兔頸靜脈動(dòng)脈化后血管的重塑機(jī)制

兔頸靜脈動(dòng)脈化后血管的重塑機(jī)制【摘要】目的：建立兔頸動(dòng)脈靜脈橋旁路移植模型，觀察不同時(shí)期靜脈橋病理改變及PCNA，αactin表達(dá)和檢測(cè)細(xì)胞凋亡，探討移植靜脈重塑機(jī)制.方法：家兔30只，將一側(cè)頸總動(dòng)脈與頸外靜脈分別游離后，行頸總動(dòng)脈與頸外靜脈側(cè)側(cè)吻合，結(jié)扎頸外靜脈兩吻合口外側(cè)及頸總動(dòng)脈吻合口中部，使動(dòng)脈血經(jīng)頸外靜脈橋通過(guò)，于術(shù)后不同時(shí)間段取靜脈橋行HE及彈力纖維染色，定量分析血管壁內(nèi)膜、中膜厚度，觀察PCNA，αactin表達(dá)和細(xì)胞凋亡情況.結(jié)果：30只家兔全部存活，靜脈橋全部保持通暢；病理所見靜脈橋血管壁增厚、血管內(nèi)膜及中膜均明顯增生，術(shù)后2~4wk內(nèi)膜增生達(dá)高峰，且厚度不均勻，中膜、內(nèi)膜均有PCNA陽(yáng)性表達(dá)，內(nèi)膜出現(xiàn)αactin陽(yáng)性表達(dá)，術(shù)后1wk血管內(nèi)膜及中膜開始出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，術(shù)后4wk達(dá)高峰.結(jié)論：兔頸靜脈動(dòng)脈化后靜脈血管管壁呈不均一性增厚，早期以血管內(nèi)膜增生為主，中膜血管平滑肌細(xì)胞增殖并向內(nèi)膜遷移，細(xì)胞凋亡可能參與血管橋重塑.

【關(guān)鍵詞】靜脈移植；細(xì)胞凋亡；模型，動(dòng)物

0引言

靜脈血管作為血管橋材料在冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)中具有重要作用，但血管的再狹窄一直是困擾靜脈移植的難題，影響冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)的近遠(yuǎn)期療效.為了研究靜脈血管動(dòng)脈化后的改變，我們建立了兔頸動(dòng)脈靜脈旁路移植模型，對(duì)靜脈血管移植于動(dòng)脈后不同時(shí)間段的病理改變進(jìn)行觀察，通過(guò)血管壁PCNA,αactin表達(dá)和細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，初步探討靜脈血管重塑的機(jī)制.

1材料和方法

材料健康家兔36只由沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)外科提供，雌雄不拘，體質(zhì)量kg.10g/L戊巴比妥鈉耳緣iv麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái).術(shù)前iv青霉素30kU/kg.隨機(jī)分為6組，每組6只，其中5組為實(shí)驗(yàn)組,1組為對(duì)照組.實(shí)驗(yàn)組在麻醉狀態(tài)下分別于術(shù)后3d,1,2,4,8wk取血管橋.

方法麻醉后將家兔仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，頸部脫毛備皮，取頸正中切口，長(zhǎng)約5cm，切開皮膚及皮下結(jié)締組織，首先在胸骨乳突肌內(nèi)緣，分離胸骨舌骨肌與胸骨甲狀肌之間的結(jié)締組織，沿肌縫即找到頸總動(dòng)脈，鈍性游離，順血管神經(jīng)束內(nèi)神經(jīng)和血管的行走方向分離出頸總動(dòng)脈，長(zhǎng)約cm，在動(dòng)脈下面引過(guò)2根絲線，輕輕提起顯露頸總動(dòng)脈；然后在頸部皮下胸骨乳突肌外緣尋找到頸外靜脈，沿血管走行方向，將頸外靜脈周圍的結(jié)締組織輕輕分離，上至上頜外靜脈與上頜內(nèi)靜脈分叉處，下至胸骨水平，結(jié)扎各分支，游離頸外靜脈長(zhǎng)約cm，在靜脈下面引過(guò)2根絲線，輕輕提起，在胸骨乳突肌前與頸總動(dòng)脈平行并攏.靜脈注射肝素鈉，全身部分肝素化，將靜脈遠(yuǎn)近兩端結(jié)扎，動(dòng)脈遠(yuǎn)近兩端置無(wú)創(chuàng)血管夾，將動(dòng)靜脈平行并攏，兩端血管對(duì)應(yīng)處分別切長(zhǎng)約3mm縱切口，用80Prolene線連續(xù)縫合，行動(dòng)靜脈側(cè)側(cè)吻合，吻合好后排氣，恢復(fù)血流，然后將動(dòng)脈兩吻合口中部結(jié)扎，使動(dòng)脈血流自靜脈橋通過(guò)，確定血流通暢，徹底止血后縫合頸部切口.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉恢復(fù)后送動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng).肌肉注射青霉素預(yù)防感染，連續(xù)3d.于術(shù)后3d,1,2,4,8wk取血管橋標(biāo)本，麻醉后沿原切口顯露移植的靜脈橋，用40g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成5μm切片，常規(guī)脫蠟至水，行HE染色和彈力纖維染色，光鏡下觀察移植后內(nèi)膜的動(dòng)態(tài)變化.日本產(chǎn)LuzexF顯微圖像分析系統(tǒng)分析血管壁內(nèi)膜及中膜厚度.

免疫組化染色標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后切片，片厚5μm，常規(guī)脫蠟至水，以αactin，PCNA單克隆抗體常規(guī)SABC染色，蘇木精復(fù)染.每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取4個(gè)部位，計(jì)算每個(gè)高倍鏡視野下PCNA陽(yáng)性細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù)，取平均數(shù)計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù).細(xì)胞增殖指數(shù)=PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100.

凋亡細(xì)胞的檢測(cè)標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后切片，片厚5μm，常規(guī)脫蠟至水，以TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，檢測(cè)方法嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行.每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取4個(gè)部位，計(jì)算每個(gè)高倍鏡視野下TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù)，取平均數(shù)計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù).細(xì)胞凋亡指數(shù)=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2結(jié)果

移植靜脈的組織病理學(xué)變化所有家兔全部成活，無(wú)意外死亡，大體標(biāo)本觀察移植靜脈橋全部保持通暢，管腔擴(kuò)張，靜脈橋管壁不同程度增厚.正常靜脈內(nèi)膜僅覆蓋單層內(nèi)皮細(xì)胞,中膜很薄,由2~3層血管平滑肌細(xì)胞及少量膠原組成.術(shù)后3d靜脈橋管腔擴(kuò)大，內(nèi)皮細(xì)胞部分脫落，中膜彈性纖維無(wú)明顯增多，未見明顯新生內(nèi)膜；術(shù)后1wk局部新生內(nèi)膜形成，不連續(xù)，內(nèi)皮細(xì)胞稀少，中膜彈性纖維增多，術(shù)后2wk內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋絕大部分內(nèi)膜，新生內(nèi)膜進(jìn)一步增厚，中膜彈性纖維明顯增多，術(shù)后4wk內(nèi)皮細(xì)胞完全修復(fù)，內(nèi)膜繼續(xù)增厚，且呈局灶性，厚薄不均一，內(nèi)見彈性纖維及膠原沉積，增生內(nèi)膜中可見大量泡沫細(xì)胞；術(shù)后8wk內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，內(nèi)膜厚度減小，厚薄均一，彈性纖維增多增粗，分布于內(nèi)膜深層，中膜繼續(xù)增厚

A:正常靜脈移植；B:1wk；C:4wk；D:8kw.

圖2兔頸靜脈動(dòng)脈化后光鏡下血管壁變化HE×400

免疫組化及細(xì)胞凋亡分析術(shù)后3d中膜PCNA及αactin染色陽(yáng)性；術(shù)后1wk中膜和新生內(nèi)膜αactin染色陽(yáng)性細(xì)胞增多，可見少量凋亡細(xì)胞；術(shù)后2wk新生內(nèi)膜PCNA陽(yáng)性率最高，αactin染色加深；術(shù)后4wkPCNA陽(yáng)性細(xì)胞減少，凋亡細(xì)胞增多并達(dá)到高峰；術(shù)后8wkPCNA陽(yáng)性率降低，細(xì)胞凋亡率降低(表2).

表1移植靜脈內(nèi)膜、中膜厚度和I/M比值的動(dòng)態(tài)變化

vs對(duì)照,vs1wk.

表2移植靜脈內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞增殖指數(shù)及凋亡指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化

vs對(duì)照,vs1wk.

3討論

靜脈作為動(dòng)脈移植物后發(fā)生一系列變化，包括內(nèi)膜增厚、外膜纖維化、內(nèi)1/3中膜缺乏、彈力纖維缺失等［1］.研究靜脈血管動(dòng)脈化后的改變，有多種動(dòng)物模型嘗試，有作者應(yīng)用犬行冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)［2］，接近臨床冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)模式，但操作復(fù)雜，費(fèi)用高，犬不易成活，而且犬冠狀動(dòng)脈存在大量的側(cè)支循環(huán)，不易判斷手術(shù)效果.有作者應(yīng)用兔頸靜脈橋與頸動(dòng)脈做端端吻合［3］，因靜脈壁特別薄，切斷后吻合困難.本實(shí)驗(yàn)建立的動(dòng)物模型，行頸部動(dòng)靜脈側(cè)側(cè)吻合，操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用小，重復(fù)性好，血流通過(guò)靜脈橋時(shí)局部有血液湍流存在，符合臨床冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)靜脈橋內(nèi)血液流體力學(xué)要求，對(duì)血管橋內(nèi)皮損傷小，發(fā)生血栓機(jī)率小，可行性好，可替代臨床進(jìn)行CABG術(shù)后靜脈橋近期及遠(yuǎn)期通暢率干預(yù)性研究.頸外靜脈無(wú)靜脈瓣，無(wú)需將靜脈倒轉(zhuǎn)，30例實(shí)驗(yàn)無(wú)血流受阻現(xiàn)象發(fā)生.

我們觀察不同時(shí)間段血管橋病理改變，見術(shù)后1wk靜脈橋血管壁增厚，內(nèi)膜及中膜均明顯增厚，中膜彈性纖維增多，術(shù)后2~4wk內(nèi)膜增厚達(dá)高峰，且不均勻，中膜、內(nèi)膜均有PCNA陽(yáng)性表達(dá)，內(nèi)膜出現(xiàn)αactin陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，說(shuō)明中膜平滑肌細(xì)胞增生，遷移至內(nèi)膜，參與新內(nèi)膜形成，使內(nèi)膜增厚，此期血管內(nèi)膜結(jié)構(gòu)疏松，可能是平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谛停置诖罅考?xì)胞外基質(zhì)［2］.術(shù)后4wk增生內(nèi)膜中可見大量泡沫細(xì)胞，可能是晚期形成血管粥樣硬化的潛在因素.術(shù)后8wk血管內(nèi)膜結(jié)構(gòu)致密，中膜彈性纖維明顯增多，排列整齊.術(shù)后1wk中膜和新生內(nèi)膜可見少量凋亡細(xì)胞，術(shù)后4wk凋亡細(xì)胞增多并達(dá)到高峰，術(shù)后8wk細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞凋亡可能參與血管重塑.

【參考文獻(xiàn)】

［1］胡盛壽，黃方炯.冠心病外科治療學(xué)［M］.冠狀動(dòng)脈移植術(shù)后移植血管病變及其診治.北京：科學(xué)出版社，2003:440-458.

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