蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)

蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的概念和意義蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的分類(lèi)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的流程蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)思路本節(jié)小結(jié)第一節(jié)概述蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)一、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的概念和意義1、概念實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子改造目標(biāo)的一整套方法、計(jì)劃、措施和指導(dǎo)方針。以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系為基礎(chǔ)，通過(guò)蛋白質(zhì)模型和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等方法，構(gòu)建具有新功能的蛋白質(zhì)模型的技術(shù)。如何理解？分子設(shè)計(jì)包括：目標(biāo)、思想、程序、方法、措施、驗(yàn)證和分析一系列過(guò)程。是藍(lán)圖—如：建筑工程的設(shè)計(jì)藍(lán)圖—宏偉構(gòu)思和誘人的前景是理論—理論上的設(shè)計(jì)——指導(dǎo)實(shí)踐過(guò)程是實(shí)踐—實(shí)踐上的驗(yàn)證——提出問(wèn)題與建筑工程的藍(lán)圖不同——實(shí)施驗(yàn)收(也有豆腐渣工程——不是設(shè)計(jì)的問(wèn)題)是設(shè)計(jì)—實(shí)踐—驗(yàn)證—再設(shè)計(jì)—再實(shí)踐—再驗(yàn)證的過(guò)程是一個(gè)設(shè)計(jì)—驗(yàn)證反復(fù)進(jìn)行的過(guò)程。獲得新功能蛋白質(zhì)分子及其分子模型2、意義：（通過(guò)分子設(shè)計(jì)、人工改造蛋白）理論上：解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系實(shí)踐上：滿(mǎn)足生產(chǎn)實(shí)踐的需求蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)是蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的核心問(wèn)題與前沿領(lǐng)域是一門(mén)新興的研究領(lǐng)域，是眾多學(xué)科的交叉結(jié)構(gòu)生物學(xué)、信息生物學(xué)、分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等隨其他學(xué)科的發(fā)展而不斷地發(fā)展，其內(nèi)容也在不斷地更新。設(shè)計(jì)和實(shí)踐成功的實(shí)例：DNA結(jié)合蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、氧化還原活性蛋白理論上：解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系？為什么組成天然蛋白質(zhì)只20種氨基酸， 卻具有高度多樣性，功能如此廣泛又各不相同？？蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與高級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)系？？蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系？？蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系？2、意義——理論上：蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)天然蛋白的缺陷生物進(jìn)化過(guò)程中，自然選擇了數(shù)量眾多、種類(lèi)各異的天然蛋白質(zhì)。天然蛋白質(zhì)在特定的條件下應(yīng)用，(適合于生物環(huán)境)改造蛋白的優(yōu)勢(shì)工業(yè)生產(chǎn)—高溫高壓條件，其結(jié)構(gòu)和功能改變，達(dá)不到理想的效果。 為了更好地發(fā)揮蛋白質(zhì)的作用，需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行人為改造。如：藥物、食品工業(yè)和污水處理中的酶、疫苗、生物傳感器等進(jìn)行蛋白分子設(shè)計(jì)改造，發(fā)揮良好的作用。如：經(jīng)改造穩(wěn)定性好的酶，可從價(jià)格便宜的棕櫚油中生產(chǎn)出價(jià)格昂貴的可可脂，創(chuàng)造很高的經(jīng)濟(jì)效益。2、意義——實(shí)踐上：蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)如：荷蘭一家公司設(shè)計(jì)了一種與漂白劑一同起作用的去污酶（對(duì)酶上兩個(gè)氨基酸修改，使這種酶具有較高抵抗力），在洗滌過(guò)程中不受破壞。如：醫(yī)學(xué)上，蛋白質(zhì)工程也具有廣泛的應(yīng)用前景。比如，用人工手段去改造蛋白質(zhì)，開(kāi)辟了診斷和治療癌癥的新途徑。 單鏈抗體—核素——免疫影像？ 單鏈抗體—毒素——免疫治療？我國(guó)的蛋白質(zhì)工程達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平，如：重組人胰島素和溶血栓藥物、重組人尿激酶等。對(duì)這些蛋白質(zhì)改造離不開(kāi)蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)。因此，蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)在生產(chǎn)實(shí)踐中具有重要意義蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)

二、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的分類(lèi)包括兩種分類(lèi)方式1、根據(jù)對(duì)蛋白質(zhì)改造的程度分為三類(lèi)第一類(lèi)為“小改”，即通過(guò)定位突變或化學(xué)修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)；第二類(lèi)為“中改”，即不同蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行拼接組裝，改變蛋白質(zhì)的功能特性的方法；——如：蛋白質(zhì)融合技術(shù)實(shí)現(xiàn)第三類(lèi)為“大改”，即全新設(shè)計(jì)具有特定功能的蛋白質(zhì)——仿生2、根據(jù)改造對(duì)象分為兩類(lèi)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)全新蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)3、兩種分類(lèi)方法是統(tǒng)一的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)

三、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)理解（一級(jí)結(jié)構(gòu)—高級(jí)結(jié)構(gòu)—功能的關(guān)系）——蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)理解結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ)——蛋白質(zhì)獨(dú)特的性質(zhì)和功能是其特定結(jié)構(gòu)的反映。1、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)（理解2點(diǎn)）每一種天然蛋白質(zhì)生物學(xué)活性，決定于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)20種aa各具特殊的側(cè)鏈，側(cè)鏈基團(tuán)的理化性質(zhì)和空間排布各不相同，可形成多種多樣的空間結(jié)構(gòu)，具有不同生物學(xué)活性。一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，蛋白質(zhì)功能和活性存在差異，甚至完全不同。每種蛋白質(zhì)具有特定的結(jié)構(gòu)，執(zhí)行其特定的功能甚至一級(jí)結(jié)構(gòu)上個(gè)別aa變化→特定功能的喪失或改變。最經(jīng)典的例子：鐮刀型紅細(xì)胞貧血病，即患者Hb2條β鏈第6位Glu→Val蛋白酶：個(gè)別aa突變（關(guān)鍵aa），酶活性喪失*要求：查找一級(jí)結(jié)構(gòu)中個(gè)別氨基酸突變蛋白，功能改變的實(shí)例蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)2、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)直接決定蛋白質(zhì)的功能一級(jí)結(jié)構(gòu)不能完全了解蛋白質(zhì)分子的生物學(xué)活性和理化性質(zhì)多肽鏈并非呈線(xiàn)形伸展，而是折疊和盤(pán)曲構(gòu)成特有的穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性和理化性質(zhì)主要決定于空間結(jié)構(gòu)的完整性 ？去折疊——變性，一級(jí)結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變—功能完全喪失—空間結(jié)構(gòu)的作用 ？蛋白質(zhì)去折疊的方法——物理、化學(xué)因子蛋白的性質(zhì)和功能，很難僅用蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的排列順序來(lái)解釋理解蛋白空間結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系對(duì)蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)才是最重要的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)——高級(jí)結(jié)構(gòu)——功能關(guān)系，是蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)面臨的挑戰(zhàn)雖然解析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)逐年增加，但依然無(wú)法滿(mǎn)足蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的需要？現(xiàn)有蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)大多數(shù)主要依據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)?！淮涡猿晒Φ陌盐蘸苄?？蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)四、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的流程蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)——龐大工程蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)程序構(gòu)建原蛋白質(zhì)模型建立和優(yōu)化突變體模型獲得蛋白質(zhì)的突變體結(jié)構(gòu)和功能分析驗(yàn)證新的結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)通常，需要幾次循環(huán)才能達(dá)到目的蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)流程需要計(jì)算機(jī)專(zhuān)家、X射線(xiàn)晶體學(xué)家、蛋白質(zhì)化學(xué)家、生物技術(shù)專(zhuān)家相互配合需要理論設(shè)計(jì)和試驗(yàn)過(guò)程相結(jié)合，才能達(dá)到改造蛋白質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)1、設(shè)計(jì)構(gòu)建蛋白質(zhì)突變體模型收集素材——構(gòu)建原蛋白質(zhì)模型：掌握和了解蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)、功能域，理化特性、 結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系、以及同源蛋白的相關(guān)信息。數(shù)據(jù)來(lái)源：查閱文獻(xiàn)和相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)于已知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，同源建模法或直接構(gòu)建模型。未知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，要么先解析其晶體結(jié)構(gòu)，要么根據(jù)已知的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。設(shè)計(jì)突變體——建立突變體模型——借鑒現(xiàn)有的經(jīng)驗(yàn)（規(guī)則）改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)：優(yōu)化蛋白的穩(wěn)定性、抗氧化性、對(duì)重金屬穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、酶學(xué)性質(zhì)如：Hartley等（1986年）完成有關(guān)蛋白質(zhì)一些重要性質(zhì)的設(shè)計(jì)目標(biāo)及解決辦法表具有一定的參考價(jià)值。（Next）考慮不同氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響（第七講結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)）Chou和Fasman對(duì)29種蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)：a—螺旋最強(qiáng)生成者：Glu、Met、Ala、Leu；最強(qiáng)破壞者：Gly、Pro；β-折疊最強(qiáng)生成者：Gly、Ala、Ser；β-轉(zhuǎn)角最強(qiáng)生成者：Gly、Pro、Asp、Ser；最強(qiáng)破壞者：Ile、Val、Leu。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)重要性質(zhì)設(shè)計(jì)目標(biāo)及解決辦法

設(shè)計(jì)目標(biāo)

解決辦法Hartleyetal.（1986）思考：為什么能改善蛋白性質(zhì)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)2、建立和優(yōu)化突變體模型（能量?jī)?yōu)化以及蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)分析）利用能量?jī)?yōu)化以及蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)分析的方法——預(yù)測(cè)修飾后的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)將預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)與原始蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)比較利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)—功能或結(jié)構(gòu)—穩(wěn)定性相關(guān)知識(shí)預(yù)測(cè)新蛋白可能具有的性質(zhì)和功能蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)3、獲得蛋白質(zhì)突變體蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)僅停留在理論層面上，沒(méi)有試驗(yàn)證據(jù)，這種設(shè)計(jì)是沒(méi)有任何意義的。根據(jù)設(shè)計(jì)，合成蛋白質(zhì)，或改造蛋白質(zhì)突變體的基因序列，表達(dá)突變體蛋白，然后分離、純化得到所要求的蛋白質(zhì)。獲得突變體的方法和手段（詳見(jiàn)：蛋白質(zhì)純化與克隆修飾）分子生物學(xué)方法：獲得基因、定點(diǎn)突變、導(dǎo)入宿主細(xì)胞、表達(dá)基因的產(chǎn)物—蛋白質(zhì)分離純化：采用分離純化的方法—分離突變蛋白質(zhì)—測(cè)試→蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)4、結(jié)構(gòu)和功能分析——蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的流程對(duì)純化的蛋白質(zhì)突變體進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的分析和測(cè)試，與原蛋白質(zhì)比較，是否達(dá)到預(yù)期改造的目的。若得到的蛋白質(zhì)突變體沒(méi)有實(shí)現(xiàn)預(yù)期的功能，則需要重新設(shè)計(jì)和改造；若達(dá)到預(yù)期，則獲得一種具有特定功能的新蛋白。

蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)是一門(mén)試驗(yàn)性科學(xué)，是理論設(shè)計(jì)過(guò)程與實(shí)驗(yàn)過(guò)程相結(jié)合的產(chǎn)物。理論設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)過(guò)程兩部分相輔相成，才構(gòu)成了蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的全過(guò)程。再深入理解：（符合認(rèn)識(shí)論的過(guò)程——實(shí)踐—認(rèn)識(shí)—再實(shí)踐—再認(rèn)識(shí)的過(guò)程）學(xué)習(xí)與知識(shí)（知—識(shí)）的應(yīng)用過(guò)程（掌握規(guī)律、利用規(guī)律、改造自然、做自然的主人）遇到問(wèn)題、思考問(wèn)題、采取對(duì)策、解決問(wèn)題的過(guò)程做一個(gè)實(shí)驗(yàn)：設(shè)計(jì)—實(shí)驗(yàn)—再設(shè)計(jì)—再實(shí)驗(yàn)任何事情：僅僅停留在理論層面上是毫無(wú)意義的!認(rèn)識(shí)具有能動(dòng)性意識(shí)對(duì)物質(zhì)具有反作用只要精神不滑坡，辦法總比問(wèn)題多體會(huì)——深刻理解：試驗(yàn)性科學(xué)=理論設(shè)計(jì)+實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)（一）獲得原蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能信息 一級(jí)和高級(jí)結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域、同源蛋白、基因、理化性質(zhì)

（二）建立原蛋白分子的結(jié)構(gòu)模型（原蛋白結(jié)構(gòu)模型）模型來(lái)源：PDB或文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)測(cè)試三維結(jié)構(gòu)—衍射、NMR……預(yù)測(cè)：如：同源蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

（三）結(jié)構(gòu)模型信息分析結(jié)構(gòu)特點(diǎn)——模體——結(jié)構(gòu)域功能活性區(qū)域及分布影響因素二硫鍵數(shù)目和位置（四）選擇設(shè)計(jì)目標(biāo)（依據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)） （確定突變位點(diǎn)或序列，功能區(qū)二硫鍵數(shù)目和位置）五、設(shè)計(jì)思路（9個(gè)步驟）蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)（五）突變體（序列）設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)的原則

1.充分考慮氨基酸的極性，以利于形成特定的空間結(jié)構(gòu)

α-螺旋（LeuGlu），β-折疊（ValIle），β-轉(zhuǎn)角（ProGlyAsn) 2.充分考慮氨基酸的排列順序，以利于形成次級(jí)鍵構(gòu)成空間結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的基本方法（下周詳細(xì)講述）序列最簡(jiǎn)化法：少數(shù)幾個(gè)氨基酸設(shè)計(jì)的序列，往往具有一定的對(duì)稱(chēng)性和周期性，從而減少設(shè)計(jì)的復(fù)雜性，并能檢測(cè)到一些蛋白質(zhì)折疊的規(guī)律和方式。模板組裝合成法：將各種二級(jí)結(jié)構(gòu)片段通過(guò)共價(jià)鍵連接到一個(gè)剛性的模板分子上，形成一定的三級(jí)結(jié)構(gòu)。繞過(guò)了蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基來(lái)研究蛋白質(zhì)中長(zhǎng)程作用力，是研究蛋白質(zhì)折疊和進(jìn)行蛋白質(zhì)全新設(shè)計(jì)規(guī)律摸索的有效手段。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)（六）構(gòu)建和預(yù)測(cè)突變體模型→初步檢驗(yàn)→修正設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)模型二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法：依據(jù)信息論和概率統(tǒng)計(jì)（ChouFasman法；Garnier方法；Cohen方法）三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法和構(gòu)象搜索方法：依據(jù)基團(tuán)之間相互作用的能量最低原理研究者具備的素質(zhì)：硬件（計(jì)算機(jī)軟件、高質(zhì)量立場(chǎng)）；軟件（結(jié)構(gòu)化學(xué)、物化和背景知識(shí)）；專(zhuān)業(yè)知識(shí)（七）獲得新設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)（合成新設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)）多肽化學(xué)合成法（固相合成技術(shù)）獲得新蛋白質(zhì)基因工程手段：PCR等基因操作-構(gòu)建突變體-表達(dá)-分離純化-新蛋白質(zhì)。（八）新蛋白質(zhì)的檢驗(yàn)是否有多聚態(tài)？是否與設(shè)計(jì)吻合？是否有三級(jí)結(jié)構(gòu)？功能活性？（九）完成新蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)反復(fù)設(shè)計(jì)—反復(fù)修改——反復(fù)試驗(yàn)→達(dá)到預(yù)期目標(biāo)紙上談兵成本低廉蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)本節(jié)小結(jié)1、蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)：通過(guò)蛋白質(zhì)模型和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)來(lái)構(gòu)建具有新功能的蛋白質(zhì)2、分子設(shè)計(jì)分類(lèi)：根據(jù)對(duì)蛋白質(zhì)改造的程度、根據(jù)改造對(duì)象分為兩類(lèi)不同，蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)分為三類(lèi)3、掌握蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的程序 建?！鷥?yōu)化→獲得突變體→結(jié)構(gòu)和功能分析4、掌握蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)思路（試驗(yàn)性科學(xué)=理論設(shè)計(jì)+實(shí)驗(yàn)過(guò)程）獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能信息建立分子設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)模型結(jié)構(gòu)模型信息分析選擇設(shè)計(jì)目標(biāo)突變序列設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)結(jié)果→初步檢驗(yàn)正確度→修正設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)模型獲得新蛋白質(zhì)（合成新設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)）新蛋白質(zhì)的檢驗(yàn)新一輪蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)第二節(jié)部分氨基酸的突變部分氨基酸的突變——又稱(chēng)“小改”，是基于對(duì)已知蛋白質(zhì)的局部改造。是目前蛋白質(zhì)工程中使用最廣泛的方法。思路：設(shè)計(jì)目標(biāo)分子→基因序列或cDNA序列→定點(diǎn)突變→載體系統(tǒng)→宿主細(xì)胞表達(dá)→特定改變的蛋白質(zhì)分子→突變體與野生型蛋白性質(zhì)比較目的：改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)和提高蛋白質(zhì)活性蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、增加活性、減少副作用、提高專(zhuān)一性闡明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系關(guān)鍵的問(wèn)題：如何恰當(dāng)?shù)剡x擇要突變的位點(diǎn)（aa殘基）。解決問(wèn)題的手段：通過(guò)蛋白分子設(shè)計(jì)——分析蛋白質(zhì)中殘基的性質(zhì)，借助于已有的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)或分子模型分析。（詳見(jiàn)以下五方面闡述）蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)部分氨基酸改造——從以下五方面選擇“突變”位點(diǎn)

——針對(duì)不同的情況和目的，采取5種不同的改造方法根據(jù)結(jié)構(gòu)信息確定突變的位點(diǎn)（堿基）隨機(jī)突變?nèi)笔蛔兒徒宇^分區(qū)突變根據(jù)蛋白質(zhì)的同源性確定功能殘基選擇翻譯后修飾位點(diǎn)突變蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)一、根據(jù)結(jié)構(gòu)信息確定突變位點(diǎn)已知高級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白：（X射線(xiàn)晶體或NMR譜高分辨率）根據(jù)氨基酸殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的位置來(lái)推測(cè)其功能。如果已知蛋白質(zhì)及其配基復(fù)合體的結(jié)構(gòu)（包括受體、底物、輔酶和抑制劑），——掌握了活性部分，對(duì)這些aa改造，這種方法則更有效。Why？與配基相互作用（形成氫鍵、離子鍵或疏水作用）的aa殘基，根據(jù)其與配基基團(tuán)的距離和取向而確定——突變哪個(gè)aa。用定點(diǎn)突變的方式替換這些殘基，驗(yàn)證這些殘基是否參與結(jié)合。這種方法是理解和證明——酶專(zhuān)一性和催化活性——基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)二、隨機(jī)突變什么是？物理和化學(xué)誘變劑（射線(xiàn)照射、化學(xué)試劑）—突變株—如：E.coli定向進(jìn)化技術(shù)？——體外隨機(jī)突變技術(shù)優(yōu)勢(shì)：能非常容易地產(chǎn)生大量突變體。分析原則：—突變分析真正有功能的保守的氨基酸不能忍受各種類(lèi)型的突變。如果突變，僅蛋白分子發(fā)生了結(jié)構(gòu)的改變，沒(méi)有破壞蛋白質(zhì)的功能，則該突變位點(diǎn)的殘基對(duì)結(jié)構(gòu)和功能的維系可能不是很重要的。突變分析的目的：對(duì)突變蛋白分子進(jìn)行分析，確定突變位點(diǎn)和功能的關(guān)系突變體制備缺乏控制，制備和分析大量突變體，才能獲得可解釋的數(shù)據(jù)如：不同位置上的氨基酸殘基的幾種不同的替換，究竟哪一個(gè)是特異性的替換——特異性地影響蛋白功能獲得新的優(yōu)良性質(zhì)的蛋白質(zhì)——掌握新蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系缺點(diǎn)：需要獲得大量的分析突變體，才能解釋究竟哪一個(gè)突變是特異性。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)

三、缺失突變分析和接頭分區(qū)突變用能識(shí)別序列中多個(gè)位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶消化基因，并分離各個(gè)片段。為了產(chǎn)生分散的缺失，在重新連接之前用外切核酸酶消化線(xiàn)性DNA。為了產(chǎn)生分散的插入，可以將合成DNA的小片段（接頭）連接到切割位點(diǎn)上。通過(guò)重疊PCR方法，分別導(dǎo)入基因中缺失突變？基因中缺失1個(gè)或幾個(gè)堿基造成的突變。接頭分區(qū)突變？在整個(gè)基因各個(gè)位置上插入小量的核苷酸，觀察蛋白質(zhì)功能。用途：快速確定——基因編碼序列長(zhǎng)度；功能上重要的結(jié)構(gòu)域。操作方法：利用經(jīng)典的重組DNA技術(shù)，在體外很容易地構(gòu)建。操作原理：轉(zhuǎn)座子誘變也是其中的一種方式蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)舉例：基因調(diào)節(jié)區(qū)DNA序列重要元件的定位。如：HIV逆轉(zhuǎn)錄酶p66亞基（包括兩個(gè)更小的亞基p51和p15），兩個(gè)小亞基有什么作用呢？用接頭插入突變分析。聚合酶功能位于N端，編碼p51亞基，RNaseH功能則位于C端，編碼pl5亞基。鑒定鼠和人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子

(GM-CSF)關(guān)鍵的活性區(qū)域。突變目的：了解基因的長(zhǎng)度和不同區(qū)域的功能和作用快速掃描編碼序列的長(zhǎng)度并鑒定功能上重要的結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步以單一氨基酸替換的方法進(jìn)行更精細(xì)的分析。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)

四、利用蛋白質(zhì)的同源性確定功能殘基？：通過(guò)序列同源性比對(duì)分析，確定突變位點(diǎn)的方法。我們知道 每個(gè)殘基的功能信息，能夠通過(guò)比對(duì)分析不同種屬的同源蛋白質(zhì)的序列獲得。兩種假設(shè)——（用于定點(diǎn)突變技術(shù)分析蛋白質(zhì)）同源蛋白結(jié)構(gòu)域中：保守的殘基和非保守的殘基。保守殘基可能參與相同功能，或者在維持相同結(jié)構(gòu)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在同源蛋白質(zhì)中差異很大的殘基可能不重要，或者在蛋白質(zhì)分子識(shí)別方面發(fā)揮重要作用。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（假設(shè)）蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)1、保守殘基的突變——蛋白激酶家族基因分析，2個(gè)Asp完全保守，Brenner推測(cè)有重要作用，見(jiàn)下圖。酵母菌突變驗(yàn)證，Ala替換Asp。替換Asp210，kcat下降300倍，而與底物結(jié)合的Km值則不受影響。 推測(cè)Asp210在催化中發(fā)揮基本作用的殘基。替換Asp228，活性完全喪失。突變了118個(gè)殘基，只有替換Asp228，活性的完全喪失，證明了個(gè)殘基的重要性。哺乳動(dòng)物cAMP儂賴(lài)的蛋白激酶晶體結(jié)構(gòu)的證據(jù)，與Brenner的推測(cè)一致。保守殘基的研究對(duì)理解關(guān)鍵氨基酸殘基與蛋白活性關(guān)系具有重要的意義Asp210Asp228p126蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)2、非保守殘基的突變?cè)诘鞍踪|(zhì)家族中，非保守的殘基與家族成員（包括種屬間的變種）的特異性有關(guān)，如：病毒的毒力。用定點(diǎn)突變方式進(jìn)行替換——獲得很多生物學(xué)活性的信息， 也可以獲得具有新特異性的突變體蛋白質(zhì)。舉例：脊髓灰質(zhì)炎病毒（2種型）：非毒型（I）和毒型（II）Ⅱ型誘發(fā)小鼠脊髓灰質(zhì)炎，I型對(duì)小鼠無(wú)毒性。Ⅱ型毒力喪失的突變體證明：90-105殘基負(fù)責(zé)Ⅱ型病毒對(duì)小鼠的毒力若將Ⅱ型的95-104殘基環(huán)區(qū)域轉(zhuǎn)移到無(wú)毒力的I型毒株中，雜合I型毒株表現(xiàn)出對(duì)小鼠的毒力，表明：脊髓灰質(zhì)炎病毒識(shí)別鼠細(xì)胞受體，環(huán)區(qū)發(fā)揮重要作用。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)創(chuàng)新設(shè)計(jì)五、翻譯后修飾位點(diǎn)突變?yōu)槭裁匆M(jìn)行翻譯后修飾位點(diǎn)的突變？Protein很多翻譯后修飾，（如：磷酸化、糖基化、?；?、羧基化、甲基化