生物信息培訓(xùn)課件無(wú)ref轉(zhuǎn)錄組sop版

轉(zhuǎn)錄組分析內(nèi) 轉(zhuǎn)錄組（無(wú)Ref）分析流程 轉(zhuǎn)錄組分析內(nèi) 轉(zhuǎn)錄組分析步 前期數(shù)據(jù)準(zhǔn) 信息分析步 轉(zhuǎn)錄組項(xiàng)目 設(shè) 設(shè) 原始數(shù)據(jù)評(píng) 數(shù)據(jù)評(píng)估程 數(shù)據(jù)評(píng)估備用程 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分 無(wú)參考組組 無(wú)Ref轉(zhuǎn)錄組分析流 物種Unigene注釋分 差異篩選及聚類注 SNP分 結(jié)題報(bào)告模 結(jié) 規(guī) 分析結(jié)果完 項(xiàng)目結(jié) ，Readme.txt文件 參考文 附 附錄 附錄 附錄 附錄 附錄 附 轉(zhuǎn)錄組對(duì)象是樣品內(nèi)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的定量以及結(jié)構(gòu)分1.2小時(shí)/2.2天/3.表達(dá)量分0.5天/4.結(jié)構(gòu)分樣品間SNP分析，SSR分析，UnigeneOrfcds和pep25.差異表達(dá)分4~56.19天/相對(duì)于有參考組的轉(zhuǎn)錄組無(wú)參考組的轉(zhuǎn)錄組需要做的前期準(zhǔn)備內(nèi)容較少可以了解一下對(duì)應(yīng)物種信息，或相關(guān)物種的一些文章等，如組大小，數(shù)量。轉(zhuǎn)錄組項(xiàng)目 設(shè)以及區(qū)分不同項(xiàng)目的分析，以及后期結(jié)果整理的簡(jiǎn)單明了，總命名是很重要的，命名規(guī)則：物種名稱_Transcriptome_項(xiàng)目編號(hào)，后期所有該項(xiàng)目分析在此下進(jìn)行。命令 物種名為DemoTranscriptomeBMK120720-轉(zhuǎn)錄組項(xiàng)目單次分 設(shè)注意事項(xiàng)：Transcriptome項(xiàng)目路徑設(shè)置有嚴(yán)格格式和命名要求，所有、文件命名對(duì)大小寫敏感。項(xiàng)目單次命名規(guī)則是：物種名_Transcriptome_分析時(shí)間。時(shí)間為8位數(shù)字，年月日，中間沒(méi)有分割符（Demo_Transcriptome_ 命令mkdir (195/ 下創(chuàng)建 )物種名Demo，項(xiàng)目類型Transcriptome，分析時(shí) 注意事項(xiàng)：轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)命名規(guī)則是：樣品名稱_下機(jī)日期_1.fq和樣品名稱_下機(jī)日識(shí)別自己的項(xiàng)目，如：Unkown是物種英文名，195-T1是樣品編號(hào)，Rawdata。mkdirRawdata(Demo_Transcriptome_BMK120720-195/Demo_Transcriptome下創(chuàng)建 重點(diǎn)在于對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)評(píng)估，數(shù)據(jù)質(zhì)量是否滿足標(biāo)準(zhǔn)，GC含量是否正常等內(nèi)容，質(zhì)控為：，利用qc用戶進(jìn)入。另外還需要用程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)。 下的Rawdata 在Rawdata 個(gè)DataAssess Main_Solexa_GC_Q_svg_v1.0.1.plfqdir命令注釋fqdir 12rawStyle統(tǒng)計(jì)的結(jié)果，basenumber有沒(méi)中的內(nèi)容關(guān)鍵質(zhì)控點(diǎn)：數(shù)據(jù)的產(chǎn)量和質(zhì)量，可以查看數(shù)據(jù)量，CycyleQ20是否達(dá)合同指標(biāo)，GA數(shù)據(jù)：/home/liuzy/workdir/bin/titleFilter.pltile情況，按tile過(guò)濾；highseq數(shù)據(jù)：/home/wang/workdir/bin/tools/tileFilter-hiseq.pl同上，按tile過(guò)濾。注意事項(xiàng)：此評(píng)估程序沒(méi)有CycleQ20%、GC分布和質(zhì)量分布圖輸出，僅作為GC含量、Q20和CycleQ20%的比例的統(tǒng)計(jì)，原始數(shù)據(jù) 下的Rawdata 在Rawdata 下新建一個(gè)Stat 下運(yùn)行fastq_stat_quality_ACGTN程序。GC 命令注釋 Read1 Read2-f輸出前綴（一般以樣品名作為輸出前綴 ：關(guān)鍵質(zhì)控點(diǎn)數(shù)據(jù)的產(chǎn)量和質(zhì)量可以查看數(shù)據(jù)量，GC含量，CycleQ20%，Q20情況。如果質(zhì)量值過(guò)低，Q2070以下，那么這批數(shù)據(jù)將存在質(zhì)量問(wèn)題，需要向質(zhì)控部和上：（，（，達(dá)聚類注釋（，SNP流程分析（，另外需要注意的質(zhì)控點(diǎn)。注意事項(xiàng)：在項(xiàng)目單次分 下新 ：物種名_Assembly_日期，并 物種 組裝過(guò)程會(huì)占用大量集群資源，注意節(jié)點(diǎn)的使用，如一個(gè)樣品2G的數(shù)據(jù)一般可以在middle節(jié)點(diǎn)使用，而4G的數(shù)據(jù)需在大節(jié)點(diǎn)上使用，每個(gè)節(jié)點(diǎn)中使用一個(gè)樣品，占用大節(jié)點(diǎn)前可以無(wú)參考組組程序簡(jiǎn)介和命令 Index–s1-- - - -fragment_length -- -- 命令注釋 輸入序列類型（fa或 Read1 Read2 物種名_Assembly_日期 樣品名_Assembly_日期 樣品名 樣品名 sh結(jié) nohup結(jié)果是否報(bào)錯(cuò)，或者查看物種名_Assembly_日期_日期/Sam1_Trinity/下是否有Sam1.Trinity.fastainchworm.K25.L25.DS.fa（如下圖，Transcriptscontig兩個(gè)文件。在組裝過(guò)程中要隨時(shí)關(guān)注work_sh中的的Butterfly_sh文件和fyGraph_sh文件是否有.error文件是否報(bào)錯(cuò)，有時(shí)候可能出現(xiàn)任務(wù)投遞不成功的現(xiàn)象，要及時(shí)關(guān)注，如果有報(bào)--reqsubwork.shnohup中是否有報(bào)錯(cuò)信息，Trinity組裝結(jié)果（樣品名_Result/）下生成樣品名.Contig.fa和樣品名.Transcripts.fa（對(duì)應(yīng)樣品的contig和轉(zhuǎn)錄本序列）組裝結(jié)果完成。Ref 下新建一個(gè)ysis_日期 無(wú)參考組轉(zhuǎn)錄本聚類以無(wú)參考組轉(zhuǎn)錄本聚類以及Unigene的結(jié)構(gòu)和表達(dá)量分程序和命令簡(jiǎn)介Perl - - - 命令注釋 分 Unigene分 UnigeneOrf Unigene的SSR sh文件 條Reads比對(duì)到Unigene（TotalReads 效率為54.76%，能夠完全比對(duì)上的reads為 條，為73.4%。插插入片段圖和插入片段統(tǒng)計(jì)列表 ysis_日期/rmap/樣品名/Sam1.insertSize.png ysis_日期 ysis_日期rmap/樣品名376857readsx254的插入片段大小，所以可以看出插入254bp，插入片段檢查詳細(xì)見(jiàn)關(guān)鍵質(zhì)控點(diǎn)。各各樣品組裝Transcript結(jié)果統(tǒng)計(jì)整理 ysis_日期200-3001717928.57166%； 第八行：代表一共有60126條轉(zhuǎn)錄本；N50ysis_ysis_日期各樣品Transcripts長(zhǎng)度分布圖為項(xiàng)目報(bào)告中所需內(nèi)容/Unigene結(jié)果統(tǒng)計(jì)，此類型統(tǒng)計(jì)結(jié)果為報(bào)告中所需圖表（Sam組組組裝UnigeneLength），數(shù)據(jù)路徑 ysis_日期 下的.png格式的文件找到TranscriptionSam1的Unigene組裝得到的組裝得到的Unigene分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)整理 ysis_日期/Unigene/Demo.Unigene.stat.xls（ Unigene，組裝的總長(zhǎng)度是，大于1KUnigene10601個(gè)，N50的長(zhǎng)度為SSR分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)SSR【（ATATcgatatgGCGC）是（AT）與（GC）的混237個(gè)；9個(gè)；第三行：代表單堿基的完美重復(fù)（例如AAAAA）SSR9542個(gè)堿基的完美重復(fù)（ATATATATAT）SSR1220個(gè)；3個(gè)堿基的完美重復(fù)（ATGATG）SSR668個(gè)；5個(gè)堿基的完美重復(fù)SSR5個(gè)；6個(gè)堿基的完美重復(fù)SSR4個(gè)；第九行：代表總的SSR3122個(gè)；UnigeneUnigene編碼序列預(yù)測(cè) ysis_日期/上圖表示用篩選得到的Unigene序列信息，使用Getorf來(lái)預(yù)列的開(kāi)放閱讀框，選取orfUnigeneUnigene的編碼Gene_idGene_lengthGene_strandCDS_startCDS_end，cdsPepfa格式的序列文件。組裝效果的評(píng)估UnigeneN50等一些組裝相關(guān)的常規(guī)指標(biāo)，Unigene總長(zhǎng)度和數(shù)量與物種本身組大小有關(guān)，長(zhǎng)度大于1K以上數(shù)量檢驗(yàn)比對(duì)效率，正常情況下比對(duì)效率在50%以上，如比對(duì)效率較低查看數(shù)據(jù)是否質(zhì)量較低插入片段和隨機(jī)性，插入片段是用來(lái)檢測(cè)實(shí)際數(shù)據(jù)是否與預(yù)計(jì)所選片段范圍一致，如下圖a左側(cè)顯示為正常（只有一個(gè)峰cc100bp處有峰值，一般插 正常（上 不正常（下UnigeneUnigene注意事項(xiàng)：在項(xiàng)目單次分析下新建一個(gè)Unigene_annotation_日期作為輸出。2Unigene程序和命令簡(jiǎn)介PerlGene_Func_Anno_Pipline.pl-all-cfgAnno_cfg.txt-Database_cfg-od 待注釋的cfg 注釋分 ……/上圖是利用Unigene序列與各類功能數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，Unigene的功能注釋統(tǒng)計(jì)結(jié)果，圖中所示數(shù)據(jù)表示Unigene注釋到各個(gè)庫(kù)中的數(shù)量。第一列代表Unigene注釋到各個(gè)庫(kù)中的名稱。第二列代表Unigene300-1000Unigene注釋到各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的個(gè)數(shù)。1000Unigene注釋到數(shù)據(jù)庫(kù)的個(gè)數(shù)。此統(tǒng)計(jì)結(jié)果為報(bào)告中所需圖表（用于報(bào)告中Unigene注釋統(tǒng)計(jì)表。注釋的功能庫(kù)包括GO，Kegg，COG，Nr，Nt，swissprot，trembl等功能注釋。組裝得到的Unigene 下新建一個(gè)DEG_ysis 程序命令簡(jiǎn)介 - - 命令注釋 輸 下新建一個(gè)DEG_ -enrient是否進(jìn)行KEGG與Go富集分析以及功能注釋【(0offor1on)default0 需要給出全部Unigene的功能注釋結(jié) ，Result的那結(jié) 格式 差異分 所以差異的ID列樣品名VS樣品名 ……#ID列代表ID；對(duì)應(yīng)樣品的列代表樣品在這個(gè)上的RPKM值(由于IDEG6軟件計(jì)RPKM值進(jìn)行了取整)；Chi表示卡方檢驗(yàn)值；Q_valueFDR矯差 差 上圖的結(jié)果是在不同樣品上的表達(dá)量散點(diǎn)圖和兩個(gè)樣品表達(dá)量比值的對(duì)數(shù)圖；左圖中反應(yīng)的是在不同樣品上的表達(dá)量散點(diǎn)圖，對(duì)角線左上部分代表Sam1相對(duì)Sam2高表達(dá)，而對(duì)角線右下半部分代表Sam1相對(duì)Sam2低表達(dá)；右圖反應(yīng)的是兩個(gè)樣品Sam1相對(duì)Sam2Sam1相對(duì)Sam2差差 因在樣品中的表達(dá)量的高低。紅色代表高表達(dá)量gene，綠色代表低表達(dá)量gene。需要用javatreeView軟件載入差異聚類圖.cdt文件做出聚類圖（操作說(shuō)明見(jiàn)附件三），此GO分類 分子功能等進(jìn)行分類（此圖用于報(bào)告中差異表達(dá)的GO分類中填寫需要。COG注釋 系進(jìn)行構(gòu)建的COG數(shù)據(jù)庫(kù)，利用COG數(shù)據(jù)庫(kù)可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類。差異表差異表 的Kegg注釋ysis/樣品名VS樣品名 上圖描述的是基于Pathway的分析更進(jìn)一步了解的生物學(xué)功能。Pathway顯著性富集分析以KEGGpathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)組背景相比，在高況下差異的數(shù)量為100~幾千，如出現(xiàn)異常及時(shí)反饋上級(jí)。SNP樣品間SNP注意事項(xiàng)：在項(xiàng)目單次分析下新建一個(gè)SNP_ysis作為輸出。配置文件：SNP樣品間SNP程序和命令簡(jiǎn)介Perl - 命令注釋 SNP分 SNP SNPsh SNPSam1VS 雜合SNP……總的總的SNP結(jié)果統(tǒng)計(jì)列表: ysis/SNP_Result/Sam1VSSam/上圖中第一列代表不同類型的SNP名稱第二列代表不同類型的SNP對(duì)應(yīng)的個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)，Homo代表純合SNP有3331個(gè)，hete代表雜合的SNP有 個(gè)，hete_homo代表一個(gè)樣品純合，另一個(gè)樣品雜合情況下的SNP有599586個(gè)。樣品間SNP ysis/SNP_Result/ ysis/SNP_Result/Sam1VS,間差異SNP因型、Sam1此位點(diǎn)的深度、Sam2此位點(diǎn)的型、Sam2此位點(diǎn)的深度、SNP分?jǐn)?shù)；關(guān)鍵質(zhì)控點(diǎn)：此過(guò)程注意查看各類型SNPSNP為樣品間純合的SNPSNP一并提供給客戶。3.2項(xiàng)目結(jié)題 分析結(jié)果完成（單次分析產(chǎn)生的列表單次樣品分析 --||--||--||--|||--|--|--Config（所有的配置文件存放 |--Sam1_Assembly_日 （樣品1組裝結(jié) |--Sam2_Assembly_日 （樣品2組裝結(jié) |--ysis_日期（數(shù)據(jù)量分析結(jié)果 | | Unigene | Unigene的SSR | | |-- （Unigene功能注釋分 |-- |--DEG_ （差異注 |-- （差異聚 |--SNP_ （SNP分 |-- （SNP分析結(jié) 項(xiàng)目結(jié) （最后給客戶 ，Readme.txt文件|-- 項(xiàng)目分 |--Basic_ 基礎(chǔ)分 |-- |-- Sample1的表達(dá)量列 |-- Sample1 ` Sample1 ` ，同 |-- |-- `-- `--DEG_ 差異分 |--Anno_enri 差異注釋分 |-- COG | COG |Sample1_vs_Sample2.Cog_class.txtCOG `Sample1_vs_Sample2.Cog_class.txt.statCOG |--go_enri GO注釋結(jié) -- |-- |Sample1_vs_Sample2.GO.Classify.pngGO -- |Sample1_vs_Sample2.GO.anno.txtGO `-- 的GO號(hào)注釋列 |-- kegg |-- kegg `-- kegg |-- Kegg |-- `-- |-- Swissprot |Sample1_vs_Sample2.TrEMBL.anno.txtTrembl |-- 差異注釋總列 |-- nr `-- nt |-- 差異聚 |-- |Sample1_vs_Sample2.DEG.cluster.cdtTreeview |-- |Sample1_vs_Sample2.DEG.cluster.png `Sample1_vs_Sample2.DEG.cluster_colorbar.png | |-- `-- `-- 差異表| | 物種||| Unigene||| Unigene||| Unigene||| Unigene||| ||| Unigene|| |-- Unigene|| |Integrated_Function.annotation.xlsUnigene|| |-- kegg|| |--|| `--|| |-- Cog|| |Demo.Unigene.fa.Cog_class.txtCog|| |Demo.Unigene.fa.GO.anno.txtGO|| |-- GO|| |Demo.Unigene.fa.GO.pngGO|| |-- GO|| |Demo.Unigene.fa.Kegg.koKegg|| |-- Kegg|| |-- Swissprot|| |Demo.Unigene.fa.TrEMBL.anno.txtTrembl|| |-- nr ` nt | Unigene |-- Unigene |Demo.Unigene.cds_pep.stat.xlsUnigene蛋白與CDS |-- Unigene ` Unigene | Unigene的 ` Sample1，2間的SNP ` Unigene的SSR |-- 1K的Unigene |Demo.Unigene.1K.fa.detail.xlsSSR `Demo.Unigene.1K.fa.stat.xlsSSR | Sample1 | S