小鼠室旁核內(nèi)雌激素受體與催產(chǎn)素、加壓素表達(dá)的免疫組化研究

小鼠室旁核內(nèi)雌激素受體與催產(chǎn)素、加壓素表達(dá)的免疫組化研究【摘要】目的研究雌激素的核受體ERα和ERβ以及催產(chǎn)素、加壓素在成年雌性小鼠下丘腦室旁核內(nèi)的表達(dá)。方法采用硫酸鎳銨增強(qiáng)顯色的免疫組化SP法檢測ERα、ERβ、催產(chǎn)素和加壓素在室旁核內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果雌激素的兩種核受體在室旁核內(nèi)都有表達(dá)，但是以ERβ為主，其免疫陽性產(chǎn)物均在細(xì)胞核內(nèi)，未見核外免疫陽性反應(yīng)。催產(chǎn)素的免疫陽性產(chǎn)物主要在細(xì)胞核周圍的胞漿即核周質(zhì)內(nèi)，而加壓素的免疫陽性物質(zhì)除了在核周質(zhì)內(nèi)有很強(qiáng)的反應(yīng)外，在突起內(nèi)也可見很強(qiáng)的免疫反應(yīng)。ERα的免疫陽性胞體主要在大細(xì)胞部內(nèi)側(cè)，而ERβ、催產(chǎn)素和加壓素的免疫陽性胞體主要在背側(cè)帽部或大細(xì)胞部的外側(cè)。結(jié)論室旁核內(nèi)兩種雌激素受體可能都參與了對催產(chǎn)素和加壓素的調(diào)節(jié)，但ERβ可能發(fā)揮了主要的調(diào)節(jié)作用。

【關(guān)鍵詞】雌激素受體；催產(chǎn)素；加壓素；室旁核；小鼠

Abstract:ObjectiveTostudytheexpressionsofthetwoestrogenreceptors(ERαandERβ),oxytocinandvasopressinintheparaventricularnucleus(PVN)ofmice.MethodsTheexpressionsofERα,ERβ,oxytocinandvasopressinweredetectedusingnickelammoniumsulfateintensifiedimmunohistochemicalSPmethod.ResultsBothofthetwoERs(ERαandERβ)immunoreactivitiesweredetectedinthecellnucleiofthePVN,whileERβshowedstrongerstaining.Positivestainingofoxytocinandvasopressinwereinthecytosoloftheneuronsandtheformergavelessintensity,manypositivevaricositiesforvasopressinwerealsonoticedinneurite.MostofERαwerefoundinthemagnocellularpart,andotherswerefoundoutthemagnocellularpartordorsalcupofthePVN.ConclusionBothERsmightinvolvetheaccommodationofPVN,butERβmightbethepredominantERinmediatingthisERdependantregulation.

Keywords:estrogenreceptor;oxytocin;vasopressin;hypothalamicparaventricularnucleus;mouse

已有的研究表明雌激素可以調(diào)節(jié)下丘腦室旁核的神經(jīng)內(nèi)分泌活動尤其是催產(chǎn)素和加壓素的分泌，但是其機(jī)制尚不清楚［12］。我們此前研究了雌激素β受體在小鼠室旁核內(nèi)的發(fā)育學(xué)表達(dá)，以及在妊娠、哺乳鼠PVN的表達(dá)［34］，本文擬對PVN內(nèi)兩種雌激素受體ERα和ERβ，以及OT和VP的表達(dá)進(jìn)行初步研究，以期為闡明雌激素受體介導(dǎo)的雌激素調(diào)節(jié)室旁核神經(jīng)內(nèi)分泌活動的機(jī)制提供新的資料。

1材料與方法

主要試劑

兔抗ERα、兔抗VP和鼠抗OT購自Chemicon公司；兔抗ERβ購自Zymed公司。生物素標(biāo)記的羊抗兔或馬抗小鼠以鏈霉卵白素標(biāo)記的辣根過氧化物酶復(fù)合體均購自北京中杉生物技術(shù)公司。其它試劑如硫酸鎳銨為分析純。

實驗動物及標(biāo)本制備

正常成年昆明雌性小鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。經(jīng)陰道涂片鑒定為動情間期者共選取5只。動物用5%水合氯醛腹腔麻醉，開胸，經(jīng)左心室插管到主動脈，剪開右心耳，先后灌注生理鹽水200mL和4%多聚甲醛溶液300mL。灌注后取出大腦組織，分離下丘腦，放入4%多聚甲醛溶液繼續(xù)后固定過夜。Leica1860型冰凍切片機(jī)行冰凍切片，片厚30μm，切片漂于PBS中備用。

免疫組化染色

硫酸鎳銨增強(qiáng)顯色的免疫組化技術(shù)按文獻(xiàn)［5］進(jìn)行。簡述切片經(jīng)3%H2O2封閉15min，PBS漂洗后用正常血清封閉30min，然后加入一抗于37℃孵育1h后轉(zhuǎn)4℃孵育48h。PBS漂洗過夜后加入各自對應(yīng)的二抗，室溫孵育1h，PBS漂洗后用SPHRP孵育1h，最后用硫酸鎳銨DAB顯色5min，梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。

圖像分析與數(shù)據(jù)處理

所有染色切片經(jīng)Leica顯微攝像系統(tǒng)采集后，用ImageProPlus軟件進(jìn)行光密度分析，每只小鼠隨機(jī)測量5張切片，共計5只小鼠。用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析處理。

2結(jié)果

兩種雌激素受體在正常雌性小鼠PVN內(nèi)的免疫陽性產(chǎn)物都位于細(xì)胞核內(nèi)，未見核外陽性產(chǎn)物。ERα免疫陽性細(xì)胞數(shù)量較多但是染色淺，主要見于大細(xì)胞部的內(nèi)側(cè)；ERβ免疫陽性細(xì)胞主要見于背側(cè)帽部、大細(xì)胞部內(nèi)側(cè)部。OT在正常雌性小鼠PVN內(nèi)的免疫陽性細(xì)胞數(shù)量少，稀疏分布于背側(cè)帽部和大細(xì)胞部，在細(xì)胞內(nèi)有很深的染色，整個PVN內(nèi)都可見到呈串珠樣的免疫陽性突起。VP在正常雌性小鼠PVN內(nèi)免疫陽性最強(qiáng)，在背側(cè)帽部和大細(xì)胞部外側(cè)有密集的免疫陽性細(xì)胞，小細(xì)胞部有網(wǎng)絡(luò)狀的免疫陽性突起，而在背側(cè)帽部和大細(xì)胞部外側(cè)發(fā)出大量的免疫陽性突起投射到視上核與弓狀核。

為了進(jìn)一步分析兩種ER在正常雌性小鼠PVN內(nèi)的表達(dá)強(qiáng)度，將其免疫組化染色進(jìn)行了光密度分析。結(jié)果表明盡管ERα的免疫陽性細(xì)胞數(shù)目看似較ERβ多，但是其平均光密度卻顯著低于ERβ，P＜。提示ERβ是PVN內(nèi)主要的雌激素受體，在介導(dǎo)雌激素對PVN神經(jīng)內(nèi)分泌活動中可能發(fā)揮了主要作用。

3討論

雌激素對神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能具有重要的調(diào)節(jié)作用［12］，而其受體ERα和ERβ在腦內(nèi)可能介導(dǎo)了不同的生物學(xué)功能，這與其分布密切相關(guān)［68］。比如ERα在與生殖有關(guān)的核團(tuán)如終紋床核、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核和弓狀核等部位表達(dá)較高，提示該受體可能主要參與了對生殖功能的調(diào)節(jié)。而ERβ在大腦皮質(zhì)、基底前腦、海馬等部位表達(dá)較高，提示ERβ可能主要參與了對學(xué)習(xí)記憶等高級功能的調(diào)節(jié)。有研究已證明敲除ERβ基因后，基于海馬的學(xué)習(xí)記憶行為和LTP下降［9］，足以表明ERβ在腦內(nèi)的重要作用。

下丘腦含有兩大神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，即位居室旁核、視上核的大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，以及散在于下丘腦底部和其它核團(tuán)的小細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)。因此，室旁核是重要的神經(jīng)內(nèi)分泌核團(tuán)，主要由靠近第三腦室的小細(xì)胞部、外側(cè)的大細(xì)胞部和位居其上的背側(cè)帽部構(gòu)成。OT是室旁核內(nèi)的重要激素之一，對分娩起著關(guān)鍵的作用，還參與了學(xué)習(xí)記憶等重要的生理功能［1012］，有研究報道哺乳母鼠的學(xué)習(xí)記憶明顯優(yōu)于未育小鼠，實驗證明這與OT密切相關(guān)。VP是PVN內(nèi)的另一重要神經(jīng)內(nèi)分泌激素，除了主要與利尿有關(guān)以外，也有文獻(xiàn)報道VP與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)。所以研究PVN內(nèi)這兩種激素的表達(dá)及其調(diào)節(jié)具有重要的意義［1314］。已有研究報道了兩種雌激素受體在PVN內(nèi)的分布，但是究竟是哪一種ER在起主要調(diào)節(jié)或二者協(xié)調(diào)作用至今尚無定論［8］。我們前期對妊娠及哺乳母鼠PVN內(nèi)ERβ的表達(dá)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在分娩前后其表達(dá)最高，表明ERβ對分娩可能起了主要作用。本研究顯示，ERβ、OT和VP的免疫陽性胞體主要位于背側(cè)帽部而ERα免疫陽性細(xì)胞核主要位于大細(xì)胞部的內(nèi)側(cè)靠近小細(xì)胞部。因此，從位置關(guān)系上來看，ERβ與OT或VP共存的可能性較ERα大，強(qiáng)烈提示在成年雌性小鼠PVN內(nèi)，ERβ可能是介導(dǎo)雌激素作用于OT和VP的主要受體，發(fā)揮了主要的調(diào)節(jié)作用，而ERα的調(diào)節(jié)作用會比較弱。當(dāng)然，這還需要用免疫組化雙重染色技術(shù)等來加以證實。ERβ是如何發(fā)揮調(diào)節(jié)作用以及其信號途徑與作用機(jī)制等問題，有待進(jìn)一步的研究來回答。

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