實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)

關(guān)于實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)第1頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要連接形式。2、了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理。3、學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。第2頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三1.雙縮脲反應(yīng)2.茚三酮反應(yīng)3.黃色反應(yīng)4.考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)第3頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三呈色反應(yīng)1、雙縮脲反應(yīng)（1）原理：尿素加熱至180oC左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性條件下能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應(yīng)（二肽和氨基酸都不能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)）?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定性或定量測定。反應(yīng)式如下：第4頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三第5頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三

雙縮脲反應(yīng)不僅為含有兩個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)所有，-CH2-NH2,-CS-NH2,-CHR-NH2,-CH2-NH2-CH-NH2-CH2-OH或-CHOHCH2NH2等基團(tuán)的物質(zhì)以及乙二酰二胺等物質(zhì)也有此反應(yīng)。NH3也干擾此反應(yīng)，因?yàn)镹H3與Cu2+可生成暗藍(lán)色的絡(luò)離子Cu（NH3）42+。因此，一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。第6頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三（2）試劑①尿素，②10%氫氧化鈉溶液，③1%硫酸銅溶液，④改為蛋清溶液：水=1：9（3）操作取少量尿素結(jié)晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時(shí)，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加10%氫氧化鈉溶液約1mL，振蕩混勻，再加1%硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。要避免添加過量硫酸銅，否則，生成的藍(lán)色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。（由于雜質(zhì)以及氨氣的干擾，導(dǎo)致顏色不都是紫紅色）向另一試管加蛋清溶液：水=1：9約1mL和10%氫氧化鈉溶液約2mL，搖勻，再加1%硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖。觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。第7頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三2、茚三酮反應(yīng)(1)原理蛋白質(zhì)、多肽和各種氨基酸以及所有氨基酸均能發(fā)生該反應(yīng)，除無α-氨基的脯氨酸和羥脯氨酸呈黃色反應(yīng)外，其它均生成藍(lán)紫色化合物，最終生成藍(lán)色化合物。氨、β-丙氨酸和許多一級氨化合物都有此反應(yīng)。因此，雖然蛋白質(zhì)或氨基酸均有茚三酮反應(yīng)，但能與茚三酮反應(yīng)呈陽性反應(yīng)的不一定都是蛋白質(zhì)或氨基酸。該反應(yīng)的適宜的PH為5～7，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時(shí)甚至不顯色。第8頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三該反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化脫氨形成酮酸，酮酸脫羧成醛，放出CO2、NH3，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個(gè)水合茚三酮分子和氨縮合生成有藍(lán)色物質(zhì)。反應(yīng)機(jī)理如下：第9頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三第10頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三（2）試劑①蛋白質(zhì)溶液：新鮮雞蛋清溶液（蛋清：水=1：9），②0.5%甘氨酸，③0.1%茚三酮水溶液，④0.1%茚三酮-乙醇溶液。（3）操作①取兩支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和甘氨酸溶液1mL，再各加0.5mL0.1%茚三酮水溶液,混勻，在沸水浴中加熱1～2分鐘，觀察顏色由粉色變紫色再變藍(lán)色（pH不同顏色深淺不同）。②在一小塊濾紙上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，風(fēng)干后，再在原處滴一滴0.1%茚三酮-乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點(diǎn)的出現(xiàn)。第11頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三3、黃色反應(yīng)（1）原理含有苯環(huán)的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成深橙色的硝醌酸鈉。反應(yīng)式如下：多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以呈黃色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化，須加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。第12頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三（2）試劑①雞蛋清溶液（將新鮮雞蛋清用6層紗布過濾，然后按雞蛋清：水=1：20配制而成。②大豆提取液：將大豆浸泡充分吸脹后研磨成漿狀再用紗布過濾。③頭發(fā)。④指甲。⑤0.5%苯酚溶液。⑥濃硝酸。⑦0.3%色氨酸溶液。⑧0.3%酪氨酸溶液。⑨10%氫氧化鈉溶液。（3）操作向7個(gè)試管中分別按下表加入試劑，觀察各管出現(xiàn)的現(xiàn)象，有的試管反應(yīng)慢可略放置或用微火加熱。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴加入10%氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化（1～4管可能需要加熱）。第13頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三第14頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三4、考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)（1）原理考馬斯亮藍(lán)G250（R250）具有紅色和藍(lán)色兩種色調(diào)。在酸性溶液中，其以游離態(tài)存在呈棕紅色；當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色。它染色靈敏度高，比氨基黑高3倍。反應(yīng)速度快，約在2分鐘左右時(shí)間達(dá)到平衡，在室溫一小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。在0.01～1.0mg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與A595nm值成正比。所以常用來測定蛋白質(zhì)含量。第15頁，講稿共17頁，2023年5月2日，星期三（2）試劑①蛋白質(zhì)溶液（雞蛋清：水=1：20配制而成）。②考馬斯亮藍(lán)溶液：考馬斯亮藍(lán)G250100ｍg溶于50mL95%乙醇中，加100mL85%磷酸混勻，配成原液。臨用前取