基因工程疫苗GeneticEngineering課件

基因工程疫苗

GeneticEngineeringVaccine疫苗1976年E.Jenner從擠奶女工感染的痘皰中獲取皰漿，接種接種8歲男孩J.Phipps

的手臂上，結(jié)果男孩未感染上天花1798年醫(yī)學(xué)界正式承認(rèn)疫苗1980年世界衛(wèi)生組織宣布全球消滅天花疫苗：一切通過注射和粘膜途徑接種，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對特定致病原的特異性抗體或細(xì)胞免疫，從而使機(jī)體獲得保護(hù)或消滅該致病原能力的生物制品，包括蛋白質(zhì)、多糖、核酸、活載體或感染因子等。疫苗種類傳統(tǒng)疫苗滅活苗弱毒苗亞單位疫苗新型疫苗基因工程亞單位疫苗基因缺失活疫苗基因工程活載體疫苗核酸疫苗疫苗的基本成分抗原=疫苗佐劑：鋁制佐劑、油制佐劑防腐劑：硫柳汞、2-苯氧乙醇、氯仿穩(wěn)定劑：乳糖、明膠、山梨醇滅火劑：物理法：加熱、紫外線；化學(xué)法：丙酮、酚、甲醛疫苗的基本特性安全性：是否致弱？是否反毒？滅活是否徹底？是否污染？免疫原性：免疫效果，抗體滴度，持續(xù)時(shí)間，接種次數(shù)穩(wěn)定性：生物穩(wěn)定性，物理穩(wěn)定性傳統(tǒng)疫苗滅活苗的研制方法1、物理滅活 熱滅活：56-57C一小時(shí) 紫外線滅活：最大限度保留抗原的完整性和免疫原性2、化學(xué)滅活 福爾馬林：濃度、溫度、時(shí)間和pH Beta-丙內(nèi)酯：作用核酸，保持免疫原性，水解產(chǎn)物丙酮酸對人體無害，但是有致癌作用，對疫苗產(chǎn)生人員有害。

乙烯亞胺和雙乙烯亞胺：原理與Beta-丙內(nèi)酯相同，但未發(fā)現(xiàn)致癌作用，被廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)疫苗弱毒苗研制方法1、自然弱毒：如雞新城疫LaSota；馬立克氏病CV19882、異源免疫：Jenner以牛痘病毒預(yù)防天花；火雞皰疹病毒預(yù)防馬立克氏病。3、在異源動(dòng)物或細(xì)胞上傳代致弱：豬瘟兔化弱毒株是將豬瘟病毒在兔體多次傳代致弱而獲得的；驢白細(xì)胞傳代致弱的馬傳染性貧血疫苗；乳兔肺致弱的豬支原體性肺炎疫苗等。4、改變體外培養(yǎng)條件：改變溫度、加入誘變劑、射線處理，如在加有醋酸鉈的培養(yǎng)基中分離的抗醋酸鉈的豬副傷寒沙門氏菌和馬流產(chǎn)沙門氏菌的弱毒苗?；蚬こ桃呙缫?、合成多肽疫苗及制劑合成多肽疫苗（SyntheticPeptideVaccine）：是用化學(xué)方法合成的病源微生物的保護(hù)性多肽并將其連接到大分子載體上，再加入佐劑制成的疫苗。如丙肝病毒外膜蛋白E2內(nèi)篩選出一段多肽，可刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體。 從蛇毒分離出一個(gè)13肽（IKAIAALAKKLL），其對革蘭氏陰性和陽性菌均有極強(qiáng)的殺菌能力。二、亞單位疫苗優(yōu)點(diǎn)：安全性好 無熱源、變應(yīng)原、免疫抑制源 與感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相區(qū)別研究亞單位疫苗的策略： 確定保護(hù)性基因，如雞傳染性支氣管炎病毒的S基因；輪狀病毒的Vp7和Vp4基因；愛滋病病毒gp120抗原表達(dá)系統(tǒng)： 原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)三、基因缺失疫苗（Deletionmutantvaccine）定義：將病毒致病基因進(jìn)行缺失，從而獲 得弱毒疫苗優(yōu)點(diǎn)：毒力穩(wěn)定、返祖機(jī)率小、免疫力強(qiáng)、 免疫期短。實(shí)例:

偽狂犬病毒TK基因缺失使病毒致弱而 獲得。1986年獲得美國FDA批準(zhǔn)的第一 個(gè)基因工程苗。四、重組活載體疫苗（一）重組病毒載體1、重組禽痘病毒(FowlPoxvirus)載體疫苗:宿主范圍廣、滴度高、穩(wěn)定性好、基因容量大、非必需基因多，已經(jīng)成功地應(yīng)用于表達(dá)禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和馬立克氏病病毒的保護(hù)性抗原基因。2、腺病毒（Adnovirus）載體疫苗：安全、感染非分裂細(xì)胞、增殖滴度高、可在消化道和呼吸道繁殖，并能誘導(dǎo)粘膜免疫，可制成口服制劑預(yù)防消化道和呼吸 道感染。3、皰疹病毒（Herpesvirus）載體疫苗：基因組大（150kb)、容量大、宿主范圍窄，故安全、很多皰疹病毒經(jīng)粘膜感染，誘導(dǎo)粘膜免疫。已用于載體研究的病毒有：單純皰疹病毒、偽狂犬病毒、火雞皰疹病毒、牛皰疹病毒I型、馬皰疹病毒I型、傳染性支氣管炎等。（二）重組細(xì)菌載體優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)方便、外源基因容量大、刺激 細(xì)胞免疫力強(qiáng)，因?yàn)榧?xì)菌本身起到佐劑的 作用。常用的細(xì)菌載體：乳酸菌（Lacticacidbacteria),安全級微 生物，包括乳酸桿菌、乳酸球菌和雙歧桿菌。成功實(shí)列：表達(dá)破傷風(fēng)毒素片段C、布氏桿菌L7/L12蛋白。（三）構(gòu)建重組載體疫苗的原則1、載體的選擇：載體的安全性，一般來自疫苗株；載體的組織適性應(yīng)與表達(dá)的抗原一致；活載體對外源基因的容量。2、轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建：有足夠長的同源臂序列（800-1000bp)；有一個(gè)適當(dāng)?shù)膯?dòng)子。3、外源基因的插入位點(diǎn)的選擇：外源基因的插入不應(yīng)影響病毒或細(xì)菌的復(fù)制，即非必需基因。為降低毒力，可將外源基因插入到毒力基因。核酸疫苗定義：指將編碼某一抗原的外源基因直接導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中表達(dá)并合成抗原蛋白，激發(fā)機(jī)體一系列類似疫苗接種的免疫應(yīng)答，起到預(yù)防和治療的目的。核酸疫苗的特點(diǎn)1、在體內(nèi)表達(dá)的抗原保持天然構(gòu)型2、可構(gòu)建多價(jià)疫苗3、安全，無整合，無返祖4、制備簡單，降低成本5、便于運(yùn)輸核酸疫苗研究現(xiàn)狀1、人類核酸疫苗1993Ulmer將流感病毒NP基因cDNA克隆到真核表達(dá)載體，注射小鼠肌肉可誘導(dǎo)特異性IgG和CTL應(yīng)答；1993Wang等人將HIVgp120基因重組質(zhì)粒接種小鼠，產(chǎn)生特異性抗體，此抗體可中和HIV對體外培養(yǎng)細(xì)胞的感染。1994Davis等將乙型肝炎表面抗原克隆到真核表達(dá)載體，注射小鼠后，產(chǎn)生特異性抗體。2、獸醫(yī)核酸疫苗1993Cox等人將牛單純皰疹病毒I型（BHV-I）三種不同的和蛋白分別插入pPSVCAT表達(dá)載體中，注射天然宿主動(dòng)物后產(chǎn)生特異性中和抗體，對強(qiáng)度攻擊有保護(hù)效果。 此外對禽流感疫苗、偽狂犬病疫苗、豬流感疫苗、牛病毒性腹瀉疫苗、新城疫疫苗等得到廣泛應(yīng)用。核酸疫苗研發(fā)的一些問題1、核酸疫苗的結(jié)構(gòu)：⑴載體：啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和3端多聚A信號；⑵編碼抗原的基因2、接種方式：肌肉、皮下、腹腔和靜脈，基因槍接種效果最好。3、核酸疫苗免疫效果的影響因素：⑴啟動(dòng)子⑵DNA輸入組織的方式⑶佐劑，可考慮加入細(xì)胞因子如IL-2等4、核酸疫苗的安全性：DNA整合引起內(nèi)源性癌基因插入激活的可能性；產(chǎn)生抗DNA抗體的可能性。T細(xì)胞疫苗1、治療自身免疫病的T細(xì)胞疫苗 二種致病T細(xì)胞：引起自身免疫性疾病的T細(xì)胞和導(dǎo)致同種移植排斥的T細(xì)胞。將這些T細(xì)胞活化滅活作為疫苗，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對致病性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而減輕T細(xì)胞的致病作用。T細(xì)胞疫苗用于治療小鼠變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎已獲成功。T細(xì)胞疫苗治療人多發(fā)性硬化癥有一定效果。2、治療病毒性疾病的T細(xì)胞疫苗 用多肽在體外誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的CTL，經(jīng)克隆、擴(kuò)增、篩選和鑒定后，將MHC-I型CD8T細(xì)胞導(dǎo)入機(jī)體，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。樹突狀細(xì)胞疫苗（DendriticCellVaccine）樹突狀細(xì)胞：是專職抗原遞呈細(xì)胞（APC），能有效的將抗原遞呈給T細(xì)胞，從而誘導(dǎo)CTL活化，是誘發(fā)CTL抗腫瘤免疫反應(yīng)的核心步驟。荷載抗原的DC具有疫苗的功能，故稱為樹突狀細(xì)胞疫苗。荷載抗原既可以是病毒抗原，也可以是腫瘤細(xì)胞成分。1、腫瘤抗原和腫瘤細(xì)胞致敏的DC疫苗2、提純和重組的腫瘤抗原多肽或蛋白致敏的DC疫苗3、編碼腫瘤相關(guān)抗原和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染的DC疫苗4、其它類型的DC疫苗-腫瘤抗原特異性抗體致敏的DC疫苗腫瘤疫苗第一代腫瘤疫苗：整個(gè)腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞的提取液加入非特異性佐劑制成。第二代腫瘤疫苗：基因修飾的腫瘤細(xì)胞或重組的腫瘤抗原。腫瘤疫苗分為三類：1、增加腫瘤抗原免疫原性的疫苗2、基因修飾的腫瘤疫苗3、以樹突細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗免疫佐劑（Immunoadjuvant）定義：佐劑是先于抗原或與抗原同時(shí)使用，能非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體對抗原的特異性免疫應(yīng)答。能增強(qiáng)相應(yīng)抗原的免疫原性或改變免疫反應(yīng)類型，而本身并無抗原性的物質(zhì)，又稱免疫佐劑。佐劑的作用特點(diǎn)：1、可選擇性地改變免疫應(yīng)答類型：MHCI或MHCII型、抗體種類和輔助T細(xì)胞類型。2、改變抗原類型，從而誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞或細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞。3、可延緩疫苗在注射部位的消失。佐劑的種類1、礦物質(zhì)：常用的有氫氧化鋁和磷酸鋁，鋁制劑主要誘導(dǎo)體液免疫，是人醫(yī)和獸醫(yī)都獲批準(zhǔn)的佐劑。缺點(diǎn)是易形成肉芽腫和無菌膿腫。2、油乳佐劑：主要有弗氏佐劑（Freund‘sAdjuvant，1935），即乳化的水油佐劑，分為完全弗氏佐劑和不完卻年弗氏佐劑。弗氏不完全佐劑（FIA）：由低黏度礦物油和乳化 劑組成。作用與鋁鹽類相似，延緩抗原的吸收， 但誘發(fā)細(xì)胞免疫較差。弗氏完全佐劑：即在FIA中加入分枝桿菌，可增強(qiáng)抗體效價(jià)，增強(qiáng)細(xì)胞免疫，可能有致癌作用，故僅限于獸醫(yī)。其它乳化佐劑劑佐劑-65：可在機(jī)體代謝后排泄，不引起局部反應(yīng)，激發(fā)的抗體滴度比FCA高數(shù)十倍，有希望成為礦物油的代替品。白油-Span佐劑：Span-80、Span-85及Tween-80作為乳化劑是獸醫(yī)生物制品最有效的佐劑之一。MF-59：一種鯊烯水包油乳劑，已經(jīng)證明可以增加流感病毒疫苗的免疫原性，對新生兒也是安全的。SAF：由蘇氨酰胞壁酰二肽、Tween-80、非離子嵌段表面活性劑、角沙醇等組成。機(jī)制是抗原包被在油相形成的微結(jié)構(gòu)內(nèi)，形成儲存庫而緩慢釋放，增強(qiáng)體液和細(xì)胞二種免疫途徑。新型乳化劑Montanide888：一種二縮甘露醇油酸鹽，黏滯度低，可濾過出菌，抗體產(chǎn)生早，水平高，但持續(xù)時(shí)間較短。有望成為人用疫苗佐劑。3、微生物佐劑短小桿菌：加熱或甲醛滅活能非特異性刺激淋巴細(xì)胞樣組織增生，加強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增加IgG和IgM的生成?？ń槊纾壕奘杉?xì)胞的激活劑，同時(shí)還能刺激骨髓多能干細(xì)胞分化免疫活性細(xì)胞，是一種非特異性的免疫增強(qiáng)劑。細(xì)菌脂多糖（LPS）：LPS可促進(jìn)B細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如IL-1可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表面Ia分子的表達(dá)，從而改善抗原的提呈。4、脂質(zhì)體和Novasomes

脂質(zhì)體是人工合成的雙分子層的磷脂單層或多層微環(huán)體，促進(jìn)抗原提呈的定向作用，已證明小于5μm的脂質(zhì)體微粒能被腸道淋巴細(xì)胞結(jié)吸收并傳遞給MФ

。脂質(zhì)體無毒、無免疫原性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明新城疫病毒外膜蛋白-脂質(zhì)體疫苗明顯優(yōu)于單獨(dú)外膜蛋白疫苗；Novasomes是一種非磷脂的親水脂分子，比脂質(zhì)體穩(wěn)定，廉價(jià)，用于粘膜免疫。5、中草藥類蜂膠：是一種天然的免疫增強(qiáng)劑。據(jù)報(bào)道，蜂膠或與抗原同時(shí)使用增強(qiáng)免疫功能，增強(qiáng)補(bǔ)體和吞噬細(xì)胞的活力，增加白細(xì)胞的數(shù)量和抗體的滴度，并明顯增加凝集素的產(chǎn)生。皂甙及皂甙提取物Qs21：皂甙是皂甙樹的粗提物不能用作佐劑，從皂甙提取的成分Qs21可用作疫苗的佐劑。Qs21作為呼吸道合胞體病毒融合蛋白的佐劑與鋁佐劑相比，抗原特異性抗體增加了90倍，細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞的殺傷作用也明顯增強(qiáng)。多糖、糖苷及復(fù)方中藥：中藥多糖可激活T、B、巨噬細(xì)胞、NK、CTL、LAK細(xì)胞、補(bǔ)體，促進(jìn)細(xì)胞因子的生產(chǎn)，有望開發(fā)成為新型疫苗佐劑。用當(dāng)歸多糖作為乙型肝炎基因工程疫苗的佐劑可明顯提高抗體水平，明顯優(yōu)于鋁佐劑。還有用豬苓多糖和香菇多糖與乙肝疫苗聯(lián)合使用的報(bào)道，收到良好的效果。一些復(fù)方中藥作為佐劑，如紫術(shù)散、當(dāng)歸補(bǔ)血湯等對激活免疫系統(tǒng)有很大作用。中藥佐劑安全、有效、可靠、穩(wěn)定是很有發(fā)展前景的佐劑。6、細(xì)胞因子 細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)抗體應(yīng)答與細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的相互關(guān)系，因此，可直接作為免疫佐劑發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞因子IL-1、IL-2、IFN-gamma等均可作為佐劑。但是，由于所有細(xì)胞因子均表