基結合過程，兩個單鏈RNA分子之間，單鏈DNA和RNA之間或兩個單鏈RNA之間均可形成雜交體。３雜交后處理與探針顯示第八十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第八章細胞分離技術

（一）、差速離心（differentialcentrifugation）

在密度均一的介質中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器（圖2-22）。在差速離心中細胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內質網與高爾基體、最后為核蛋白體。由于各種細胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復2～3次效果會好一些。差速離心只用于分離大小懸殊的細胞，更多用于分離細胞器。通過差速離心可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。

第八十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三圖2-22速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀圖2-22速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀

第八十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三（二）、密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）用一定的介質在離心管內形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種（圖2-23）。密度梯度離心常用的介質為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。分離活細胞的介質要求：1）能產生密度梯度，且密度高時，粘度不高；2）PH中性或易調為中性；3）濃度大時滲透壓不大；4）對細胞無毒。第八十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三圖2-23

A等速度沉降，B等密度沉降第八十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三1、速度沉降

速度沉降（velocitysedimentation）主要用于分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。這種降方法所采用的介質密度較低，介質的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度。

生物顆粒（細胞或細器）在十分平緩的密度梯度介質中按各自的沉降系數以不同的速度沉降而達到分離。第八十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三2、等密度沉降

等密度沉降（isopycnicsedimentation）適用于分離密度不等的顆粒。細胞或細胞器在連續(xù)梯度的介質中經足夠大離心力和是夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的細胞或細胞器分離。等密度沉降通常在較高密度的介質中進行。介質的最高密度應大于被分離組分的最大密度，而且介質的梯度要求較高的陡度，不能太平緩。第八十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三再者，這種方法所需要的力場通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速離心，離心時間也較長。大的離心力、長的離心時間都對細胞不利。大細胞比小細胞更易受高離心力的損傷，而且停留在等密度介質中的細胞比處在移動中的細胞受到更大的損傷。因此，這種方法適于分離細胞器，而不太適于分離和純化細胞。第九十頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三二、流式細胞術

流式細胞術是對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術。在分析或分選過程中，包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經探測器檢測，轉換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結果，并可根據這些性質分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%（圖2-24）。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計（flowcytometer）。第九十一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三圖2-24用流式細胞計分選細胞第九十二頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三三、細胞電泳

在一定PH值下細胞表面帶有凈的正或負電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動，這種現象稱為細胞電泳（cellelectrophoresis）。引起細胞電泳的電位值稱為ξ電位。各種細胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同。在恒定的電場條件下，同種細胞的電泳速度相當穩(wěn)定，因而可通過測定電泳速度來推算出細胞的ξ電位。ξ電位常因細胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)而異，因此在診斷疾病上有一定價值。此外由于不同類型的細胞在電場中的泳動速度不同，細胞電泳尚可用來分離不同種類的細胞，例如可把淋巴樣細胞與造血細胞分開。第九十三頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三第九章細胞培養(yǎng)與組織工程一、細胞培養(yǎng)高等生物是由多細胞構成的整體，在整體條件下要研究單個細胞或某一群細胞在體內（invivo）的功能活動是十分困難的。但是如果把活細胞拿到體外（invitro）培養(yǎng)進行觀察和研究，則要方便得多。活細胞離體后要在一定的生理條件下才能存活和進行生理活動，特別是高等動植物細胞要求的生存條件極其嚴格，稍有不適就要死亡。所以細胞培養(yǎng)技術（cellculture）就是選用最佳生存條件對活細胞進行培養(yǎng)和研究的技術。動物細胞的生存環(huán)境與植物細胞差別很大，因而二者的培養(yǎng)方法很不相同。第九十四頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三（一）動物細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)方式大致可分為兩種（圖2-25）：一種是群體培養(yǎng)（massculture），將含有一定數量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細胞層；另一種是克隆培養(yǎng)（clonalculture），，將高度稀釋的游離細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個細胞貼壁后，彼此距離較遠，經過生長增殖每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克?。╟lone）。第九十五頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三一個細胞克隆中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞。此外，為了制取細胞產品而設計了轉鼓培養(yǎng)法，使用大容量的圓培養(yǎng)瓶，在培養(yǎng)過程中不斷地轉動，使培養(yǎng)的細胞始終處于懸浮狀態(tài)之中而不貼壁。第九十六頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三圖2-25群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）第九十七頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三正常細胞培養(yǎng)的世代數有限，只有癌細胞和發(fā)生轉化的細胞才能無限生長下去。所謂轉化即是指正常細胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細胞。目前世界上許多實驗室所廣泛傳用的HeLa細胞系就是1951年從一位名叫HenriettaLacks的婦女身上取下的宮頸癌細胞培養(yǎng)而成。此細胞系一直延用至今。第九十八頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三1．

原代培養(yǎng)（primaryculture）：從動物機體取出的進行培養(yǎng)的細胞群。原代培養(yǎng)的細胞生長比較緩慢，而且繁殖一定的代數后（一般10代以內）停止生長，需要從更換培養(yǎng)基。將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉移到另外一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)（Passage）。2．

細胞株（cellstrain）：從原代培養(yǎng)細胞群中篩選出的具有特定性質或標志的細胞群，能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。第九十九頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三3．

細胞系（cellline）：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉化的細胞，在培養(yǎng)條件下可無限繁殖。

4．

克隆（clone）：亦稱無性繁殖系或簡稱無性系。對細胞來說，克隆是指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產生的遺傳性狀一致的細胞群。第一百頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三（二）植物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)主要有如下幾種技術：

1．

組織培養(yǎng)：誘發(fā)產生愈傷組織（圖2-26），如果條件適宜，可培養(yǎng)出再生植株。用于研究植物的生長發(fā)育、分化和遺傳變異；進行無性繁殖；制取代謝產物。

2．

懸浮細胞培養(yǎng)：在愈傷組織培養(yǎng)技術基礎上發(fā)展起來的一種培養(yǎng)技術。適合于進行產業(yè)化大規(guī)模細胞培養(yǎng)，制取植物代謝產物。第一百零一頁，共一百一十一頁，編輯于2023年，星期三3．

原生質體培養(yǎng)：脫壁后的植物細胞稱為原生質體（protoplast），其特點是：①比較容易攝取外來的遺傳物質，如DNA；②便于進行細胞融合，形成雜交細胞；③與完整細胞一樣具有全能性