中藥多糖的分子量及結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展

中藥多糖的分子量及結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展【摘要】目前中藥多糖藥理作用研究比較活躍，而其分子量和分子量分布及化學(xué)結(jié)構(gòu)確定成為進(jìn)一步深入研究多糖特異性和構(gòu)效關(guān)系以及藥效機(jī)理的基礎(chǔ)。該文歸納總結(jié)了多糖分子量和分子量分布及化學(xué)結(jié)構(gòu)研究的方法。

【關(guān)鍵詞】中藥多糖;分子量;分子量分布;化學(xué)結(jié)構(gòu);生物活性

Abstract:ThestudyonpharmacologicalactionofpolysaccharideoftraditionalChinesedrugismoreactiveatpresent,butthedefinitionofmolecularweightandmolecularweightdistributionandchemicalconstitutionhasbecomethefoundationofbetterstudyonspecificityandstructure-functionrelationshipanddrugactionmechanismofpolysaccharide.Themethodsofstudyonmolecularweightandmolecularweightdistributionandchemicalconstitutuionofpolysaccharidewerereviewedinthispaper.

Keywords:PolysaccharideoftraditionalChinesedrug;Molecularweight;Molecularweightdistribution;Chemicalconstitution;Biologicalactivity

多糖通常是由幾百甚至幾千個(gè)單糖組成的高分子均聚物或共聚物，其能被水解為多個(gè)單糖。多糖存在于植物和動(dòng)物之中，在高等植物和藻類中，它們是細(xì)胞壁或細(xì)胞內(nèi)部的組分；在細(xì)菌和真菌中，它們可能既是細(xì)胞組分，又是新陳代謝的產(chǎn)物。多糖分子量很大，其性質(zhì)也大大不同于單糖和低聚糖?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)茯苓、黃芪、豬苓、枸杞、柴胡、人參、香菇、云芝、銀耳、靈芝、冬蟲夏草等中藥其生物活性成分之一是多糖，具有免疫調(diào)節(jié)、抗輻射、抗凝血、降血糖、降血脂等功效，而它們的生理活性與多糖分子量和分子量分布及化學(xué)結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。

1中藥多糖分子量和分子量分布研究

中藥多糖是生物大分子，屬高分子化合物，其分子量的測(cè)定方法有絕對(duì)法、當(dāng)量法和相對(duì)法。表示其分子量大小的方式有重均分子量，數(shù)均分子量，粘均分子量和Z均分子量。多糖大多數(shù)情況下Mn＜Mη＜Mw＜Mz。多糖的分子量分布是指多糖中各種不同的分子量組分在總量中所占的各自的分量，一般用分子量分布指數(shù)α表示，即重均分子量與數(shù)均分子量的比值，α比值愈大，說明分子量分布愈寬，當(dāng)α＝1時(shí)，是分子量均一體系。對(duì)于生物大分子多糖來說，其分子鏈的長(zhǎng)短可以是不同的，在衡量其分子量時(shí)，往往是一個(gè)平均數(shù)。重均分子量是按分子重量統(tǒng)計(jì)平均的分子量，測(cè)定方法有光散射法、超速離心沉降速度法以及凝膠滲透色譜法等。數(shù)均分子量就是依據(jù)總體分子的的個(gè)數(shù)，求出分子量來的，數(shù)均分子量測(cè)定方法有端基分析法，氣相滲透法，沸點(diǎn)升高冰點(diǎn)降低法，膜滲透壓法，凝膠滲透色譜法等。中藥多糖主要測(cè)數(shù)均分子量和重均分子量。目前常用體積排阻色譜法測(cè)定多糖分子量和分子量分布。2005年版《中國(guó)藥典》Ⅱ部中收載了用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定多糖分子量及分子量分布方法。1凝膠滲透色譜法

凝膠滲透色譜法它是根據(jù)在凝膠柱上不同分子量的多糖與洗脫體積成一定關(guān)系的特性，先用各種已知分子量的多糖制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后由樣品的洗脫體積從曲線中求得分子量。用凝膠過濾法測(cè)分子量，每次緩沖液及流速均需一致，否則會(huì)產(chǎn)生較大的誤差，凝膠柱多采用軟質(zhì)凝膠，常用的商品型號(hào)為交聯(lián)葡聚糖sephadex，瓊脂糖Sepharose，聚丙烯酰胺BIo-GelP。A.E.A.Oliveira1等［1］用GPC法測(cè)定了刀豆屬植物種子外皮多糖的重均分子量為8830?？讘c勝等［2］采用凝膠過濾法測(cè)定南瓜多糖分子量，SephadexG-200層析柱，硫酸-苯酚法檢測(cè)，測(cè)得南瓜多糖的平均分子量為16000。陳洪亮等［3］用葡聚糖凝膠過濾法測(cè)定蘆薈多糖分子量，所用凝膠為SephadexＧ-150，硫酸-苯酚法跟蹤檢測(cè)，結(jié)果分子量為45400。蓋英萍等［4］將桑葉多糖粗提取物通過SephadexG-200柱層析，檢測(cè)得到3種多糖組分,后經(jīng)SephadexG-75柱層析測(cè)定3種多糖組分的相對(duì)分子量為41977，21220，6697。2高效凝膠滲透色譜法

高效凝膠滲透色譜法它是根據(jù)在凝膠柱上不同分子量的多糖與洗脫保留時(shí)間(tR)成一定關(guān)系的特性，先用各種已知分子量的多糖制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后由樣品的保留時(shí)間(tR)從曲線中求得分子量。高效凝膠滲透色譜法測(cè)定多糖分子量多采用示差折光檢測(cè)器，示差折光檢測(cè)器是一種通用型檢測(cè)器，在液相色譜檢測(cè)中多應(yīng)用于對(duì)紫外-可見光沒有吸收的化合物分析，只要被檢測(cè)的化合物的折光指數(shù)與液相溶劑體系有差別即可被檢測(cè)。高效凝膠滲透色譜中主要使用的是剛性凝膠柱，包括高交聯(lián)度(＞40％)苯乙烯-二乙烯基苯共聚物微球，常用的商品型號(hào)為TSK-Gel、Progel-TSKH-Type柱等；多孔球形硅膠，常用的商品型號(hào)為T5K-SW柱等；羥基化聚醚多孔微球，常用的商品型號(hào)為TSK-PW等。戴敬［5］采用色譜柱為TSK-G4000PWXL(mm×cm),示差折光檢測(cè)器，分析測(cè)定了13批樣品，得到四維靈芝液中多糖組分高效凝膠色譜圖譜、多糖組分平均分子量。郭輝［6］采用色譜OHPakSB-805HQ(8mm×300mm)，示差折光器檢測(cè)器，測(cè)得紅毛五加多糖各組分的重均分子量。姜素琴［7］采用色譜柱為TSK-GELG3000PWxl,測(cè)定云芝多糖的重均分子量、數(shù)均分子量及分子量分布指數(shù)。韓鳳蘭［8］應(yīng)用SUGARKS-804色譜柱，示差折光器檢測(cè)器，測(cè)定寧夏黃芪多糖重均分子量、數(shù)均分子量及分子量分布指數(shù)。張紅旭［9］用凝膠色譜分析柱為OhpakSB-805HQC(300mm×8mm),示差折光器檢測(cè)器，測(cè)定了香菇多糖的平均分子量。2中藥多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)研究

多糖與蛋白質(zhì)等生物大分子一樣也有明確的三維空間結(jié)構(gòu)，可以用一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)來描述，其中二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)屬高級(jí)結(jié)構(gòu)，多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指多糖的單糖殘基的組成、排列順序、相鄰單糖殘基的連接方式、異頭物的構(gòu)型及糖鏈有無分支、分支的位置和長(zhǎng)短等。多糖的二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)是指多糖分子中主鏈的構(gòu)象,側(cè)鏈的空間排布，單糖殘基空間相對(duì)定位等。由于單糖的種類比構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸種類多，連接的位點(diǎn)也多，故具有多分支結(jié)構(gòu)的雜多糖結(jié)構(gòu)的確定比蛋白質(zhì)困難得多。多糖與蛋白質(zhì)一樣，其活性不但與立體結(jié)構(gòu)有關(guān)，也存在活性中心，而且還與它所結(jié)合的蛋白質(zhì)、色素、金屬離子等有關(guān)。目前中藥多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法很多，主要有酸完全水解、部分水解法，堿降解法、高碘酸氧化和Smith降解法、甲基化反應(yīng)、酶降解、薄層色譜、高效液相色譜、紅外光譜、核磁共振光譜、質(zhì)譜、氣質(zhì)聯(lián)用、X-射線衍射等。

2.多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定常用光譜方法

紅外光譜法和紫外光譜法

紅外光譜在多糖結(jié)構(gòu)分析上主要是識(shí)別糖的各種官能團(tuán)并確定多糖中各種單糖的糖苷鍵及糖構(gòu)型，以及不同糖的鑒別。劉宗林［10］經(jīng)紅外光譜分析推斷西洋參的多糖是含有葡萄糖、半乳搪、木糖和阿拉伯糖的雜多糖。胡聞莉等［11］用紅外光譜分析生脈散多糖純品，結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)中存在α型糖苷鍵(即α-端基差向異構(gòu)體)。紫外光譜在多糖結(jié)構(gòu)分析上沒有多大用處，但可利用在260,280nm處有無吸收來判斷多糖中是否有蛋白質(zhì)，多肽及核酸，此外還可測(cè)定多糖的含量及糖醛酸含量。楊世平等［12］用紫外光譜法說明紅棗多糖中蛋白質(zhì)含量。

核磁共振光譜法

核磁共振光譜主要解決多糖結(jié)構(gòu)中糖苷鍵的構(gòu)型和重復(fù)結(jié)構(gòu)中單糖的數(shù)目。1H核磁共振波譜主要解決多糖結(jié)構(gòu)中糖苷鍵的構(gòu)型，13CNMR化學(xué)位移范圍寬廣，信號(hào)清晰，在多糖結(jié)構(gòu)分析中可確認(rèn)各種碳核以及分辨分子的構(gòu)型和構(gòu)象。13CNMR可用來確定多糖殘基中取代位置和分枝點(diǎn)［13］，而2DNMR對(duì)于多糖13CNMR譜全歸屬起著至關(guān)重要的作用［14］。白日霞等［15］利用C13核磁共振手段表征了mg級(jí)小皮傘多糖結(jié)構(gòu)。李熙燦等［16］應(yīng)用1H-NMR，13CNMR對(duì)黑海參中的多糖成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。核磁共振技術(shù)對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的測(cè)定非常重要，如果再與糖組分分析［17］等技術(shù)相結(jié)合，將更有助于多糖結(jié)構(gòu)的確定。

質(zhì)譜和氣-質(zhì)聯(lián)

用質(zhì)譜在多糖的結(jié)構(gòu)研究中是一種重要的手段，包括電子轟擊質(zhì)譜、化學(xué)電離質(zhì)譜、快原子轟擊質(zhì)譜、電噴霧質(zhì)譜、串聯(lián)質(zhì)譜等［18］。其中化學(xué)電離質(zhì)譜能提供可靠的分子量，糖碎片的性質(zhì)，還原糖和非還原端糖的情況等，氣-質(zhì)聯(lián)用可大大簡(jiǎn)化糖的結(jié)構(gòu)分析工作。白日霞［19］應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)甲基化多糖的測(cè)定方法及通過質(zhì)譜解析對(duì)多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)的推測(cè)原理進(jìn)行了研究。張宏等［20］經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)機(jī)(GC一MS)分析，初步確定了淫羊藿多糖結(jié)構(gòu)糖苷的鍵型，并推測(cè)出其可能的結(jié)構(gòu)。Ulrike經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)機(jī)(GC一MS)分析snowmold蘑菇多糖，確定其為β-(1→4)糖苷鍵葡聚糖［21］。

多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定常用方法

多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)分析中常應(yīng)用X射線衍射法(XRD)、毛細(xì)管電泳法(CE)、核磁共振法(NMR),旋光度(ORD)和圓二色譜(CD)、快原子轟擊質(zhì)譜(FAB一MS)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC一MS)、原子力顯微鏡(AFM)等檢測(cè)手段。X-射線衍射法主要用來測(cè)定多糖的晶體結(jié)構(gòu)，王書軍等［22］應(yīng)用X-射線衍射法測(cè)定三種貝母多糖的晶體結(jié)構(gòu)類型為B-型。圓二色譜常用來研究多糖的構(gòu)型和構(gòu)象，張麗萍等［23］利用圓二色譜測(cè)定了金頂側(cè)耳多糖及其化學(xué)修飾產(chǎn)物水溶液的構(gòu)象。原子力顯微鏡可以在空氣和液體中對(duì)多糖分子的單分子和聚集體成像，得到單分子的直徑、長(zhǎng)度等量化信息和分子聚集體形貌特征［24］。

中藥多糖的生物活性不僅與一級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且與其高級(jí)結(jié)構(gòu)關(guān)系密切。楊典洱等［25］研究發(fā)現(xiàn)脫乙酰殼多糖抑制真菌生長(zhǎng)的能力與其分子量和化學(xué)結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，脫乙酞?dú)ざ嗵欠肿恿吭叫?，分子中的自由氨基越多，抑制真菌的活性越大。X-衍射分析表明，具有抗腫瘤活性的香菇多糖呈三股螺旋結(jié)構(gòu),當(dāng)其失去三股螺旋構(gòu)象，改變空間構(gòu)型，其生物活性也隨之消失［26］。研究表明中藥多糖分子量、糖單元的組成、糖苷鍵的類型、主鏈的構(gòu)型、支鏈的空間構(gòu)型、取代基的種類及數(shù)量等與其生物活性密切相關(guān)。

伴隨著中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的加速，國(guó)內(nèi)外關(guān)于中藥多糖分子量、化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理作用的研究越來越多，但尚有許多不足之處。目前中藥多糖結(jié)構(gòu)研究大多僅限于一級(jí)結(jié)構(gòu)，高級(jí)結(jié)構(gòu)研究往往欠缺，而多糖的生物活性更多與其高級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)；中藥多糖藥代動(dòng)力學(xué)研究尚處初級(jí)階段，相關(guān)研究較少。因此通過多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)的確立，并結(jié)合新的分析方法和計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)推斷多糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)，可為中藥多糖藥代動(dòng)力學(xué)研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)手段不斷引入，一定會(huì)提高中藥多糖藥物研究整體水平。

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