臨床分子生物學檢驗緒論

Contents臨床分子生物學定義及其發(fā)展臨床分子生物學檢驗內(nèi)容及其應用存在的問題以及標準化123臨床分子生物學發(fā)展方向4本文檔共45頁；當前第1頁；編輯于星期二\9點6分1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展臨床醫(yī)學的主要任務是什么？研究疾病的病因、診斷、治療和預后，提高臨床治療水平，促進人體健康臨床檢驗的主要任務本文檔共45頁；當前第2頁；編輯于星期二\9點6分1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展臨床檢驗臨床微生物檢驗臨床免疫檢驗臨床生化檢驗臨床分子生物學檢驗臨床血液學檢驗本文檔共45頁；當前第3頁；編輯于星期二\9點6分1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展望問聞切本文檔共45頁；當前第4頁；編輯于星期二\9點6分1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展公元前300年，希波克拉底提倡尿液檢查診斷疾病。1500年，內(nèi)科醫(yī)生開始使用尿液顏色比對圖進行直觀尿液分析。1590年，hasjanssen發(fā)明了復式顯微鏡。1592年，伽利略發(fā)明了溫度計。1684年，安東·范·列文虎克出版了第一本細菌繪圖。

本文檔共45頁；當前第5頁；編輯于星期二\9點6分臨床分子生物學定義及其發(fā)展臨床分子生物學檢驗的定義？臨床分子生物學檢驗（clinicalmolecularbiology）是利用分子生物學理論與技術(shù)從基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組等水平研究疾病的發(fā)生發(fā)展機制、疾病的預測與風險評價、疾病的臨床診斷與治療，以及疾病的預防與控制.本文檔共45頁；當前第6頁；編輯于星期二\9點6分1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展第一代檢驗診斷早期細胞形態(tài)雪檢驗第二代檢驗診斷20世紀50年代生化檢驗第三代檢驗診斷20世界60年代免疫學檢驗第四代檢驗診斷基因（分子生物學）檢驗診斷以疾病表型改變?yōu)橐罁?jù)非特異滯后難以早期診斷以疾病基因為探測對象特異性強、敏感可以早期診斷臨床檢驗的發(fā)展本文檔共45頁；當前第7頁；編輯于星期二\9點6分第四代檢驗診斷第三代檢驗診斷1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展本文檔共45頁；當前第8頁；編輯于星期二\9點6分1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展1953年，Watson和Crick提出DNA雙螺旋模型，現(xiàn)代分子生物學開始興起，為分子檢驗奠定了基礎(chǔ)臨床分子生物學檢驗的發(fā)展DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)JamesWatson和FrancisCrick本文檔共45頁；當前第9頁；編輯于星期二\9點6分1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展臨床分子生物學檢驗的發(fā)展：DNA雜交技術(shù)1976年，美籍華裔科學家簡悅威（YuetWaiKan）首次利用液相DNA分子雜交技術(shù)，進行了α地中海貧血的產(chǎn)前診斷簡悅威，漢族，醫(yī)學家。美國國籍。國際醫(yī)學界知名的遺傳學和“脫氧核糖核酸”（DNA）專家。第一階段核心技術(shù)：分子雜交技術(shù)以基因突變位點(導致單基因疾?。榘袠吮疚臋n共45頁；當前第10頁；編輯于星期二\9點6分1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展臨床分子生物學檢驗的發(fā)展:PCR技術(shù)的發(fā)明1985年，聚合酶鏈式反應（PCR）技術(shù)的創(chuàng)建，使大量獲得靶DNA片段成為可能,大大提高檢測的特異性和靈敏性穆利斯(K.B.Mullis)PCR技術(shù)的發(fā)明者本文檔共45頁；當前第11頁；編輯于星期二\9點6分1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展臨床分子生物學檢驗的發(fā)展:PCR技術(shù)的發(fā)明PCR儀瓊脂糖凝膠電泳儀本文檔共45頁；當前第12頁；編輯于星期二\9點6分1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展臨床分子生物學檢驗的發(fā)展:PCR技術(shù)的發(fā)明熒光PCR儀凝膠成像系統(tǒng)本文檔共45頁；當前第13頁；編輯于星期二\9點6分臨床分子生物學檢驗的發(fā)展:PCR技術(shù)的發(fā)明以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，產(chǎn)生的衍生技術(shù)：PCR-限制性酶切片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）等位基因特異性PCRPCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)（PCR-SSCP）實時定量熒光PCR(QuantitativeReal-time

PCR)第二階段核心技術(shù)：聚合酶鏈式反應（PCR）技術(shù)以基因組特異性序列（DNA,RNA）為靶標為獲得性（病原微生物）基因疾?。―NA,RNA）的診斷提供了有效的方法。1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展本文檔共45頁；當前第14頁；編輯于星期二\9點6分臨床分子生物學檢驗的發(fā)展:PCR技術(shù)的發(fā)明1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展PCR電泳結(jié)果Q-PCR結(jié)果本文檔共45頁；當前第15頁；編輯于星期二\9點6分1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展臨床分子生物學檢驗的發(fā)展:以生物芯片為代表的高通量密集型技術(shù)最早的微陣列圖片生物芯片：一般指高密度固定在互相支持介質(zhì)上的生物信息分子（如基因片段、DNA片段或多肽、蛋白質(zhì)、糖分子、組織等）的微陣列雜交型芯片。本文檔共45頁；當前第16頁；編輯于星期二\9點6分1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展臨床分子生物學檢驗的發(fā)展:以生物芯片為代表的高通量密集型技術(shù)本文檔共45頁；當前第17頁；編輯于星期二\9點6分1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展臨床分子生物學檢驗的發(fā)展:以生物芯片為代表的高通量密集型技術(shù)基因芯片基因芯片熱圖第三階段核心技術(shù)：生物芯片（biochip）高通量技術(shù)以基因組特異性核酸序列（DNA,RNA），蛋白質(zhì)分子為靶標為復雜性（多因素，多基因）疾病提供了有效的分子生物學檢驗方法本文檔共45頁；當前第18頁；編輯于星期二\9點6分1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展臨床分子生物學檢驗的發(fā)展:DNA測序技術(shù)測序峰圖sanger本文檔共45頁；當前第19頁；編輯于星期二\9點6分第四階段核心技術(shù)：DNA測序技術(shù)（蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)）以基因組特異性核酸序列，蛋白質(zhì)分子，代謝物為靶標特點：高靈敏度，高特異性，高通量，高自動化1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展臨床分子生物學檢驗的發(fā)展:DNA測序技術(shù)核酸測序技術(shù)為臨床疾病扥分子診斷提供最精確的判定依據(jù)，是分子生物學檢驗的金標準測序方法：第一代：雙脫氧末端終止法第二代：焦磷酸測序法第三代：單分子實時測序，大大降低成本，有望實現(xiàn)1000USD對人類基因組進行測序本文檔共45頁；當前第20頁；編輯于星期二\9點6分1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展臨床分子生物學檢驗的發(fā)展:蛋白技術(shù)蛋白芯片技術(shù)本文檔共45頁；當前第21頁；編輯于星期二\9點6分1.臨床分子生物學定義及其發(fā)展臨床分子生物學檢驗的發(fā)展:蛋白技術(shù)檢測到陽性胃癌蛋白指紋本文檔共45頁；當前第22頁；編輯于星期二\9點6分2.臨床分子生物學檢驗內(nèi)容及其應用臨床分子生物學檢驗的靶標狹義的講，目前分子生物學檢驗的靶標主要以核酸為主廣義上講，臨床分子檢驗的生物標志物包含基因組DNA,各種RNA，蛋白質(zhì)以及代謝物。本文檔共45頁；當前第23頁；編輯于星期二\9點6分2.臨床分子生物學檢驗內(nèi)容及其應用單基因病（孟德爾遺傳性疾?。╃牭稜罴t細胞貧血癥的檢測一種常染色體退化遺傳病引起原因：珠蛋白的β基因發(fā)生了一個點突變

β基因的第6位密碼子為GAG,編碼谷氨酸,突變后為GTG,編碼纈氨酸。檢測方法：該突變導致該基因丟失了一個可被MstII切開的限制性內(nèi)切酶位點。本文檔共45頁；當前第24頁；編輯于星期二\9點6分單基因病（孟德爾遺傳性疾?。?.臨床分子生物學檢驗內(nèi)容及其應用脆性X染色體綜合征脆性X染色體綜合征導致患者智障（Martin-Bell綜合征），脆性X綜合癥是由于在人體內(nèi)X染色體的形成過程中的突變所導致。已發(fā)現(xiàn)了致病基因FMR-1，它含有（CGG）n三核甘酸重復序列，后者在正常人約為30拷貝，而在正常男性傳遞者和女性攜帶者增多到150~500bp，稱為小插入，相鄰的Cpg島未被甲基化，這種前突變（premutation）無或只有輕微癥狀。現(xiàn)已可用RFLP連鎖分析、DNA雜交分析、PCR擴增等方法檢測本文檔共45頁；當前第25頁；編輯于星期二\9點6分成年型多囊腎病單基因?。系聽栠z傳性疾?。?.臨床分子生物學檢驗內(nèi)容及其應用成年型多囊腎病是一種常染色體顯性遺傳病，發(fā)病率高，約1000人中有1名致病基因的攜帶者，起病較晚，多在30歲以后，主要為腎和肝中出現(xiàn)多發(fā)性囊腫由于通過家系分析，已證實APKD的致病基因與α珠蛋白基因3’端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列即3’HVR(3’hypervariableregion)緊密連鎖，而后者在人群中具有高度多態(tài)性，因此可以通過RFLP連鎖分析進行診斷。本文檔共45頁；當前第26頁；編輯于星期二\9點6分2.臨床分子生物學檢驗內(nèi)容及其應用感染性基因病乙型肝炎病毒的分子生物學檢驗乙型肝炎病毒核酸的檢驗HBVDNA是病毒復制和傳染性的直接標志。定量檢測HBVDNA對于判斷病毒復制程度、傳染性大小、抗病毒藥物療效等有重要意義。PCR引物常根據(jù)其S、C、P和X基因中的高度保守序列來設(shè)計熒光定量PCR技術(shù)能準確地反映HBVDNA的復制水平、病程變化和治療恢復情況等，特異性高。

支鏈DNA技術(shù)，核酸雜交技術(shù)等。

本文檔共45頁；當前第27頁；編輯于星期二\9點6分丙型肝炎病毒的分子生物學檢驗2.臨床分子生物學檢驗內(nèi)容及其應用感染性基因病丙型肝炎病毒的核酸檢測肝組織內(nèi)HCVRNA檢測可應用斑點核酸雜交技術(shù)，血清中HCVRNA檢測多采用PCR、核酸雜交、bDNA、基因芯片、轉(zhuǎn)錄介導的擴增系統(tǒng)等技術(shù)。5′UTR區(qū)的序列最保守，種系變化程度及進化率很低，可用于區(qū)分主要基因型本文檔共45頁；當前第28頁；編輯于星期二\9點6分2.臨床分子生物學檢驗內(nèi)容及其應用感染性基因病埃博拉病毒的分子生物學檢測2014年埃博拉病毒感染在西非引起高致死性出血熱疫情流行，目前對該病毒缺乏特異性的疫苗和治療方案，早期快速診斷能明顯降低感染死亡率。EBOV引物設(shè)計必須兼顧各亞型的敏感性，避免其他類似出血熱病毒干擾，目前一般選擇EBOV高度保守的GP或NP作為擴增的靶標設(shè)計引物和探針，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR和實時定量熒光PCR相結(jié)合的方法來進行檢測。本文檔共45頁；當前第29頁；編輯于星期二\9點6分結(jié)核分枝桿菌的分子生物學檢驗2.臨床分子生物學檢驗內(nèi)容及其應用感染性基因病結(jié)核分枝桿菌可通過呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入易感機體，引起多種組織器官的結(jié)核病，其中以通過呼吸道引起肺結(jié)核為最多。PCR擴增所選靶序列主要有65kD抗原基因、MPB蛋白基因、rRNA基因、TBIS6110插入序列、染色體DNA的重復序列等。PCR-RFLP，real-timePCR，等技術(shù)均可2.臨床分子生物學檢驗內(nèi)容及其應用本文檔共45頁；當前第30頁；編輯于星期二\9點6分感染性基因病2.臨床分子生物學檢驗內(nèi)容及其應用禽流感的亞型目的基因錯重PCR擴增本文檔共45頁；當前第31頁；編輯于星期二\9點6分2.臨床分子生物學檢驗內(nèi)容及其應用復雜性疾?。ǘ嗷?，多因素）高血壓的分子生物學診斷目前關(guān)于原發(fā)高血壓相關(guān)的易感基因的研究現(xiàn)狀：1號染色體位于1p36.1的ECE1基因以及1q42-q43的AGT基因是人類血壓調(diào)節(jié)的候選基因。2號染色體2p25-p24是原發(fā)高血壓的易感位點。3號染色體位于3q21-q25的AGTR1A基因以及是與原發(fā)高血壓相關(guān)。4號染色體位于4p16.3的ADD1基因與鹽敏感性原發(fā)性高血壓相關(guān)。7號染色體位于7q22.1的CYP3A5基因與鹽敏感性原發(fā)性高血壓相關(guān)；位于7q36的NOS3基因與妊娠高血壓相關(guān)。11號染色體研究提示位于11q的數(shù)量性狀遺傳位點與血壓的調(diào)節(jié)相等。本文檔共45頁；當前第32頁；編輯于星期二\9點6分2.臨床分子生物學檢驗內(nèi)容及其應用復雜性疾?。ǘ嗷?，多因素）腫瘤的基因診斷腫瘤基因診斷的常用方法PCR、RT-PCR，Southernblot雜交技術(shù)、Northernblot雜交技術(shù)，基因芯片，基因測序等。胃癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肺癌等，在p53,ERras等基因上會有點突變。結(jié)腸癌、腎癌、乳腺癌、腦瘤等CD44，muc-1,VLA-4等基因的拼接會產(chǎn)生改變。本文檔共45頁；當前第33頁；編輯于星期二\9點6分組織特異性基因標志物2.臨床分子生物學檢驗內(nèi)容及其應用復雜性疾?。ǘ嗷?，多因素）存在于腫瘤及其起源的正常細胞中，不存在于其他細胞。如CEAmRNA、AFPmRNA、PSAmRNA等血管生成因子,如血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）等。腫瘤基因診斷的常用方法PCR、RT-PCRSouthernblot雜交技術(shù)、Northernblot雜交技術(shù)基因芯片基因測序。本文檔共45頁；當前第34頁；編輯于星期二\9點6分2.臨床分子生物學檢驗內(nèi)容及其應用耐藥性分析結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測耐利福平分子機制：是由于其作用靶標—結(jié)核桿菌DNA依賴RNA聚合酶β亞單位的編碼基因（rpoB）突變所致。當rpoB中507~533位密碼子的核心區(qū)域—耐利福平?jīng)Q定區(qū)(RRDR)發(fā)生突變時，結(jié)合分歧桿菌表現(xiàn)為耐藥耐異煙肼分子機制：結(jié)核桿菌耐異煙肼與過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因(katG)、烯?；€原酶編碼基因(inhA)、烷基過氧化氫酶還原酶編碼基因(ahpC)、β2S酮酰基?；\載蛋白合成酶編碼基因(kasA)有關(guān)。主要是katG基因的點突變、缺失、插入。耐氨基糖苷類藥物：rpsL基因發(fā)生突變耐吡嗪酰胺：pncA基因突變本文檔共45頁；當前第35頁；編輯于星期二\9點6分2.臨床分子生物學檢驗內(nèi)容及其應用細菌分型16SrDNA是細菌分型最常用的目標基因細菌中包括有三種核糖體RNA，分別為5S

rRNA、16S

rRNA、23S

rRNA。5S

rRNA雖易分析，但核苷酸太少，沒有足夠的遺傳信息用于分類研究；23S

rRNA含有的核苷酸數(shù)幾乎是16S

rRNA的兩倍，分析較困難。而16S

rRNA相對分子量適中，又具有保守性和存在的普遍性等特點，序列變化與進化距離相適應，序列分析的重現(xiàn)性極高。本文檔共45頁；當前第36頁；編輯于星期二\9點6分3.臨床分子生物學的問題以及標準化標準化臨床實驗室分子診斷現(xiàn)已成為臨床檢驗各學科分支中最具發(fā)展?jié)摿Φ念I(lǐng)域,其涉及病原體核酸、人類基因和各種蛋白等大分子的測定,是臨床疾病診斷中不可或缺的手段但在臨床應用中,目前仍存在同一實驗室不同檢測批次間或不同實驗室對同一標本檢測間結(jié)果的差異,這已成為時常困擾臨床醫(yī)師、患者以及實驗室技術(shù)人員的普遍性問題。儀器設(shè)備、試劑生產(chǎn)廠家和臨床實驗室本身在臨床實驗室分子診斷標準化中起著非常關(guān)鍵的作用。標準化本文檔共45頁；當前第37頁；編輯于星期二\9點6分標準化3.臨床分子生物學的問題以及標準化通常臨床實驗室分子診斷標準化應主要包括以下幾個方面。通常臨床實驗室分子診斷標準化應主要包括以下幾個方面。一、臨床標本采集、運送和保存的標準化對這些標本的采集、運送和保存的標準化主要是對標本采集的具體方法、所用容器、采集量、采集時所用材料和用具、運送方式和不同時間中標本保存條件等做出明確而又詳盡的規(guī)定,寫成標準操作程序二、臨床標本制備處理和核酸提取方法的標準化。在抗原和抗體的免疫學測定中,臨床標本中存在的干擾物質(zhì),。在抗原和抗體的免疫學測定中,臨床標本中存在的干擾物質(zhì),在抗原和抗體的免疫學測定中,臨床標本中存在的干擾物質(zhì),可能會造成測定結(jié)果的錯誤，在檢測前,對標本進行適當?shù)南♂尅⒓訜峄蚱渌m當?shù)念A處理則可去掉這種干擾作用。在核酸和基因檢測中,在核酸提取前,對標本進行適當、有效的預處理,對保證后續(xù)核酸提取以及擴增檢測的成功非常關(guān)鍵。本文檔共45頁；當前第38頁；編輯于星期二\9點6分標準化3.臨床分子生物學的問題以及標準化三，檢測試劑和方法的標準化組成一個可用于臨床分子診斷的試劑和方法模式,可有多種選擇,如PCR因其極高的檢測靈敏度,很容易因以前擴增產(chǎn)物或