重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝與質(zhì)量控制要點(diǎn)

重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝與質(zhì)量控制要點(diǎn)第一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四培訓(xùn)目的及范圍培訓(xùn)目的1、熟悉生物制品一般生產(chǎn)工藝及質(zhì)量控制要點(diǎn)。2、了解檢驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置緣由及控制標(biāo)準(zhǔn)。培訓(xùn)范圍1、QC部2、QA部2第二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)1、蛋白質(zhì)大?。ㄒ话?-10nm）2、蛋白質(zhì)形狀3、蛋白質(zhì)核電性4、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（一般4.0-10.0）5、蛋白質(zhì)疏水性6、蛋白質(zhì)溶解度7、蛋白質(zhì)密度（一般1.3-1.4g/cm3）8、蛋白質(zhì)與配體結(jié)合能力（酶，抗體）9、蛋白質(zhì)與金屬螯合能力（CU2+、ZN2+、CA2+、NI2+）10、蛋白質(zhì)其它特殊性質(zhì)(抗熱性、抗蛋白酶)基本知識3第三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四第一部分：重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝第二部分：重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)第三部分：

注射用重組人胸腺肽α1與注射用重組白介素-2（125SER）生產(chǎn)工藝第四部分：注射用重組人胸腺肽α1與注射用重組人白介素-2(125SER)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)培訓(xùn)內(nèi)容4第四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四第一部分：重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝第一步：工程菌構(gòu)建第二步：菌體發(fā)酵與誘導(dǎo)表達(dá)第三步：目標(biāo)蛋白提取與純化第四步：配液與凍干5第五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝第一步：工程菌構(gòu)6第六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝目標(biāo)產(chǎn)物鑒定基因序列測定表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)確證特異性鑒別實(shí)驗(yàn)N末端氨基酸序列分析氨基酸組成分析C末端氨基酸序列分析激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜分析X射線晶體衍射分析7第七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝原始菌種鑒定宿主菌鑒定（顯微鏡、電鏡檢查，生化反應(yīng)，對抗生素抗性，質(zhì)粒檢查）質(zhì)粒檢查-遺傳穩(wěn)定性外源因子有：1、細(xì)菌檢查2、霉菌檢查3、支原體檢查4、噬菌體檢查8第八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝第二步：菌體發(fā)酵與誘導(dǎo)表達(dá)9第九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝第三步：目標(biāo)蛋白分離與破碎10第十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝第三步：目標(biāo)蛋白分離與破碎11第十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝第三步：目標(biāo)蛋白純化12第十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝第三步：目標(biāo)蛋白純化（反相與超濾）13第十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝蛋白純化方法分離方法蛋白質(zhì)性質(zhì)基礎(chǔ)分離方法蛋白質(zhì)性質(zhì)基礎(chǔ)沉淀法層析法硫酸銨溶解度離心交換層析電荷及分布丙酮溶解度疏水作用層析疏水性聚乙烯亞胺電荷、大小反相層析疏水性、大小等電點(diǎn)溶解度、等電點(diǎn)親和層析配體結(jié)合雙水相法溶解度外源凝集素親和層析糖基內(nèi)容與種類電泳法凝膠電泳電荷、大小、形狀金屬親和層析金屬螯合能力等點(diǎn)聚焦電泳等電點(diǎn)免疫親和層析特異抗原位點(diǎn)離心法大小、形狀、密度層析聚焦等電點(diǎn)超律法大小、形狀凝膠過濾層析大小、形狀14第十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝蛋白純化原理親和層析離子交換層析疏水層析凝膠過濾層析反相層析15第十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝帶組氨酸標(biāo)簽的親和層析組氨酸是具有雜環(huán)的氨基酸，每個(gè)組氨基酸含有一個(gè)咪唑基團(tuán)，這個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)帶有很多額外電子，對于帶正電的化學(xué)物質(zhì)有靜電引力，親和層析是利用這個(gè)原理來進(jìn)行吸附的，親和配體（也就是填料）上的陽離子（一般是鎳離子）帶正電對組氨酸有親和作用。組氨酸標(biāo)簽是原核表達(dá)載體上6-14個(gè)組氨酸的區(qū)段,這個(gè)標(biāo)簽在PH8.0時(shí)不帶電,且無免疫原性,對蛋白質(zhì)的分泌,折疊,功能基本上無影響.能高度親和鎳離子,用于蛋白質(zhì)的親和純化16第十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝第四步：配液與凍干生物制品藥用輔料按使用目的，分為：疫苗培養(yǎng)液生物制品穩(wěn)定保護(hù)劑（人血白蛋白，糖類）免疫佐劑（鋁鹽，植物油類）防腐劑(硫柳汞與苯酚)脫毒劑與滅活劑（甲醛溶液與b-丙內(nèi)酯）冷凍干燥保護(hù)劑（鹽類，糖類，醇類）17第十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝凍干過程預(yù)凍干一次升華二次升華18第十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝典型凍干曲線19第十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四第二部分：重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)原輔料、包材、菌種發(fā)酵液、原液半成品、成品20第二十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)原輔料-符合藥典和生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)等-略包材-符國家藥品包裝容器（材料）標(biāo)準(zhǔn)-略菌種-符合藥典或注冊要求發(fā)酵液-符合藥典或注冊要求原液-符合藥典或注冊要求半成品-符合藥典或注冊要求成品-符合藥典或注冊要求21第二十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)菌種：一般檢測項(xiàng)目中間體名稱質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測項(xiàng)目合格標(biāo)準(zhǔn)菌種劃種LB平板應(yīng)呈典型大腸桿菌集落形態(tài)，無其他雜菌生長染色鏡檢應(yīng)為典型的革蘭陰性桿菌對抗生素抗性應(yīng)與原始菌種相符電鏡檢查應(yīng)為典型大腸桿菌形態(tài)，無支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染生化反應(yīng)應(yīng)符合大腸桿菌生物學(xué)性狀表達(dá)量在搖床中培養(yǎng)，應(yīng)不低于原始菌種表達(dá)量質(zhì)粒檢查質(zhì)粒酶切圖譜應(yīng)與原始重組質(zhì)粒相符目的基因核苷酸序列檢查符合規(guī)定質(zhì)粒穩(wěn)定性符合規(guī)定質(zhì)粒檢查質(zhì)粒酶切圖譜應(yīng)與原始重組質(zhì)粒相符22第二十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)發(fā)酵液：一般檢測項(xiàng)目中間體名稱現(xiàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測項(xiàng)目合格標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵菌體表達(dá)量≥25%質(zhì)粒丟失率檢查符合規(guī)定23第二十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)原液：一般檢測項(xiàng)目1生物學(xué)活性（有效項(xiàng)目）2蛋白含量（有效項(xiàng)目）3比活測定（有效項(xiàng)目）4純度測定（有效項(xiàng)目）5分子量（鑒別項(xiàng)目）6紫外吸收光譜（鑒別項(xiàng)目）7肽圖（鑒別項(xiàng)目）8等電點(diǎn)（鑒別項(xiàng)目）9N-末端氨基酸序列測定（鑒別項(xiàng)目）10外源性DNA含量（安全項(xiàng)目）11宿主菌蛋白殘留量（安全項(xiàng)目）12圓二色譜分析（鑒別項(xiàng)目）12細(xì)菌內(nèi)毒素（安全項(xiàng)目）24第二十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)原液：生物學(xué)活性檢測生物學(xué)活性測定是保證基因工程藥物產(chǎn)品有效性的重要手段。參照中國藥典標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定及注冊質(zhì)量研究資料，采用脫E受體法或MTT比色法檢出本品，專屬性強(qiáng)、方法可靠。25第二十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)原液：蛋白含量檢測在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中設(shè)定此項(xiàng)目主要用于原液比活性計(jì)算和成品規(guī)格的控制。目前實(shí)際應(yīng)用最多的是(Lowry)法，也稱之為福林一酚試劑法，其靈敏度比雙縮脲法高約100倍，比紫外吸收法高約10～2O倍，是蛋白質(zhì)量化的較可靠方法，具體操作可按照《中國藥典》2010年版三部(附錄Ⅵ第二法)的規(guī)定。參照中國藥典三部的標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定及本品質(zhì)量研究資料，此方法能夠檢出本品，專屬性強(qiáng)、方法可靠，能夠控制本品含量。如不適用此類方法則采用液相法。26第二十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)原液：比活測定檢測比活性是指單位重量蛋白的活性，反應(yīng)單位蛋白活性的高低。是活性生物制品的重要指標(biāo)和檢測依據(jù)。27第二十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)原液：純度檢測根據(jù)《人用重組DNA產(chǎn)品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》有關(guān)要求，應(yīng)用至少兩種不同原理的方法進(jìn)行純度分析，且純度均不得低于95.0％，才能判為合格。因胸腺肽a1與白介素-2（125Ser）在臨床上使用劑量在毫克級，故純度要求應(yīng)較嚴(yán)格。高效液相法——本檢測采用proteinC18反相色譜柱，可精確地測定產(chǎn)品的純度，及對空間構(gòu)相作初步分析。一般盡量采用與SDS—PAGE法原理不同的RP—HPLC或其它離子交換HPLC法進(jìn)行分析，而不采用SEC—HPLC進(jìn)行分析。電泳法——用SDS—PAGE法分析，可將不同分子量的蛋白質(zhì)分開，從而測定蛋白質(zhì)的純度，通過凝膠掃描儀掃描進(jìn)行純度分析。樣品在凝膠電泳上顯現(xiàn)出條區(qū)帶，說明樣品在該電泳條件分子量是一致的，為分析是否存在相同分子量的雜蛋白，還應(yīng)選擇另一種方法進(jìn)行純度分析。28第二十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)原液：分子量檢測分子量是蛋白質(zhì)理化性質(zhì)之一。一般采用還原型SDS法測定，蛋白質(zhì)在SDS和B-巰基乙醇存在下沸水浴5min，形成表面帶大量負(fù)電荷的桿狀分子，降低了分子形態(tài)和電荷的影響，在電泳過程中蛋白遷移率基本只與其分子量相關(guān)，目前廣泛用于蛋白分子量的測定。該法具有簡便，快速，直觀等特點(diǎn)，目前作為基因工程藥物原液檢定的常規(guī)方法。該法可將蛋白質(zhì)按分子量大小進(jìn)行分離，因此，可用于蛋白質(zhì)純度分析，同時(shí)還能對聚合體進(jìn)行分析。29第二十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)原液：紫外光譜掃描檢測這是基因工程藥物的一個(gè)重要物理常數(shù)，對于一個(gè)蛋白質(zhì)來說，它的最大吸收波長是固定的。對某一重組蛋白質(zhì)來說，其最大吸收波長是固定的；在生產(chǎn)過程中每批產(chǎn)品的紫外吸收光譜應(yīng)當(dāng)是一致的。測定時(shí)以生理鹽水為對照，在200～350nm范圍內(nèi)對待檢樣品溶液進(jìn)行掃描，每批制品紫外吸收圖譜應(yīng)與對照品一致且在280nm附近最大吸收波長應(yīng)與理論值相符。30第三十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)原液：肽圖檢測肽圖分析是DNA產(chǎn)品質(zhì)控的重要手段之一。通過肽圖分析，可從一級結(jié)構(gòu)研究重組產(chǎn)品與天然品的同質(zhì)性。重組產(chǎn)品與天然產(chǎn)品具有相同的指紋圖譜，它們具有相同的一級結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步驗(yàn)證了它們的同質(zhì)性。大多基因工程產(chǎn)品都將肽圖分析作為控制其一致性的重要常規(guī)指標(biāo)之一，而采用的方法中．又以HPLC肽圖分析最為多見。肽圖譜對每一種蛋白質(zhì)來說是特征和專一的。因此可用于檢查各批產(chǎn)品蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的一致性在膚圖分析中的應(yīng)用基因重組藥物的肽圖分析是評價(jià)基因重組制品和天然蛋白質(zhì)的同一性以及不同批制品間同一性的重要手段，也是證明細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性的有效手段之一。31第三十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)原液：等電點(diǎn)檢測不同蛋白質(zhì)由于某些帶電氨基酸帶負(fù)電荷的Glu，Asp和帶正電荷的Lys，Arg,His等的存在，其凈電荷各不相同，即等電點(diǎn)各不相同。均一的蛋白質(zhì)只有一個(gè)等電點(diǎn)，有時(shí)因加工修飾等影響可出現(xiàn)多個(gè)等電點(diǎn)，但應(yīng)有一定的范圍。所以等電點(diǎn)測定是控制重組產(chǎn)品生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。32第三十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)原液：N-末端氨基酸序列測定可以確證表達(dá)產(chǎn)物的編碼準(zhǔn)確性。對蛋白質(zhì)的全氨基酸序列分析，難度大，耗時(shí)長，從統(tǒng)計(jì)學(xué)觀點(diǎn)只要測定N-末端15個(gè)氨基酸便可保證其順序的正確性。故N-末端15個(gè)氨基酸序列分析可作為重組蛋白質(zhì)的重要鑒別指標(biāo)。33第三十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)原液：外源性DNA含量檢測宿主細(xì)胞DNA只作為一種細(xì)胞污染因素而不作為一種危險(xiǎn)因素。目前均采用DNA雜交實(shí)驗(yàn)，用固相斑點(diǎn)雜交法，以地高辛標(biāo)記檢測試劑盒或者用同位素標(biāo)記DNA探針進(jìn)行測定，必須提供相應(yīng)宿主細(xì)胞DNA標(biāo)準(zhǔn)品。由于設(shè)備和消耗試劑昂貴，一定程度限制了該方法的普及。由于基因工程藥物的生產(chǎn)過程中所使用的各種表達(dá)系統(tǒng)中都含有大量的DNA。因此世界各國的藥品管理機(jī)構(gòu)都對基因工程藥物中所允許的DNA殘余量嚴(yán)加限定。WHO和FDA將此限量定在100pg／劑量。參照藥典三部附錄IXB外源性DNA殘留量測定法每1次人用劑量應(yīng)不高于10ng。34第三十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)原液：宿主菌蛋白殘留量檢測如在臨床使用中需要反復(fù)多次注射的藥品，則需要做殘余菌體蛋白含量測定，所用方法以雙抗體夾心ELISA為宜，盡量不用點(diǎn)免疫。因?yàn)橛命c(diǎn)免疫測菌體蛋白含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不客觀，主要是因?yàn)闄z品和菌體蛋白標(biāo)準(zhǔn)難以在同等條件下進(jìn)行直接點(diǎn)膜，當(dāng)檢品濃度較高時(shí)，在硝酸纖維膜上形成一定厚度的樣品模塊，影響了菌體蛋白與膜的結(jié)合，導(dǎo)致測定結(jié)果偏低。不同表達(dá)體系對菌體蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)不同，如來自大腸桿菌的產(chǎn)品為不大于0．1％；來自CHO細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品為不大于0．05％。本檢品中宿主蛋白含量應(yīng)不高于總蛋白的0.1%。35第三十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)原液：圓二色譜分析對R和L兩種圓偏振光吸收程度不同的現(xiàn)象，這種吸收程度的不同與波長的關(guān)系稱圓二色譜，是測定分子不對稱結(jié)構(gòu)的光譜法。用于測定蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，核酸和多糖的立體結(jié)構(gòu)。在蛋白質(zhì)分子中，肽鏈可形成α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等特定的立體結(jié)構(gòu)。這些立體結(jié)構(gòu)都是不對稱的。36第三十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)原液：圓二色譜檢測蛋白質(zhì)的肽鍵在紫外185～240納米處有光吸收，因此它在這一波長范圍內(nèi)有圓二色性。幾種不同的蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)所表現(xiàn)的橢圓值波長的變化曲線──圓二色譜是不同的。α-螺旋的譜是雙負(fù)峰形的，β-折疊是單負(fù)峰形的，無規(guī)卷曲在波長很短的地方出單峰。蛋白質(zhì)的圓二色譜是它們所含各種立體結(jié)構(gòu)組分的圓二色譜的代數(shù)加和曲線。因此用這一波長范圍的圓二色譜可研究蛋白質(zhì)中各種立體結(jié)構(gòu)的含量。蛋白質(zhì)含酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸,它們在240～350納米處有光吸收,當(dāng)它們處于分子不對稱環(huán)境中時(shí)也表現(xiàn)出圓二色性。這一范圍的圓二色性反映出在蛋白質(zhì)分子中上述氨基酸殘基環(huán)境的性質(zhì)。37第三十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)原液：細(xì)菌內(nèi)毒素檢測細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分,當(dāng)細(xì)菌死亡或自溶后便會釋放出內(nèi)毒素.因此,細(xì)菌內(nèi)毒素廣泛存在于自然界中.當(dāng)內(nèi)毒素通過消化道進(jìn)入人體時(shí)并不產(chǎn)生危害,但內(nèi)毒素通過注射等方式進(jìn)入血液時(shí)則會引起不同的疾病.內(nèi)毒素小量入血后被肝臟細(xì)胞滅活,不造成機(jī)體損害.內(nèi)毒素大量進(jìn)入血液就會引起發(fā)熱反應(yīng)—“熱原反應(yīng)”.因此,生物制品類,注射用藥劑,化學(xué)藥品類,放射性藥物,抗生素類,疫苗類,透析液等制劑以及醫(yī)療器材類（如一次性注射器,植入性生物材料）必須經(jīng)過細(xì)菌內(nèi)毒素檢測試驗(yàn)合格后才能使用。按照藥典三部注射劑通則，需要檢測細(xì)菌內(nèi)毒素的含量，采用鱟試劑法。由于鱟試劑法簡單﹑快速﹑靈敏﹑準(zhǔn)確,目前已廣泛用于臨床,制藥工業(yè)藥品檢驗(yàn)等方面。38第三十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)半成品：一般檢測項(xiàng)目可見異物（安全項(xiàng)目）無菌檢查（安全項(xiàng)目）細(xì)菌內(nèi)毒素（安全項(xiàng)目）39第三十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)半成品：可見異物檢測“可見異物”是指目視可以觀測到的玻璃屑、金屬屑、長度或最大粒徑超過2mm的纖毛和塊狀物等外來異物?！捌渌梢姰愇铩眲t是指長度或最大粒徑在2mm以下的短纖毛及白點(diǎn)、白塊等。這些物質(zhì)進(jìn)入人體靜脈能夠堵塞血管，形成血栓。危害人體健康。按照藥典三部的注射劑通則要求，檢查可見異物，并符合規(guī)定。注射劑，滴眼劑應(yīng)在符合藥品生產(chǎn)管理規(guī)范的條件下生產(chǎn)，產(chǎn)品在出廠前應(yīng)采用適宜的方法逐一檢查并同時(shí)剔除不合格產(chǎn)品。40第四十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)半成品：無菌檢查無菌檢查法系用于確定要求無菌的生物制品，原料，輔料及要求無菌的其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。本法參照藥典三部的無菌檢查法，應(yīng)符合規(guī)定。半成品：細(xì)菌內(nèi)毒素略41第四十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)成品：一般檢測項(xiàng)目檢測項(xiàng)1、鑒別試驗(yàn)（鑒別項(xiàng)目）7、水分測定（安全項(xiàng)目）13、I誘導(dǎo)物殘留量檢查（安全項(xiàng)目）2、外觀（安全項(xiàng)目）8、活性測定（有效項(xiàng)目）14、有機(jī)溶劑殘留量檢查（安全項(xiàng)目）3、復(fù)溶時(shí)間（安全項(xiàng)目）9、含量檢查（有效項(xiàng)目）15、抗生素殘留量檢查（安全項(xiàng)目）4、可見異物（安全項(xiàng)目）10、無菌檢查（安全項(xiàng)目）16、異常毒性檢查（安全項(xiàng)目）5、裝量差異（有效項(xiàng)目11、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（安全項(xiàng)目）17、滲透壓摩爾濃度檢查（安全項(xiàng)目）6、PH值（安全項(xiàng)目）12、HBsAg檢查（安全項(xiàng)目）18、不溶性微粒檢查（安全項(xiàng)目）42第四十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)成品：鑒別實(shí)驗(yàn)主要確定供試品的抗原性，根據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)建立的方法。將供試品通過電泳分離成區(qū)帶的各抗原，然后與相應(yīng)的抗體進(jìn)行雙相免疫擴(kuò)散，當(dāng)兩者比例合適時(shí)形成可見的沉淀弧。將沉淀弧與已知標(biāo)準(zhǔn)抗原，抗體生成的沉淀弧的位置和形狀進(jìn)行比較。分析供試品中成分及其性質(zhì)。43第四十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)成品：外觀因質(zhì)量研究本制品凍干樣品為白色無雜色的疏松體，所以成品檢驗(yàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為白色或微黃色疏松體。成品：復(fù)溶時(shí)間檢查法：按標(biāo)示量加入20℃～25℃滅菌注射用水，輕松搖動，應(yīng)于15秒內(nèi)完全溶解。應(yīng)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一致。44第四十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)成品：可見異物“可見異物”是指目視可以觀測到的玻璃屑、金屬屑、長度或最大粒徑超過2mm的纖毛和塊狀物等外來異物?！捌渌梢姰愇铩眲t是指長度或最大粒徑在2mm以下的短纖毛及白點(diǎn)、白塊等。這些物質(zhì)進(jìn)入人體靜脈能夠堵塞血管，形成血栓。危害人體健康。按照藥典三部的注射劑通則要求，檢查可見異物，并符合規(guī)定。注射劑，滴眼劑應(yīng)在符合藥品生產(chǎn)管理規(guī)范的條件下生產(chǎn)，產(chǎn)品在出廠前應(yīng)采用適宜的方法逐一檢查并同時(shí)剔除不合格產(chǎn)品。45第四十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)成品：裝量差異按照藥典三部的注射劑通則要求進(jìn)行裝量差異檢查。除制劑通則中規(guī)定檢查重量差異的制劑及放射性藥品外，按上述方法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。成品：pH值根據(jù)質(zhì)量研究資料，胸腺肽a1在PH6.3-7.8條件下穩(wěn)定，規(guī)定本品酸堿度為6.3-7.8,白介素-2（125Ser）在PH6.5-7.5質(zhì)檢性質(zhì)穩(wěn)定。46第四十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)成品：水分測定水分檢測主要指對凍干制劑的要求，是重要的質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)指標(biāo)之一，在一般情況下要控制水分低一點(diǎn)，防止微生物生長，但是并非水分越低越好。通常微生物作用比生化作用更加強(qiáng)烈。目前美國藥典和歐洲藥典公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)為不超過3.0%，所用的方法有費(fèi)休氏法。成品：活性測定略成品：含量測定略成品：無菌檢查略47第四十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)成品：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查略成品：HBsAg檢查乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒的外殼蛋白，本身不具有傳染性，但它的出現(xiàn)常伴隨乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的標(biāo)志。檢查HbsAg的目的是為了控制乙肝表面抗原蛋白在制品中的含量。采用ELISA雙抗體夾心法，即酶聯(lián)免疫吸附法，包被HBsAb于瓊脂微孔與標(biāo)本中的HBsAg形成Ab-Ag復(fù)合物，再于酶標(biāo)HBs抗體結(jié)合，加入TMB底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)。48第四十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)成品：誘導(dǎo)物殘留量檢查IPTG作為大腸桿菌和哺乳動物細(xì)胞等的表達(dá)誘導(dǎo)劑，一般以1mM左右的濃度加入液體培養(yǎng)基中。在本工藝中使用了IPTG作為誘導(dǎo)劑，在培養(yǎng)液中的終濃度為0.5-1mM。發(fā)酵完畢后，經(jīng)過菌液離心分離、包含體分離、凝膠過濾、反相層析、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等多步純化，可以有效地去除IPTG殘留，故IPTG殘留量甚微。LiuHS等人的研究也表明，IPTG在一定的濃度范圍內(nèi)（≤5mM），對細(xì)胞是沒有毒性的。而5mM的IPTG濃度是生物制品IPTG殘留檢測值（極限值以下）濃度的四百萬倍。49第四十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)成品：有機(jī)溶劑殘留量檢查在原料、輔料、制劑制備過程中未能完全除去的有機(jī)溶劑。按照與ICH《殘留溶劑指導(dǎo)原則》與HGPH7-1《化學(xué)藥物殘留溶劑研究的指導(dǎo)原則》為依據(jù)制定藥典標(biāo)準(zhǔn)第一類：避免使用第二類：限制使用第三類：GMP或其它質(zhì)量要求限制使用第四類：尚無足夠毒理資料的溶劑50第五十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)成品：抗生素殘留量檢查抗生素的濫用已經(jīng)引起大量的耐藥菌株的出現(xiàn)，嚴(yán)重威脅了人類健康。在生物制品中應(yīng)嚴(yán)格規(guī)定抗生素的含量。本工藝需在種子制備和發(fā)酵過程中使用抗生素，故需要在成品中檢測抗生素的殘留。按照藥典三部的抗生素殘留量檢查方法應(yīng)為陰性。成品：異常毒性檢查主要檢查目標(biāo)產(chǎn)物以外的有毒物質(zhì).目的是通過動物試驗(yàn)檢查制品中外源性毒性物質(zhì)的污染情況以及是否存在意外的不安全因素，以保證人體使用安全。51第五十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)成品：滲透壓摩爾濃度檢查生物膜具有半透性，在涉及溶質(zhì)的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，滲透壓起著重要作用。因此在制備注射劑和眼用制劑時(shí)，必需關(guān)注其滲透壓。正常人體血液的滲透壓摩爾濃度范圍為285-310mOsmol/kg,0.9氯化鈉溶液和5%葡萄糖溶液的滲透壓摩爾濃度與人體血液相當(dāng)。52第五十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四重組蛋白藥物質(zhì)控要點(diǎn)成品：不溶性微粒檢查藥典標(biāo)準(zhǔn)（注射用無菌粉末）：每容器（份）》≥10um微粒不過6000粒，≥25um微粒不得過600粒。不溶性微粒進(jìn)入人體會血栓，熱原反應(yīng)，器官病理，肉芽，血液凝結(jié)，變態(tài)反應(yīng)，即使微粒直徑7～12μm，即使檢驗(yàn)符合的注射劑中的異物，一旦進(jìn)入極細(xì)的血管中可立即引起阻塞，造成損傷或壞死。53第五十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四第三部分：注射用重組人胸腺肽α1與注射用重組人白介素-2（125SER）生產(chǎn)工藝注射用重組人胸腺肽α1生產(chǎn)工藝注射用重組人白介素-2（125Ser）生產(chǎn)工藝注射用重組人胸腺肽α1與注射用重組人白介素-2生產(chǎn)工藝對比54第五十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四注射用重組人Tα1與白介素-2生產(chǎn)工藝注射用重組人胸腺肽α1生產(chǎn)工藝55第五十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四注射用重組人Tα1與白介素-2生產(chǎn)工藝注射用重組人白介素-2生產(chǎn)工藝56第五十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期四注射用重組人Tα1與白介素-2生產(chǎn)工藝注射用重組人Tα1與白介素-2生產(chǎn)工藝對比序號胸腺肽α1白介素-2(125Ser)1大腸桿菌表達(dá)體系（BL21(DE3)/pTRX-Tα1）大腸桿菌表達(dá)體系（PBV220/125Ser-IL-2/DH5α）2重組質(zhì)粒表達(dá)（pTRX-Tα1）重組質(zhì)粒表達(dá)（PBV220/125Ser-IL-2）3高密度發(fā)酵（胞內(nèi)表達(dá)）低密度發(fā)酵（包涵體表達(dá)）4機(jī)械破碎超聲破碎5親和層析包涵體變性6超濾與酶切凝膠過濾（分子篩）7親和層析凝膠過濾（脫鹽）8凝膠過濾氧化復(fù)性9