植物組織培養(yǎng)學(xué)

關(guān)于植物組織培養(yǎng)學(xué)第1頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三溫度(temperature)因?yàn)闇囟仁侵参锝M織培養(yǎng)中的重要因素，所以植物組織培養(yǎng)在最適宜的溫度下生長分化才能表現(xiàn)良好，大多數(shù)植物組織培養(yǎng)都是在23～27℃之間進(jìn)行，一般采用25±2℃。低于15℃℃時(shí)培養(yǎng)，植物組織會表現(xiàn)生長停止，高于35℃時(shí)對植物生長不利。但是，不同植物培養(yǎng)的適溫不同，百合的最適溫度是20℃、月季足25-27℃、番茄是28℃。溫度不僅影響植物組織培養(yǎng)育苗的生長速度，也影響其分化增殖以及器官建成等發(fā)育進(jìn)程。如煙草芽的形成以28℃為最好，在120℃以下，33℃以上形成率皆最低。不同培養(yǎng)目標(biāo)采用的培養(yǎng)溫度也不同，百合鱗片在30℃以下再生的小鱗莖的發(fā)葉速度和百分率都比在25℃以下的高。桃胚在2—5℃條件進(jìn)行一定時(shí)間的低溫處理，有利于提高胚培養(yǎng)成活率。用35℃處理草莓的莖尖分生組織3—5d，可得到無病毒苗。第2頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三光照(light)組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光照時(shí)間方面1．光照強(qiáng)度(lightintensity)光照強(qiáng)度對培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對外植體及細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。一般來說，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長。2．光質(zhì)(lightwave)光質(zhì)對愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，8周后，分化出愈傷組織。但在藍(lán)光下培養(yǎng)，幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15d后，在藍(lán)光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長旺盛，而白光下幼苗纖細(xì)。3．光周期(lightperiod)試管苗培養(yǎng)時(shí)要選用一定的光暗周期來進(jìn)行組織培養(yǎng)，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。研究表明，對短日照敏感的品種的器官組織，在短日照下易分化，而在長日照下產(chǎn)生愈傷組織，有時(shí)需要暗培養(yǎng)，尤其是一些植物的愈傷組織在暗下比在光下更好。如紅花、烏飯樹的愈傷組織。第3頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三濕度(humidity)濕度的影響包括培養(yǎng)容器保持和環(huán)境的濕度條件，容器內(nèi)主要受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。前者又受瓊脂含量的影響。在冬季應(yīng)適當(dāng)減少瓊脂用量，否則，將使培養(yǎng)基干硬，以致不利于外植體接觸或插進(jìn)培養(yǎng)基，導(dǎo)致生長發(fā)育受阻。封口材料直接影響容器內(nèi)濕度情況，但封閉性較高的封口材料易引起透氣性受阻，也會導(dǎo)致植物生長發(fā)育受影響。環(huán)境的相對濕度可以影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，一般要求70%—80%的相對濕度，常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來調(diào)節(jié)濕度。濕度過低會使培養(yǎng)基喪失大量水分，導(dǎo)致培養(yǎng)基各種成分濃度的改變和滲透壓的升高，進(jìn)而影響組織培養(yǎng)的正常進(jìn)行。濕度過高時(shí)，易引起棉塞長霉，造成污染。第4頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三滲透壓(penetratingpressure)

培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物，因此，而影響到滲透壓的變化。通常1—2個(gè)大氣壓對植物生長有促進(jìn)作用，2個(gè)大氣壓以上就對植物生長有阻礙作用，而5—6個(gè)大氣壓植物生長就會完全停止，6個(gè)大氣壓植物細(xì)胞就不能生存。第5頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三pH值(pHvalue)不同的植物對培養(yǎng)基最適pH值的要求也是不同的(表2—1)，大多在5、6．5左右，一般培養(yǎng)基皆要求5.8，這基本能適應(yīng)大多植物培養(yǎng)的需要。pH值適度因材料而異，也因培養(yǎng)基的組成而不同。以硝態(tài)氮作氮源和以銨態(tài)氮作氮源就不一樣，后者較高一些。一般來說當(dāng)pH值高于6．5時(shí)，培養(yǎng)基全變硬；低于5時(shí)，瓊脂不能很好地凝固。因?yàn)楦邷販缇鷷档蚿H值(約0.2—0.3個(gè)pH值)因此在配制時(shí)常提高pH值0．2—0．3單位。pH值大小調(diào)整可用0．1M的NaOH和0．IM的HCI來調(diào)整。lml的NaOH可使pH值升高0．2單位，lml的HCl可使pH值降低0．2單位。調(diào)節(jié)時(shí)一定要充分?jǐn)嚢杈鶆颉５?頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三種類最適pH值種類最適pH值杜鵑4.0月季5.8越桔4.5胡蘿卜、石刁柏6.0蠶豆5.5桃7.0番茄5.7

不同植物的最適pH值

第7頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三氧氣(oxygen)氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素，瓶蓋封閉時(shí)要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料。通氣最好的是棉塞封閉瓶口，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥，夏季易引起污染。固體培養(yǎng)基可加進(jìn)活性炭來增加通氣度，以利于發(fā)根。培養(yǎng)室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況。液體振蕩培養(yǎng)時(shí)，要考慮振蕩的次數(shù)、振幅等，同時(shí)要考慮容器的類型、培養(yǎng)基等第8頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三第二節(jié)培養(yǎng)基的制備一、母液(stocksolution)的配制和保存在植物組織培養(yǎng)工作中，配制培養(yǎng)基是日常必備的工作。為簡便起見，通常先配制一系列母液，即貯備液。所謂母液是欲配制液的濃縮液，這樣不但可以保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時(shí)的快速移取，而且還便于低溫保藏。一般母液配成比所需濃度高10-100倍。母液配制時(shí)可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物和激素類等。配制時(shí)注意一些離子之間易發(fā)生沉淀，如Ca2+和S042+，Ca2+、Mg2+和PO43-一起溶解后，會產(chǎn)生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液時(shí)要用蒸餾水或重蒸餾水。藥品應(yīng)選取等級較高的化學(xué)純或分析純。藥品的稱量及定容都要準(zhǔn)確。各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等母液，其中維生素、氨基酸類可以分別配制，也可以混在一起。母液配好后放人冰箱內(nèi)低溫保存，用時(shí)再按比例稀釋。第9頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三母液的配制方法：單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶質(zhì)?；炫浞ǎ簩最悹I養(yǎng)成分按配方中的用量擴(kuò)大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后每一類混合在一起定容到一定體積配成混合母液，濃度可用amg/L表示，即配制一升培養(yǎng)基吸取該母液aml.生長素配制時(shí)可先用少量95%酒精助溶。2，4—D可用O．1mol／L的NaOH或KOH助溶，加入溫水定容。生長素常配成1mg／ml的溶液貯于冰箱中備用。細(xì)胞分裂素類一般先用少量1N鹽配溶解后，再加入溫水冷卻后定容，鐵鹽配法（MS為例）：在裝有400ml蒸餾水的燒杯中加入2?？列遭c，溶解后加入3.73gEDTA-Na2，加熱使其全部溶解，然后邊攪拌邊慢慢加入2.78gFeSO4.7H2O直至全部溶解，冷卻后定容至500ml，置于冰箱中備用。第10頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三第三節(jié)培養(yǎng)基的選擇在建立一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)體系時(shí)，為了能研制出一種適合的培養(yǎng)基，最好先由一種已被廣泛使用的基本培養(yǎng)基(如Ms培養(yǎng)基或B5培養(yǎng)基)開始。當(dāng)通過一系列的實(shí)驗(yàn)，對這種培養(yǎng)基做了某些定性和定量的小變動之后，即有可能得到一種能滿足實(shí)驗(yàn)需要的新培養(yǎng)基，選擇最佳培養(yǎng)基。常用試驗(yàn)方法主要有單因子試驗(yàn)、多因子試驗(yàn)及廣譜實(shí)驗(yàn)等。第11頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三一、單因子試驗(yàn)在單因子試驗(yàn)中．由于培養(yǎng)基中其他成分都維持在一般水平上，所以只變動一個(gè)因子，就可以找出這一因子對試驗(yàn)的影響和影響的程度。例如Ms基本培養(yǎng)基的其他成分和用量都不變，只變動NAA用量對某一培養(yǎng)物生根的影響，這種只研究一個(gè)因素的試驗(yàn)就是單因子試驗(yàn)。生物學(xué)試驗(yàn)不同于物理學(xué)或化學(xué)試驗(yàn)，最顯著的差別是在生物學(xué)試驗(yàn)中必需設(shè)置對照組與試驗(yàn)組，試驗(yàn)組可以有一組或幾組，隨試驗(yàn)的復(fù)雜性而設(shè)置，對照組也可能有一組以上。試驗(yàn)中要求對照組與試驗(yàn)組中的試驗(yàn)個(gè)體，即植物組織塊或其他培養(yǎng)物，必須在遺傳性、生理狀態(tài)、前培養(yǎng)條件等方面，盡可能完全一致。以保證試驗(yàn)結(jié)果是來源于試驗(yàn)因子，而不是由于試驗(yàn)材料的不一致導(dǎo)致的。試驗(yàn)中各處理一般都要設(shè)有一定的重復(fù)，以取得可靠的試驗(yàn)結(jié)果。隨試驗(yàn)規(guī)模和要求不同，大多每個(gè)項(xiàng)目要有4—10瓶，每瓶至少3塊培養(yǎng)物或3叢小幼苗。第12頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三2種激素5種濃度的實(shí)驗(yàn)組合6-BAmg/L）00.52.5510NAA012345(mg/L)0.56789102.5111213141551617181920102122232425對培養(yǎng)基中兩個(gè)或兩個(gè)以上因素進(jìn)行研究的試驗(yàn)稱為多因子實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)可采用完全試驗(yàn)方案，也可選用正交設(shè)計(jì)方案，完全試驗(yàn)方案具有均衡完全的特點(diǎn)，各個(gè)因子的每個(gè)水平都相互搭配，構(gòu)成了所有可能的處理組合，如研究NAA和6—BA的最佳濃度組合，每個(gè)因子各設(shè)5個(gè)濃度水平(0，0.5，2.5，5，10mg／L)，這兩種因子各種濃度的所有組合，就構(gòu)成了一個(gè)具有25項(xiàng)處理的試驗(yàn)見表3—3。二、多因子試驗(yàn)第13頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三完全試驗(yàn)方案試驗(yàn)因子越多，處理數(shù)越多，試驗(yàn)越復(fù)雜，消耗的精力、物力越多。為了減少試驗(yàn)處理，但又能準(zhǔn)確全面地獲得試驗(yàn)信息，通常采用正交試驗(yàn)。例如，采用正交設(shè)計(jì)，在使用此表時(shí)就可以安排4個(gè)因子，3種水平的試驗(yàn)，一共做9種不同搭配的試驗(yàn)，其結(jié)果相當(dāng)于做了27次種種搭配的試驗(yàn)。正交試驗(yàn)雖然是多因素搭配在一起的試驗(yàn)，但是在試驗(yàn)結(jié)果的分析中，每一種因素所起的作用卻又能夠明白無誤地表現(xiàn)出來。因此，一次系統(tǒng)的試驗(yàn)結(jié)果，就可以把問題分析得清清楚楚，用有限的時(shí)間取得成倍的收獲。在組織培養(yǎng)研究中，可用于同時(shí)探求培養(yǎng)基中適宜的幾種成分的用量，如細(xì)胞分裂素、生長素、糖和其他成分的用量。第14頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三三、逐步添加和逐步排除的試驗(yàn)方法在植物組織分化與再生的研究中，在沒有取得可靠的分化與再生之前，往往添加各種有機(jī)營養(yǎng)成分，而在取得了穩(wěn)定的再生之后，就可以逐步減少這些成分。在逐步添加時(shí)是使試驗(yàn)成功，在逐步減少時(shí)是縮小范圍，以便找到最有影響力的因子，或是為了實(shí)用上的需要竭力使培養(yǎng)基簡化，以降低成本和利于推廣。在尋求最佳激素配比時(shí)，也經(jīng)常用到這種加加減減的簡單方法。第15頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三四、廣譜實(shí)驗(yàn)法在廣譜實(shí)驗(yàn)法中，把培養(yǎng)基中所有組分分為4大類：無機(jī)鹽、有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生長素、細(xì)胞分裂素。對每一類物質(zhì)選定低(L)、中(M)、和高(H)3個(gè)濃度。4類物質(zhì)各3種濃度的自由組合即構(gòu)成了一項(xiàng)包括81個(gè)處理的實(shí)驗(yàn)。在這81個(gè)處理中最好的一個(gè)可用4個(gè)字母表示。例如，一個(gè)包含中等濃度無機(jī)鹽，低等濃度生長素、中等濃度細(xì)胞分裂素和高等濃度有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)的處理即可表示為MLMH。達(dá)到這個(gè)階段，再試用不同類型的生長素和細(xì)胞分裂素即可找到培養(yǎng)基的最佳配方。這是因?yàn)椴煌愋偷纳鶮素和細(xì)胞分裂素對不同植物的活性有所不同。第16頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三第四章操作技術(shù)

第一節(jié)滅菌和接種滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學(xué)者首先要清楚有菌和無菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。依此觀點(diǎn)，無菌室等未經(jīng)處理的地方、超凈臺表面、簡單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個(gè)外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個(gè)消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。這里所指的菌，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。茵的特點(diǎn)是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時(shí)不有，無孔不人。在自然條件下忍耐力強(qiáng)，生活條件要求簡單，繁殖力極強(qiáng)，條件適宜時(shí)便可大量滋生。第17頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體(當(dāng)然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的)，高層大氣、巖石內(nèi)部、健康的動、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強(qiáng)酸強(qiáng)堿，化學(xué)元素滅菌劑等表面和內(nèi)部等等都是無菌的。從以上可以看出：在地球表面無菌世界要比有菌世界小得多。菌是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個(gè)概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細(xì)菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物，所以通過嚴(yán)格滅菌的操作空間(接種室、超凈臺、等)和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進(jìn)行的操作，就叫做無菌操作。第18頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三常用的滅菌方法常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類，即：物理方法如干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線處理(紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學(xué)方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當(dāng)選用。第19頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三濕熱滅菌（培養(yǎng)基）培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在o．1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121℃。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到O．05MPa時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達(dá)到0．1MPa時(shí)壓力0．1-0．15MPa，20min。第20頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三對高壓滅菌后不變質(zhì)的物品，如無菌水、栽培介質(zhì)、接種用具，可以延長滅菌時(shí)間或提高壓力。而培養(yǎng)基要嚴(yán)格遵守保壓時(shí)間，既要保壓徹底，又要防止培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力降低，不能隨意延長時(shí)間。對于一些布制品，如實(shí)驗(yàn)服、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20-30min。高壓滅菌前后的培養(yǎng)基，其pH值下降0.2-0.3單位。高壓后培養(yǎng)基pH值的變化方向和幅度取決于多種因素。在高壓滅菌前用堿調(diào)高pH值至預(yù)定值的則相反。培養(yǎng)基中成分單一時(shí)和培養(yǎng)基中含有高或較高濃度物質(zhì)時(shí)，高壓滅菌后的pH值變化幅度較大，甚至可大于2個(gè)pH值單位。環(huán)境pH值的變化大于0.5單位就有可能產(chǎn)生明顯的生理影響。高壓滅菌通常會使培養(yǎng)基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養(yǎng)基的滲透壓。在8%-20%蔗糖范圍內(nèi)，高壓滅菌后的培養(yǎng)基約升高0．43倍。培養(yǎng)基中的鐵在高壓滅菌時(shí)會催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)基值小于5.5，其水解量更多，培養(yǎng)基中添加0.1%活性炭時(shí)，高壓下蔗糖水解大大增強(qiáng)，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達(dá)5%。第21頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三防止高壓滅菌培養(yǎng)基變化的方法：(1)經(jīng)常注意搜集有關(guān)高壓滅菌影響培養(yǎng)基成分的資料，及時(shí)采取有效措施。(2)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方時(shí)盡量采用效果類似的穩(wěn)定試劑并準(zhǔn)確掌握劑量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值對高壓滅菌下培養(yǎng)基中成分的影響等。(3)配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意成分的適當(dāng)分組與加入的順序。如將磷、鈣和鐵放在最后加入。(4)注意高壓滅菌后培養(yǎng)基pH值的變化及回復(fù)動態(tài)。如高壓滅菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。這樣在實(shí)驗(yàn)中就可以根據(jù)這一規(guī)律加以掌握。第22頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三灼燒滅菌（用于無菌操作的器械）在無菌操作時(shí)，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰卜灼燒火菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用250或500ml的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。第23頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三干熱滅菌（玻璃器皿及耐熱用具）干熱滅菌是利用烘箱加熱到160-180~C的溫度來殺死微生物。由于在干熱條件下，細(xì)菌的營養(yǎng)細(xì)胞的抗熱性大為提高，接近芽抱的抗熱水平，通常采用170℃持續(xù)90min來滅菌。干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時(shí)重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時(shí)應(yīng)漸進(jìn)升溫，達(dá)到頂定溫度后記錄時(shí)間。烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多，以免妨礙熱對流和穿透，到指定時(shí)間斷電后，待充分冷涼，才能打開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅菌能源消耗太大，浪費(fèi)時(shí)間。第24頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三過濾滅菌（不耐熱的物質(zhì)）一些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。防細(xì)菌濾膜的網(wǎng)孔的直徑為0.45μm以下，當(dāng)溶液通過濾膜后，細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需要過濾滅菌的液體量大時(shí)，常使用抽濾裝置；液量小時(shí)，可用注射器。使用前對其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，將待過濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。第25頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三紫外線和熏蒸滅菌（空間）(1)紫外線滅菌在接種室、超凈臺上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌，細(xì)菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細(xì)菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長為200—300nm，其中以260nm的殺菌能力最強(qiáng)，但是由于紫外線的穿透物質(zhì)的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過1.2m為宜。(2)熏蒸滅菌用加熱焚燒、氧化等方法，使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關(guān)閉緊密即可。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時(shí)，房間關(guān)閉緊密，按5—8ml／m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時(shí)，房間可預(yù)先噴濕以加強(qiáng)效果。冰醋酸也可進(jìn)行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。化學(xué)消毒劑的種類很多，它們使微生物的蛋白質(zhì)變性，或競爭其酶系統(tǒng)，或降低其表面張力，增加菌體細(xì)胞漿膜的通透性，使細(xì)胞破裂或溶解。一般說來，溫度越高，作用時(shí)間越長，殺菌效果越好。另外，由于消毒劑必須溶解于水才能發(fā)揮作用，所以要制成水溶狀態(tài)，如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強(qiáng)，但石炭酸和酒精例外。第26頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三噴霧滅菌（物體表面）物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，可用70%的酒精反復(fù)涂擦滅菌，l%-2%的來蘇兒溶液以及0.25%—1%的新潔爾滅也可以。第27頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三植物材料表面用消毒劑滅菌從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶人培養(yǎng)基，便會造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。第28頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三第一步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細(xì)洗干凈，如用適當(dāng)?shù)乃⒆拥人⑾础０巡牧锨懈畛蛇m當(dāng)大小，即滅菌容器能放人為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時(shí)，沖洗時(shí)間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細(xì)小的材料，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。流水沖洗在污染嚴(yán)重時(shí)特別有用。洗時(shí)可加入洗衣粉清洗，然后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸。當(dāng)然，最理想的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)—吐溫。第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內(nèi)完成，準(zhǔn)備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸10～30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強(qiáng)，也很易殺傷植物細(xì)胞，所以浸潤時(shí)間不能過長。有一些特殊的材料，如果實(shí)、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內(nèi)部的材料，則可只用70%酒精處理稍長的時(shí)間。處理完的材料在無菌條件下，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內(nèi)部材料。第29頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取1—2種使用見表。滅菌劑使用濃度(%)持續(xù)時(shí)間（min）去除的難易效果次氯酸鈣9~105~30易很好次氯酸鈉25~30易很好氯化汞0.1~15~8較難最好抗菌素4~50mg/L30~60中較好常用滅菌劑使用濃度及效果比較表第30頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三上述滅菌劑應(yīng)在使用前臨時(shí)配制，氯化汞可短期內(nèi)貯用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來殺菌的，故滅菌時(shí)用廣口瓶加蓋較好；升汞是由重金屬汞離子來達(dá)到滅菌的；過氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來殺菌的，這種藥劑殘留的影響較小，滅菌后用無菌水涮洗3—4次即可；由于用升汞液滅菌的材料，難以對升汞殘毒較難去除，所以應(yīng)當(dāng)用無菌水涮洗8～10次，每次不少于3min，以盡量去除殘毒。滅菌時(shí)，把瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯或其他器皿中，記好時(shí)間，倒人消毒溶液，不時(shí)用玻璃棒輕輕攪動，以促進(jìn)材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使消毒徹底。在快到時(shí)間之前1—2min，開始把消毒液傾人一備好的大燒杯內(nèi)，要注意勿使材料倒出，傾凈后立即倒入無菌水，輕攪涮洗。滅菌時(shí)間是從倒人消毒液開始，至倒入無菌水時(shí)為止。記錄時(shí)間還便于比較消毒效果，以便改正。滅菌液要充分浸沒材料，寧可多用些滅菌液，切勿勉強(qiáng)在一個(gè)體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。在滅菌溶液中加吐溫—80或TntonX效果較好，這些表面活性劑主要作用是使藥劑更易于展布，更容易浸人到滅菌的材料表面。但吐溫加人后對材料的傷害也在增加，應(yīng)注意吐溫的用量和滅菌時(shí)間，一般加入滅菌液的O.5%，即在100ml加入15滴。最后一步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3-l0次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細(xì)胞的副作用。第31頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三二、無菌操作接種時(shí)由于有一個(gè)敞口的過程，所以是極易引起污染的時(shí)期，這一時(shí)期主要由空氣中的細(xì)菌和工作人員本身引起，接種室要嚴(yán)格進(jìn)行空間消毒。接種室內(nèi)保持定期用1%—3%的高錳酸鉀溶液對設(shè)備、墻壁、地板等進(jìn)行擦洗。除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。無菌操作可按以下步驟進(jìn)行：第32頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三(1)在接種4h前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外燈進(jìn)行滅菌；(2)在接種前20min，打開超凈工作臺的風(fēng)機(jī)以及臺上的紫外燈；(3)接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等；(4)上工作臺后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后擦拭工作臺面；(5)先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對培養(yǎng)皿要過火烤干；(6)接種時(shí)，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等；(7)接種完畢后要清理干凈工作臺，可用紫外燈滅菌30min。若連續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。第33頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三三、接種(1)將初步洗滌及切割的材料放人燒杯，帶入超凈臺上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的4層紗布上或?yàn)V紙上。(2)材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈?。如葉片切成0.5cm見方的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要剝成只含l—2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。(3)用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。具體操作過程是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管囗靠近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。若用棉塞蓋口，可先在管口外面灼燒，去掉棉塞，再燒管口里面。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放1—3塊為宜。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放(尖端向上)外，其他尚無統(tǒng)一要求。放置材料數(shù)量現(xiàn)在傾向少放，通過統(tǒng)計(jì)認(rèn)為：對外植體每次接種以一支試管放一枚組塊為宜，這樣可以節(jié)約培養(yǎng)基和人力，一旦培養(yǎng)物污染可以拋棄，接完種后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘。并用棉塞，塞好后，包上包口紙，包囗紙里面也要過火。第34頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三第二節(jié)培養(yǎng)和馴化指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室(有光照、溫度條件)里，使之生長，分裂和分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過程。第35頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三1．培養(yǎng)方法

(1)固體培養(yǎng)法即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現(xiàn)在最常用的方法。雖然該方法設(shè)備簡單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。(2)液體培養(yǎng)法即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需要通過攪動或振動培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，采用往復(fù)式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行培養(yǎng)，其速度一般為50-100r／min，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。第36頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三2．培養(yǎng)步驟

(1)初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。即接種某種外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)時(shí)，常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細(xì)胞分裂素和少量的生長素。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。根據(jù)初代培養(yǎng)時(shí)發(fā)育的方向可分為：第37頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三1)頂芽和腋芽的發(fā)育采用外源的細(xì)胞分裂素，可促使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側(cè)芽啟動生長，從而形成一個(gè)微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結(jié)構(gòu)。在幾個(gè)月內(nèi)可以將這種叢生苗的一個(gè)枝條轉(zhuǎn)接繼代，重復(fù)芽——苗增殖的培養(yǎng)，并且迅速獲得多數(shù)的嫩莖。然后將一部分嫩莖轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，就能得到可種植到土壤中去的完整的小植株。一些木本植物和少數(shù)草本植物也可以通過這種方式來進(jìn)行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。這種繁殖方式也稱作微型扦插，它不經(jīng)過發(fā)生愈傷組織而再生，所以是最能使無性系后代保持原品種特性的一種繁殖方式。適宜這種再生繁殖的植物，在采樣時(shí)，只能采用頂芽、側(cè)芽或帶有芽的莖切段，其他如種子萌發(fā)后取枝條也可以。莖尖培養(yǎng)可看作是這方面較為特殊的一種方式。它采用極其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織作為外植體進(jìn)行接種。在實(shí)際操作中，采用包括莖尖分生組織在內(nèi)的一些組織來培養(yǎng)，這樣便保證了操作方便以及容易成活。用靠培養(yǎng)定芽得到的培養(yǎng)物一般是莖節(jié)較長，有直立向上的莖梢，擴(kuò)繁時(shí)主要用切割莖段法，如香石竹、矮牽牛、菊花等。但特殊情況下也會生出不定芽，形成芽叢。第38頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三2)不定芽的發(fā)育在培養(yǎng)中由外植體產(chǎn)生不定芽，通常首先要經(jīng)脫分化過程，形成愈傷組織的細(xì)胞。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織形成器官原基，它在構(gòu)成器官的縱軸上表現(xiàn)出單向的極性(這與胚狀體不同)。多數(shù)情況下它先形成芽，后形成根。另一種方式是從器官中直接產(chǎn)生不定芽，有些植物具有從各個(gè)器官上長出不定芽的能力如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。當(dāng)在試管培養(yǎng)的條件下，培養(yǎng)基中提供了營養(yǎng)，特別是提供了連續(xù)不斷植物激素的供應(yīng)，使植物形成不定芽的能力被大大地激發(fā)起來。許多種類的外植體表面幾乎全部為不定芽所覆蓋。在許多常規(guī)方法中不能無性繁殖的種類，在試管條件下卻能較容易地產(chǎn)生不定芽而再生，如柏科，松科，銀杏等一些植物。許多單子葉植物儲藏器官能強(qiáng)烈地發(fā)生不定芽，用臼合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。在不定芽培養(yǎng)時(shí)，也常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基。用靠培養(yǎng)不定芽得到的培養(yǎng)物，一般采用芽叢進(jìn)行繁殖，如非洲菊、草莓等。第39頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三3)體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育體細(xì)胞胚狀體類似于合子胚但又有所不同，它也通過球形、心形、魚雷形和子葉形的胚胎發(fā)育時(shí)期，最終發(fā)育成小苗。但它是由體細(xì)胞發(fā)生的。胚狀體可以從愈傷組織表面產(chǎn)生，也可從外植體表面已分化的細(xì)胞中產(chǎn)生，或從懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生，也可從外植體表面已分化的細(xì)胞中產(chǎn)生，或從懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生。第40頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三(2)繼代培養(yǎng)在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等，數(shù)量都還不多，它們需要進(jìn)一步增殖，使之越來越多，從而發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢。繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁培養(yǎng)過程。旨在繁殖出相當(dāng)數(shù)量的無根苗，最后能達(dá)到邊繁殖邊生根的目的。繼代培養(yǎng)的后代是按幾何級數(shù)增加的過程。如果以2株苗為基礎(chǔ)，那么經(jīng)10代將生成210株苗。繼代培養(yǎng)中擴(kuò)繁的方法包括：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。切割莖段常用于有伸長的莖梢、莖節(jié)較明顯的培養(yǎng)物。這種方法簡便易行，能保持母種特性。培養(yǎng)基常是MS0基本培養(yǎng)基；分離芽叢適于由愈傷組織生出的芽叢。培養(yǎng)基常是分化培養(yǎng)基。若芽叢的芽較小，可先切成芽叢小塊，放人MS0培養(yǎng)基中，待到稍大時(shí)，再分離開來繼續(xù)培養(yǎng)。增殖使用的培養(yǎng)基對于一種植物來說每次幾乎完全相同．由于培養(yǎng)物在接近最良好的環(huán)境條件，營養(yǎng)供應(yīng)和激素調(diào)控下，排除了其他生物的競爭，所以能夠按幾何級數(shù)增殖；；在快速繁殖中初代培養(yǎng)只是一個(gè)必經(jīng)的過程，而繼代培養(yǎng)則是經(jīng)常性不停的進(jìn)行過程。但在達(dá)到相當(dāng)?shù)臄?shù)量之后，則應(yīng)考慮使其中一部分轉(zhuǎn)入生根階段。從某種意義上講，增殖只是貯備母株，而生根才是增殖材料的分流，生產(chǎn)出成品。第41頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)的問題及解決方法初代培養(yǎng)外植體的褐變外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐變，有時(shí)甚至?xí)拐麄€(gè)培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當(dāng)擴(kuò)散到培養(yǎng)基后，就會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。第42頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三褐變的主要原因①植物品種研究表明，在不同品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差異，因此，有些花卉品種的外植體在接種后較容易褐變，而有些花卉品種的外植體在接種后不容易褐變。因此，在培養(yǎng)過程中應(yīng)該有所選擇，對不同的品種分別進(jìn)行處理。②生理狀態(tài)由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所不同。一般來說，處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴(yán)重。一般來說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴(yán)重。③培養(yǎng)基成分濃度過高的無機(jī)鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細(xì)胞分裂素的水平過高也會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。④培養(yǎng)條件不當(dāng)如果光照過強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時(shí)間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。第43頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法①選擇合適的外植體一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。②合適的培養(yǎng)條件無機(jī)鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。③使用抗氧化劑在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸、PVP等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外，使用0.1%-0.5%的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。④連續(xù)轉(zhuǎn)移對容易褐變的材料可間隔12~24h的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7-l0d后，褐變現(xiàn)象便會得到控制或大為減輕。第44頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三繼代培養(yǎng)時(shí)材料的玻璃化實(shí)踐表明，當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時(shí)，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明水漬狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會使試管苗生長緩慢、繁殖系數(shù)有所下降。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。因?yàn)槌霈F(xiàn)玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，因此，使繁殖系數(shù)大為降低。在不同的種類、品種間，試管苗的玻璃化程度也有所差異。當(dāng)培養(yǎng)基上細(xì)胞分裂素水平較高時(shí)，也容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質(zhì)，能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生。呈現(xiàn)玻璃化的試管苗，其莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物水平較高，細(xì)胞持水力差，植株蒸騰作用強(qiáng)，無法進(jìn)行正常移栽。這種情況主要是由于培養(yǎng)容器中空氣濕度過高，透氣性較差造成的，其具體解決的方法為：

①增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢；

②減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量；

③增加光照；④增加容器通風(fēng)，最好進(jìn)行CO2施肥，這對減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用；

⑤降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生；

⑥降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。

第45頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三3．生根培養(yǎng)當(dāng)材料增殖到一定數(shù)量后，就要使部分培養(yǎng)物分流到生根培養(yǎng)階段。若不能及時(shí)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上去，就會使久不轉(zhuǎn)移的苗子發(fā)黃老化，或因過分擁擠而使無效苗增多造成拋棄浪費(fèi)。根培養(yǎng)是使無根苗生根的過程，這個(gè)過程目的是使生出的不定根濃密而粗壯。生根培養(yǎng)可采用1／2或者1/4MS培養(yǎng)基，全部去掉細(xì)胞分裂素，并加入適量的生長素(NAA、IBA等)。第46頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三誘導(dǎo)生根方法：①將新梢基部浸入50或100×10-6IIBA溶液中處理4—8h；②在含有生長素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6d；③直接移入含有生長素的生根培養(yǎng)基中。上述三種方法均能誘導(dǎo)新梢生根，但前二種方法對新生根的生長發(fā)育則更為有利。而第三種對幼根的生長有抑制作用。其原因是當(dāng)根原始體形成后較高濃度生長素的繼續(xù)存在，則不利于幼根的生長發(fā)育。不過這種方法比較可行。另外也可采用下列方法就可生根：①延長在增殖培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時(shí)間；②有意降低一些增殖倍率，減少細(xì)胞分裂素的用量(即將增殖與生根合并為一步)；③切割粗壯的嫩枝在營養(yǎng)缽中直接生根，此方法則沒有生根階段?？梢允∪ヒ淮闻囵B(yǎng)基制作，切割下的插穗可用生長素溶液浸蘸處理，但這種方法只適于一些容易生根的作物。另外少數(shù)植物生根比較困難時(shí)，則需要在培養(yǎng)基中放置濾紙橋，使其略高于液面，靠濾紙的吸水性供應(yīng)水和營養(yǎng)，從而誘發(fā)生根。第47頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三從胚狀體發(fā)育成的小苗，常常有原先已分化的根，這種根可以不經(jīng)誘導(dǎo)生根階段而生長。但因經(jīng)胚狀體途徑發(fā)育的苗數(shù)特別多，并且個(gè)體較小，所以也常需要一個(gè)低濃度或沒有植物激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的階段，以便壯苗生根。試管內(nèi)生根壯苗的階段，為了成功地將苗移植到試管外的環(huán)境中，以使試管苗適應(yīng)外界的環(huán)境條件。通常不同植物的適宜馴化溫度不同。如菊花，以18～20℃為宜。實(shí)踐證明植物生長的溫度過高不但會牽涉到蒸騰加強(qiáng)。而且還牽涉到菌類易滋生的問題。溫度過低使幼苗生長遲緩，或不易成活。春季低溫時(shí)苗床可加設(shè)電熱線，使墓質(zhì)溫度略高于氣溫2～3℃，這不但有利于生根和促進(jìn)根系發(fā)達(dá)，而且還有利于提前成活。移植到試管外的植物苗光強(qiáng)度應(yīng)比移植前培養(yǎng)有所提高，并可適應(yīng)強(qiáng)度較高的漫射光，(約4000h左右)，以維持光合作用所需光照強(qiáng)度。但光線過強(qiáng)刺激蒸騰加強(qiáng)，會使水分平衡的矛盾更尖銳。第48頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三二、試管苗移栽馴化

試管苗移栽是組織培養(yǎng)過程的重要環(huán)節(jié)，這個(gè)工作環(huán)節(jié)做不好，就會造成前功盡棄。為了做好試管苗的移栽，應(yīng)選擇合適的基質(zhì)，并配合以相應(yīng)的管理措施，才能確保整個(gè)組織培養(yǎng)工作的順利完成。試管苗由于是在無菌、有營養(yǎng)供給、適宜光照和溫度近100%的相對濕度環(huán)境條件下生長的，因此，在生理、形態(tài)等方面都與自然條件生長的正常小苗有著很大的差異。所以必須通過煉苗，例如通過控水、減肥、增光、降溫等措施，使它們逐漸地適應(yīng)外界環(huán)境，從而使生理、形態(tài)、組織上發(fā)生相應(yīng)的變化，使之更適合于自然環(huán)境，只有這樣才能保證試管苗順利移栽成功。第49頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三從葉片上看，試管苗的角質(zhì)層不發(fā)達(dá)，葉片通常沒有表皮毛，或僅有較少表皮毛，甚至葉片上出現(xiàn)了大量的水孔，而且，氣孔的數(shù)量、大小也往往超過普通苗。由此可知，試管苗更適合于高濕的環(huán)境生長，當(dāng)將它們移栽到試管外環(huán)境時(shí)，試管苗失水率會很高，非常容易死亡。因此，為了改善試管苗的上述不良生理、形態(tài)特點(diǎn)，則必須經(jīng)過與外界相適應(yīng)的馴化處理另外，對栽培馴化基質(zhì)要進(jìn)行滅菌，因?yàn)樵嚬苊缭跓o菌的環(huán)境中生長，對外界細(xì)菌、真菌的抵御能力極差。為了提高其成活率，在培養(yǎng)基質(zhì)中可摻入75%的百菌清可濕性粉劑200-500倍液，以進(jìn)行滅菌處理。，通常采取的措施有：對外界要增加濕度、減弱光照；對試管內(nèi)要通透氣體、增施二氧化碳肥料、逐步降低空氣濕度等。第50頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三移栽用基質(zhì)

適合于栽種試管苗的基質(zhì)要具備透氣性、保濕性和一定的肥力，容易滅菌處理，并不利于雜菌滋生的特點(diǎn)，一般可選用珍珠巖、蛭石、砂子等。為了增加粘著力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配時(shí)需按比例搭配，一般用珍珠巖，蛭石，草炭土或腐殖土比例為1:1:0.5。也可用砂子：草炭土或腐殖土為1:1。這些介質(zhì)在使用前應(yīng)高壓滅菌?；蛴弥辽?h烘烤來消滅其中的微生物。要根據(jù)不同植物的栽培習(xí)性來進(jìn)行配制，這樣才能獲得滿意的栽培效果。以下介紹幾種常見的試管苗栽培基質(zhì)。(1)河砂:河砂分為粗砂、細(xì)砂兩種類型。粗砂即平常所說的河砂，其顆粒直徑為1—2mm。細(xì)砂即通常所說的面砂，其顆粒直徑為0.1—0.2mm。河砂的特點(diǎn)是排水性強(qiáng)，但保水蓄肥能力較差，一般不單獨(dú)用來直接栽種試管苗。(2)草炭土:草炭土是由沉積在沼澤中的植物殘骸經(jīng)過長時(shí)間的腐爛所形成，其保水性好，蓄肥能力強(qiáng)，呈中性或微酸性反應(yīng)，但通常不能單獨(dú)用來栽種試管苗，宜與河砂等種類相互混合配成盆土而加以使用。(3)腐殖土:腐殖土是由植物落葉經(jīng)腐爛所形成。一種是自然形成，一種是人為造成，人工制造時(shí)可將秋季的落葉收集起來，然后埋人坑中，灌水壓實(shí)令其腐爛。第二年春季將其取出置于空氣中，在經(jīng)常噴水保濕的條件下使其風(fēng)化，然后過篩即可獲得。腐葉上含有大量的礦質(zhì)營養(yǎng)、有機(jī)物質(zhì)，它通常不能單獨(dú)使用。摻有腐殖土的栽培基質(zhì)有助于植株發(fā)根。第51頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三移栽前的練苗移栽前可將培養(yǎng)物不開口移到自然光照下鍛煉2—3d，讓試管苗接受強(qiáng)光的照射，使其長得壯實(shí)起來，然后再開口練苗1—2d，經(jīng)受較低濕度的處理，以適應(yīng)將來自然濕度的條件。第52頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三移栽和幼苗的管理

從試管中取出發(fā)根的小苗，用自來水洗掉根部粘著的培養(yǎng)基，要全部除去，以防殘留培養(yǎng)基滋生雜菌。但要輕輕除去，應(yīng)避免造成傷根。栽植時(shí)用一個(gè)筷子粗的竹簽在基質(zhì)中插一小孔，然后將小苗插入，注意幼苗較嫩，防止弄傷，栽后把苗周圍基質(zhì)壓實(shí)，栽前基質(zhì)要澆透水。栽后輕澆薄水。再將苗移入高濕度的環(huán)境中。保證空氣濕度達(dá)90%以上。第53頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三(1)保持小苗的水分供需平衡。在移栽后5-7d內(nèi)，應(yīng)給予較高的空氣濕度條件，使葉面的水分蒸發(fā)減少，盡量接近培養(yǎng)瓶的條件，讓小苗始終保持挺拔的狀態(tài)。保持小苗水分供需平衡首先營養(yǎng)缽的培養(yǎng)基質(zhì)要澆透水，所放置的床面也要澆濕，然后搭設(shè)小拱棚，以減少水分的蒸發(fā)，并且初期要常噴霧處理，保持拱棚薄膜上有水珠出現(xiàn)。當(dāng)5—7d后，發(fā)現(xiàn)小苗有長趨勢，可逐漸降低濕度，減少噴水次數(shù)，將拱棚兩端打開通風(fēng)，使小苗適應(yīng)濕度較小的條件。約15d以后揭去拱棚的薄膜，并給予水分控制，逐漸減少澆水，促進(jìn)小苗長得粗壯。(2)防止菌類滋生。由于試管苗原來的環(huán)境是無菌的，移出來以后難以保持完全無菌，因此，應(yīng)盡量不使菌類大量滋生，以利成活。所以應(yīng)對基質(zhì)進(jìn)行高壓滅菌或烘烤滅菌?？梢赃m當(dāng)使用一定濃度的殺菌劑以便有效地保護(hù)幼苗，如多菌靈、托布津，濃度800—1000倍，噴藥宜7—l0d一次。在移苗時(shí)盡量少傷苗，傷口過多，根損傷過多，都是造成死苗的原因。噴水時(shí)可加入0.1%的尿素，或用1／2MS大量元素的水溶液作追肥，可加快苗的生長與成活。

第54頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三(3)一定的溫、光條件。試管苗移栽以后要保持一定的溫光條件，適宜的生根溫度是18—200C，冬春季地溫較低時(shí)，可用電熱線來加溫。溫度過低會使幼苗生長遲緩，或不易成活。溫度過高會使水分蒸發(fā)，從而使水分平衡受到破壞，并會促使菌類滋生。另外在光照管理的初期可用較弱的光照，如在小拱棚上加蓋遮陽網(wǎng)或報(bào)紙等，以防陽光灼傷小苗和增加水分的蒸發(fā)。當(dāng)小植株有了新的生長時(shí)，逐漸加強(qiáng)光照，后期可直接利用自然光照。促進(jìn)光合產(chǎn)物的積累，增強(qiáng)抗性，促其成活。(4)保持基質(zhì)適當(dāng)?shù)耐庑浴Ｒx擇適當(dāng)?shù)念w粒狀基質(zhì)，保證良好的通氣作用。在管理過程中不要澆水過多，過多的水應(yīng)迅速瀝除，以利根系呼吸。綜上所述，試管苗在移栽的過程中，只要把水分平衡、適宜的介質(zhì)、控制雜菌和適宜的光、溫條件控制好，試管苗是很容易移栽的。第55頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三第56頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三第57頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三愈傷組織（callus）的形成和形態(tài)發(fā)生

植物的脫分化形式有兩種，器官發(fā)生型和胚胎發(fā)生型，在有些情況下，再分化可以直接發(fā)生于脫分化的細(xì)胞中，無須經(jīng)歷愈傷組織階段，但大多數(shù)情況下，再分化過程是在愈傷組織細(xì)胞中發(fā)生的。第58頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三一．愈傷組織形成的條件雖然如全能性所言，發(fā)育和分化過程并不導(dǎo)致細(xì)胞全能性的喪失，但是，在一個(gè)完整的植物中，每個(gè)分化細(xì)胞都是某個(gè)器官和組織中的一個(gè)成員，它只能在與其周圍成員相互協(xié)調(diào)和彼此制約當(dāng)中，恰如其分地發(fā)揮整個(gè)植株所賦予它的一定的功能，而不具備施展其全能性的外部條件。然而，這些細(xì)胞若是一旦脫離了母體植株，擺脫了原來所受到的遺傳上的控制和生理上的制約，在不定期下的培養(yǎng)條件下，就會發(fā)生一種回復(fù)變化，從而失去分化狀態(tài)，變?yōu)榉稚?xì)胞，實(shí)現(xiàn)脫分化過程。然后，這些脫分化細(xì)胞經(jīng)過連續(xù)的有絲分裂，形成愈傷組織（離體隔離）。大量研究表明，幾乎所有高等植物的各種器官，如根、莖、葉和花等，以及各種組織，如皮層、莖髓和形成層等，離體后在適當(dāng)條件下，都能產(chǎn)生愈傷組織。由此可見，愈傷組織誘導(dǎo)的成敗關(guān)鍵主要不是外植體的來源和種類，而是培養(yǎng)條件，其中激素的種類和濃度最為重要。當(dāng)然，外植體的類型和外植物體原來在植株上所處的位置（反映了內(nèi)源激素水平）對愈傷組織誘導(dǎo)的影響也不能忽視。第59頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三二．愈傷組織形成的過程外植體中已分化的活細(xì)胞，在外源激素的誘導(dǎo)下通過脫分化后形成愈傷組織，這一過程被大致劃分為三個(gè)時(shí)期（誘導(dǎo)期、分裂期和形成期）。第60頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三誘導(dǎo)期：細(xì)胞分裂的準(zhǔn)備期誘導(dǎo)期是細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂的時(shí)期。接種的外植體材料的細(xì)胞通常都是成熟細(xì)胞，處于靜止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞大小沒有多大變化，外觀無明顯特征，但細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝旺盛，王凱基等（1981）在研究離體培養(yǎng)的油橄欖莖段時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)合成代謝活躍，RNA含量迅速增加，細(xì)胞核體積明顯增大。誘導(dǎo)期的長短，因植物種類和外植體的生理狀況和外部因素而異，如胡蘿卜的誘導(dǎo)期要好幾天，新鮮的菊芋塊莖則只要22h，但菊芋塊莖經(jīng)過5個(gè)月的貯藏后，誘導(dǎo)期則須延長到40h以上。第61頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三分裂期：細(xì)胞從開始分裂到持續(xù)分裂的時(shí)期分裂期是指細(xì)胞通過一分為二的分裂，不斷增生子細(xì)胞的過程。外植體的細(xì)胞一旦經(jīng)過誘導(dǎo)，其外層細(xì)胞開始迅速分裂，使細(xì)胞脫分化。分裂期主要表現(xiàn)如下：1.細(xì)胞的數(shù)目迅速增加。如胡蘿卜培養(yǎng)7天后，細(xì)胞數(shù)可增加10倍。2.每個(gè)細(xì)胞平均鮮重下降。這是由于細(xì)胞鮮重的增加不如細(xì)胞數(shù)目的增加快的緣故。3.細(xì)胞體積小，內(nèi)無液泡，如同根尖和莖尖的分生組織細(xì)胞特性。4．細(xì)胞的核和核仁增大到最大。5.細(xì)胞中RNA含量減少，而DNA含量保持不變。6.

隨著細(xì)胞不斷分裂和組織生長，細(xì)胞的總干重、蛋白質(zhì)和核酸含量大大增加，新細(xì)胞壁的合成極快。第62頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三總之，分裂期的愈傷組織的共同特征是：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，維持其不分化的狀態(tài)。第63頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三形成期：從愈傷組織到器官發(fā)生形成期是指外植體經(jīng)過誘導(dǎo)期和分裂期后形成了無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織的時(shí)期。進(jìn)入形成期后，細(xì)胞的平均大小相對穩(wěn)定，不再減少，細(xì)胞分裂由原來局限在組織外緣的平周分裂轉(zhuǎn)為組織內(nèi)部較深層局部細(xì)胞的分裂，結(jié)果形成瘤狀或片狀的擬分生組織（meristemoid），稱做分生組織結(jié)節(jié)。分生組織結(jié)節(jié)可以成為愈傷組織的生長中心，或者進(jìn)一步分化為維管組織結(jié)節(jié)——由分生組織結(jié)節(jié)外圍的細(xì)胞作平周分裂成為形成層狀細(xì)胞，并形成了部分維管組織如管胞、纖維細(xì)胞等，但不形成維管系統(tǒng)。由于此期細(xì)胞分裂已基本停止，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生生理代謝等的變化而開始形成一些不同形態(tài)和功能的細(xì)胞，因此有人又將此期稱為分化期。

第64頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三愈傷組織的繼代培養(yǎng)脫分化細(xì)胞不斷進(jìn)行分裂，從而形成了愈傷組織，愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時(shí)間以后，由于營養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，以及代謝產(chǎn)物的積累，必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這個(gè)過程叫做繼代。通過繼代培養(yǎng)，可使愈傷組織無限期地保持在不分的增殖狀態(tài)。然而，如果讓愈傷組織留在原培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)而不繼代，它們則不可避免地發(fā)生分化，產(chǎn)生新的結(jié)構(gòu)。第65頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三三愈傷組織的生長

一般來說，愈傷組織的增殖生長只發(fā)生在不與瓊脂接觸的表面，而與瓊脂接觸的一面極少細(xì)胞增殖，只是細(xì)胞分化形成緊密的組織塊。它是愈傷組織表面或近表面瘤狀物生長的結(jié)果。愈傷組織之間的質(zhì)地有顯著不同，有的很松脆，有的很堅(jiān)實(shí)，且這兩類愈傷組織可互相轉(zhuǎn)變。其方法是：加入高濃度的生長物質(zhì)，可使堅(jiān)實(shí)的愈傷組織變?yōu)樗纱?。反之，減低或除去生長物質(zhì)，則松脆的愈傷組織可以轉(zhuǎn)變?yōu)閳?jiān)實(shí)。松脆愈傷組織都有大量的分生組織上中心，進(jìn)行活躍的細(xì)胞分裂，為大而未分化的細(xì)胞所分開；而不脆的確良愈傷組織很少分化，大都是高度液泡化的細(xì)胞。脆的愈傷組織是進(jìn)行懸浮培養(yǎng)最適合的材料，稍經(jīng)機(jī)械振蕩，即可使組織分散成單細(xì)胞或少數(shù)幾個(gè)細(xì)胞組成的小細(xì)胞團(tuán)。在培養(yǎng)中細(xì)胞產(chǎn)生迅速增殖，而堅(jiān)實(shí)的愈傷組織中的細(xì)胞間被果膠質(zhì)緊緊地粘著，因而往往不能形成良好的懸浮系統(tǒng)。愈傷組織的質(zhì)地不同是由其內(nèi)部結(jié)構(gòu)上的差異所引起的。堅(jiān)實(shí)致密的愈傷組織內(nèi)無大的細(xì)胞間隙，而由管狀細(xì)胞組成維管組織；松脆愈傷組織內(nèi)有大量的細(xì)胞間隙，細(xì)胞排列毫無次序。生長旺盛的愈傷組織一般呈奶黃色或白色，有光澤，也有淡綠色或綠色的；老化的愈傷組織多轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色甚至褐色。第66頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三外植體的脫分化因植物種類和器官及其生理狀況而有很大差別，如煙草、胡蘿卜等脫分化較易，而禾谷類的脫分化較難；花器脫分化較易，而莖葉較難；幼嫩組織脫分化較易，而成熟的老組織較難。一個(gè)多細(xì)胞外植體通常包含著各種不同類型的細(xì)胞，因此，由它所形成的愈傷組織也是異質(zhì)性的，其中不同的組分細(xì)胞具有不同的形成完整植株或器官的能力，即不同的再分化能力。以上對愈傷組織形成過程的時(shí)期的劃分并不具有嚴(yán)格的意義，實(shí)際上，特別是分裂期和形成期往往可以出現(xiàn)在同一塊組織上。另外，有一些研究者曾反復(fù)指出的，雖然細(xì)胞脫分化的結(jié)果在大多數(shù)情況下是形成愈傷組織，但這絕不意味著所有的細(xì)胞脫分化的結(jié)果都必然形成愈傷組織。相反，脫分化后可直接分化為胚性細(xì)胞而形成體細(xì)胞胚。

第67頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三四愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式

愈傷組織分生細(xì)胞團(tuán)可進(jìn)行再分化，即進(jìn)行形態(tài)建成，可再產(chǎn)生完整的植株。形態(tài)建成：外植體在適宜的培養(yǎng)條件下經(jīng)脫分化、分化或直接發(fā)育成各種形態(tài)完整的植物體的過程。在愈傷組織培養(yǎng)物中，細(xì)胞分裂常以無規(guī)則方式發(fā)生，并產(chǎn)生無明顯形態(tài)或極性的無序結(jié)構(gòu)組織塊，這時(shí)雖然在愈傷組織中發(fā)生了細(xì)胞分化，形成維管化組織和瘤狀結(jié)構(gòu)，但并無器官發(fā)生。只有滿足某些條件，才可從愈傷組織發(fā)生再分化而產(chǎn)生苗或根的分生組織，甚至胚狀體，進(jìn)而使它發(fā)育成苗或完整植株。第68頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三在組織培養(yǎng)中，從外植體形成器官或無性系的形態(tài)發(fā)生，有下面兩種方式：1．不定芽方式（unfixedbud）指細(xì)胞或愈傷組織培養(yǎng)物，通過形成不定芽再生成植株，這是細(xì)胞和組織培養(yǎng)中常見的器官發(fā)生方式。愈傷組織的器官發(fā)生順序有四種情況：（1）愈傷組織公有根或芽器官的分別形成，即無根的芽或無芽的根；（2）先形成芽，再在芽伸長后，在其莖的基部長出極而形成小植株，多數(shù)植物屬這種情況；（3）先產(chǎn)生根，再從根的基部分化出芽而形成小植株。這種情況較難誘導(dǎo)芽的形成，尤其對于單子葉植物；（4）先在愈傷組織的鄰近不同部位分別形成芽和根，然后兩者結(jié)合起來形成一株小植株。2．胚狀體方式（somaticembryo）指由培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出的胚胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而長成完整植株。（以后章節(jié)中介紹）第69頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三五．愈傷組織形態(tài)發(fā)生的調(diào)控來源于不同植物或同一種植物不同部們的愈傷組織，在顏色、結(jié)構(gòu)和生長習(xí)性上都可能存在差異，其遺傳生理功能也可能或是具有胚性，或是不具胚性，在不同的實(shí)驗(yàn)中由于目的的不同，對愈傷組織狀態(tài)的要求也不完全相同，但優(yōu)良的愈傷組織通常必須具備以下4個(gè)特性中的2-3個(gè)。1．

高度的胚性或再分化能力，以便從這些愈傷組織得到再生植物。2．

容易散碎，以便用這些愈傷組織建立優(yōu)良的懸浮系，并且在需要時(shí)能從中分離出全能性的原生質(zhì)體。3．

旺盛的自我增殖能力，以便用這些愈傷組織建立大規(guī)模的愈傷組織無性系。4．

經(jīng)過長期繼代保存而不喪失胚性，有便有可能對它們進(jìn)行各種遺傳操作。細(xì)胞和愈傷組織的形態(tài)發(fā)生，主要受外植體本身、培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境等三大類因素的調(diào)控。第70頁，講稿共79頁，2023年5月2日，星期三（一）材料本身1．遺傳型材料的基因型