放射免疫法和ELISA之間的重要差別

放射免疫法和ELISA之間的重要差別2023/6/27放射免疫法一、原理：利用放射性同位素標(biāo)記抗原或抗體，然后與被測的抗體或抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物的原理來進(jìn)行分析的。2023/6/27浙江萬里學(xué)院分析方法放射免疫法分析有兩種方法：競爭性RIA,又稱傳統(tǒng)RIA非競爭性RIA，又稱免疫放射分析（IRMA)2023/6/27浙江萬里學(xué)院競爭性RIA主要特點(diǎn)：標(biāo)記的是抗原。其原理：未知抗原Ag+標(biāo)記抗原Ag＊+已知定量抗體Ab標(biāo)記抗原與抗體復(fù)合物Ag＊Ab+未知抗原與抗體復(fù)合物AgAb+游離標(biāo)記抗原Ag＊（去除）。2023/6/27浙江萬里學(xué)院基本原理Ag-Ab+Ag*AgAbAg++*Ag-Ab+*Ag(B)復(fù)合物(F)游離物

*Ag與Ag的免疫活性相同*Ag＋Ag>AbAg=*Ag,AgAb=*AgAbAg>*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag<*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)2023/6/27浙江萬里學(xué)院Ag*AgAb*AgAbAgAb*Ag++++++++++++++++++++2023/6/27浙江萬里學(xué)院Ag2550100200400800*AgAb分離B、FB%=B/(B+F)F%=F/(B+F)R=B/FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456濃度2023/6/27浙江萬里學(xué)院B%標(biāo)準(zhǔn)曲線2023/6/27浙江萬里學(xué)院在體外條件下,Ag與定量的*Ag對(duì)限量的特異性Ab的競爭結(jié)合反應(yīng)。B%F%B/FCalibrationCurve602023/6/27浙江萬里學(xué)院（一）基本試劑1、抗體2、標(biāo)記抗原3、非標(biāo)記抗原（標(biāo)準(zhǔn)品）二、基本方法化學(xué)結(jié)構(gòu)、免疫活性與被測抗原相同高純度2023/6/27浙江萬里學(xué)院1、抗體1）親合常數(shù)K（affinityconstantK）反應(yīng)抗體與抗原的結(jié)合能力2）交叉反應(yīng)率反應(yīng)抗體的specificity3）滴度(titer)抗體的稀釋倍數(shù)B/F復(fù)合物濃度123·····斜率=-K10100100010000100000Ab稀釋度工作滴度高親和力高特異性高滴度Scatchard作圖2023/6/27浙江萬里學(xué)院2、標(biāo)記抗原1）比活度和放化純度足夠高比活度——每微克抗原上標(biāo)記放射性核素的千貝可數(shù)（KBq/μg）放化純度——具有免疫活性的標(biāo)記抗原占總放射性的百分?jǐn)?shù)。>90%2）半衰期足夠長3）保持原有抗原的特性125I—大分子、3Hor125I—小分子2023/6/27浙江萬里學(xué)院（二）B和F的分離1、第一類2、第二類雙抗體沉淀法PEG沉淀法固相第二抗體法二、基本方法+AgAb(1)Ab(2)試管Ab(2)Ab(1)Ag可溶性復(fù)合物可沉淀復(fù)合物2023/6/27浙江萬里學(xué)院三、質(zhì)量控制（qualitycontrol）1、精密度（precision）變異系數(shù)（CV）2、準(zhǔn)確度（accuracy）回收率=測定值/真實(shí)值×100%90%~110%3、靈敏度（sensitivity）方法的最小可測量4、特異性（specificity）交叉反應(yīng)率5、可靠性（validity）平行性試驗(yàn)6、穩(wěn)定性（stability）B0%，NSB，ED25，ED50，ED75

ABC2023/6/27浙江萬里學(xué)院RIA小結(jié)靈敏度高特異性好精確的定量方法操作簡便2023/6/27浙江萬里學(xué)院非競爭性RIA（MISA)主要特點(diǎn)：標(biāo)記的是抗體。按反應(yīng)原理又分兩種：單位點(diǎn)IRMA,其原理：抗原只有一個(gè)抗原決定簇，所測的抗原為小分子抗原。雙位點(diǎn)IRMA：抗原有兩個(gè)抗原決定簇，所使用的兩種亞型抗體在與同一抗原分子結(jié)合時(shí)互不干擾。2023/6/27浙江萬里學(xué)院免疫放射分析法*Ab+Ag-*Ab+*Ab（immunoradiometricassay,IRMA）B%Ag（B）（F）2023/6/27浙江萬里學(xué)院IRMA與RIA工作原理的主要區(qū)別RIAIRMA競爭性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)非競爭性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)采用標(biāo)記抗原采用標(biāo)記抗體三種主要反應(yīng)試劑二種主要反應(yīng)試劑所用抗體是限量的所用抗體是過量的*AgAb的量與待測Ag的量呈負(fù)相關(guān)Ag*Ab的量與待測Ag的量呈正相關(guān)反應(yīng)到達(dá)平衡慢反應(yīng)到達(dá)平衡快非特異結(jié)合主要影響高劑量區(qū)非特異結(jié)合主要影響低劑量區(qū)低劑量區(qū)有不確定因素低劑量區(qū)無不確定因素2023/6/27浙江萬里學(xué)院ELISAELISA即酶聯(lián)免疫吸附測定。其基本原理有三條：

（1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學(xué)活性；

（2）抗原或抗體可通過共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；

（3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。2023/6/27浙江萬里學(xué)院ELISA過程包括：抗原（抗體）吸附在固相載體上稱為包被，加待測抗體（抗原）,再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體（抗原）,生成抗原（抗體）－－待測抗體（抗原）－－酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體（抗原）的量。待測抗體（抗原）的定量與有色產(chǎn)生成正比。2023/6/27浙江萬里學(xué)院ELISA常用的四種方法

1．直接法測定抗原

1、將抗原吸附在載體表面；2、加酶標(biāo)抗體，形成抗原—抗體復(fù)合物；3、加底物。底物的降解量＝抗原量。

2．間接法測定抗體1、將抗原吸附于固相載體表面；2、

加抗體,形成抗原-抗體復(fù)合物；3、加酶標(biāo)抗體；4、加底物。測定底物的降解量＝抗體量。

2023/6/27浙江萬里學(xué)院間接法洗滌洗滌洗滌待測抗體酶標(biāo)抗抗體2023/6/27浙江萬里學(xué)院3.雙抗體夾心法測定抗原1、將抗原免疫第一種動(dòng)物獲得的抗體吸附于固相表面;2、加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物;3、加抗原免疫第二種動(dòng)物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復(fù)合物;4、加酶標(biāo)抗抗體（第二種動(dòng)物抗體的抗體）;5、加底物。底物的降解量＝抗原量。2023/6/27浙江萬里學(xué)院雙抗體夾心法洗滌洗滌洗滌待測抗原2023/6/27浙江萬里學(xué)院

4.競爭法測定抗原（1）將抗體吸附在固相載體表面;（2）加入酶標(biāo)抗原（3）加入酶標(biāo)抗原和待測抗原；（4)加底物。

對(duì)照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。

2023/6/27浙江萬里學(xué)院競爭法洗滌洗滌待測抗原酶標(biāo)抗原2023/6/27浙江萬里學(xué)院ELISA實(shí)驗(yàn)步驟2023/6/27浙江萬里學(xué)院洗板步驟每空加洗滌液350ul，30秒甩甩盡孔內(nèi)液體，吸水紙上拍干盡孔內(nèi)液體，吸水紙上拍干重復(fù)3次2023/6/27浙江萬里學(xué)院ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值減去空白孔的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，查出標(biāo)本濃度2023/6/27浙江萬里學(xué)