高效液相色譜知識(shí)

第二十章高效液相色譜法highperformanceliquidchromatography；HPLC分析化學(xué)教研室李發(fā)美教授1經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入氣相色譜法的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，高壓輸送流動(dòng)相，高效固定相及高靈敏度檢測(cè)器，現(xiàn)代液相色譜分析方法。

2與經(jīng)典液相色譜法相比

顆粒極細(xì)（一般為10m以下）、規(guī)則均勻的固定相，(鍵合相)傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高；高壓輸液泵輸送流動(dòng)相，流速快，分析速度快；高靈敏度檢測(cè)器，靈敏度大大提高。紫外檢測(cè)器最小檢測(cè)限可達(dá)109g，而熒光檢測(cè)器最小檢測(cè)限可達(dá)1012g。

3與氣相色譜法相比不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，應(yīng)用范圍廣；可選用各種溶劑作為流動(dòng)相，對(duì)分離的選擇性有很大作用，選擇性高；一般在室溫條件下進(jìn)行分離，不需要高柱溫。

4第一節(jié)高效液相色譜法的主要類型和原理

一、主要類型 四類基本類型色譜法

分配色譜法（partitionchromatography）吸附色譜法（adsorptionchromatography）離子交換色譜法（IEC）空間排阻色譜法（SEC）5第一節(jié)高效液相色譜法的主要類型和原理

一、主要類型 四類基本類型色譜法

分配色譜法（partitionchromatography）吸附色譜法（adsorptionchromatography）離子交換色譜法（IEC）空間排阻色譜法（SEC）化學(xué)鍵合相色譜法6

其他色譜類型親合色譜法（affinitychromatography；AC）手性色譜法（chiralchromatography；CC）膠束色譜法（micellarchromatography；MC）電色譜法（electrochromatography；EC）7二、化學(xué)鍵合相色譜法

以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜法(bondedphasechromatography；BPC)化學(xué)鍵合相：采用化學(xué)反應(yīng)的方法將官能團(tuán)鍵合在載體表面所形成的固定相

8優(yōu)點(diǎn)：固定相的均一性和穩(wěn)定性好，在使用過程中不易流失，使用周期長(zhǎng)；柱效高；重現(xiàn)性好；能使用的流動(dòng)相和鍵合相的種類多，分離的選擇性高正相（normalphase，NP）和反相（reversedphase，RP）鍵合相色譜法：根據(jù)化學(xué)鍵合相與流動(dòng)相極性的相對(duì)強(qiáng)弱9（一搜）正隊(duì)相鍵翠合相娛色譜牢法固定絲式相：孝極性良鍵合羞相如氰刪基（遷－CN）、氨基籍（－NH2）或二再羥基練鍵合叼硅膠足。（碎經(jīng)典蹄：水扛飽和砍的硅益膠）流動(dòng)稼相：馬非極考性或請(qǐng)弱極駛性溶坑劑加備極性恩調(diào)整扔劑如烷李烴加戀醇類馳。（抄與水洽不混羞溶的兆溶劑休）適用觸范圍鋸：溶洲于有捎機(jī)溶艙劑的暢極性峰至中顧等極添性的延分子潛型化獻(xiàn)合物如一走些在資硅膠緒柱上貍分離校的物傍質(zhì)10正相穩(wěn)鍵合茫相色查譜法分離矛機(jī)制滑？分配妙：把梳有機(jī)池鍵合泊層作努為一叛個(gè)液嚴(yán)膜看屆待，準(zhǔn)溶質(zhì)禍在兩的相的盛溶解吸附略：溶叨質(zhì)與窄鍵合育極性鄰基團(tuán)襲間的某誘導(dǎo)恰、氫久鍵和品定向申作用分離緊選擇鏈性：極性餐強(qiáng)的破組分k大，癥后洗吸脫出指柱。流動(dòng)潛相的雖極性輩增強(qiáng)濾，洗羅脫能談力增創(chuàng)加，犧使組吩分k減小控，tR減小伏。11（二子）反危相鍵幣合相崗色譜撥法固定仿相：鋤非極觀性鍵麗合相如十晨八烷偉基硅分烷（C18，OD冊(cè)S）、辛烷蘿基（C8）鍵合萄硅膠流動(dòng)扯相：水為基言礎(chǔ)溶姿劑，欄加入拋一定態(tài)量與重水混棍溶的延極性斜調(diào)整縫劑常用冷甲醇狹－水射、乙慈腈－座水等應(yīng)用扔：最哄廣。皺非極屠性至拾中等樣極性進(jìn)的組往分，（還殘有有寺機(jī)酸貍、堿繩及鹽己等）12保留欠機(jī)制疏溶累劑理電論（so幼lv往op澆ho繳bi敲cth扶eo忠ry）溶質(zhì)忠的?？芰糁鲃円堑跞苜|(zhì)值分子肅與極敏性溶啟劑分申子間臥的排斥脊力，促臉使溶錦質(zhì)分戴子與詞鍵合燭相的示烴基粒發(fā)生疏水紡締合。不是邊溶質(zhì)乳分子痕與鍵葵合相濁間的爽色散嫌力，13反相麥鍵合絹相色否譜法保留菠行為倘的主歌要影狐響因爬素1、溶寶質(zhì)的雖分子陵結(jié)構(gòu)乳（極衣性）極性陪越弱釀，疏家水性左越強(qiáng)懇，k越大珍，tR也越狠大。同系木物碳凍數(shù)越帽多，季極性潛越弱迫，k越大敞；引入肢極性凱取代香基，導(dǎo)降低用疏水費(fèi)性，k值變剃小。2、固布定相鍵合殖烷基揪的疏管水性挪隨碳鏈寬的延庫(kù)長(zhǎng)而增愿加，撥溶質(zhì)代的k也增策大。硅膠蟲表面鍵合編烷基晌的濃咐度越錫大，則灑溶質(zhì)冊(cè)的k越大庸。14反相鋸鍵合詳相色疤譜法保留賞行為禾的主漿要影沒響因奴素3、流稈動(dòng)相極性面越強(qiáng)鄙，洗績(jī)脫能綁力越競(jìng)?cè)?，私使溶繼質(zhì)的k越大溶劑斯種類辰：水連為弱穩(wěn)溶劑依，醇遲為強(qiáng)進(jìn)溶劑溶劑繭比例窩：水縱的比佳例增久加，駐使k增大中性暈鹽的捕加入篩：使廈中性另溶質(zhì)扒的k增大pH：影響侍弱酸氧、弱保減的睜離解流動(dòng)號(hào)相的pH降低，弱酸k增大肆，tR增大司；弱知堿k變小眨。15離子渴抑制出色譜這法（io冒n漫su倍pp恨r(nóng)e灶ss方io傘n蘋ch碼ro留ma睛to頑gr種ap竊hy；IS壯C）用少戚量弱晴酸、職弱堿唉或緩糕沖溶堆液，惹調(diào)節(jié)久流動(dòng)倆相的pH，抑制悉有機(jī)誘弱酸茶、弱握堿的身離解麻，增秒加疏上水締疑合作胡用，籌使k變大啞。適用磁于3≤偶pKa≤皂7的弱朗酸、7≤殊pKa≤各8的弱激堿反相照鍵合燭相色參譜法16把離俘子對(duì)問試劑瓣加入男到含殼水流熊動(dòng)相擱中，穴組分澇離子認(rèn)在流且動(dòng)相故中與跟離子步對(duì)試愿劑的害反離朱子（co貫un應(yīng)te頌r箭io籌n）生成中性沈離子肌對(duì)，增直加溶孫質(zhì)與射非極油性固橋定相侄的作缺用，駐使k增加駁，改霜善分魂離效奧果。（三類）反史相離天子對(duì)頂色譜牽法pa狂ir藏ed末i躬onch泰ro沈ma無to折gr對(duì)ap床hy；PI料C禮io送n氧pa噸ir膠c陶hr淡om榨at礙og嗚ra絲式ph嘩y；IP萌C17反相熱離子泉對(duì)色援譜法離子遞對(duì)模能型33++()+3s3(+固定鎖相+()+B)+B+H+BHRSONaRSO+Na+BHRSORSO)BH離子對(duì)mB+ABAmA(s流動(dòng)晚相通式18影響爽容量污因子鋪的因潤(rùn)素離子友對(duì)試咸劑的云種類竊和濃那度：鉆碳鏈貿(mào)長(zhǎng)度腳增加蕩，溶作質(zhì)的k增大起；在很一定釋范圍質(zhì)內(nèi)試感劑的哈濃度網(wǎng)升高釀，溶食質(zhì)的k增大流動(dòng)嗽相的pH：有利眨于組鏈分和弱離子剩對(duì)試渡劑離版子化槽時(shí)（吳離子幸對(duì)的搬形成辨），晶組分徒的k值最筑大固定遼相酸、流顛動(dòng)相矛性質(zhì)題（同皇一般RP攀-H嫂PL剩C）。19適用屋范圍萍：有瞧機(jī)酸磨、堿癥、鹽敢，離漏子型菜和非簡(jiǎn)離子逃型化光合物樹的混齡合物撫。分析埋酸類朱或帶煙負(fù)電直荷物度質(zhì)：噴用季串銨鹽毀，如衣四丁庸基銨救磷酸糧鹽（TB豈A）和溴四化十等六烷作基三兔甲基勢(shì)銨（CT勉AB）等分析念堿類序或帶刻正電剩荷的悟物質(zhì)巴：用從烷基晨磺酸象鹽或狠硫酸叛鹽，拒如正突戊烷鞭基磺積酸鈉郊（PI惑CB5）、正己周烷基懲磺酸換鈉（PI舒CB6）、適用耳范圍煌和離馳子對(duì)山試劑逮的選國(guó)擇20第二弊節(jié)風(fēng)高效穴液相絕色譜廚法的沃固定森相和笛流動(dòng)丑相及收其選嗚擇固定護(hù)相應(yīng)倡符合份下列毅要求訂：顆粒閉細(xì)且木均勻死；傳質(zhì)匹快；機(jī)械避強(qiáng)度娃高，定能耐分高壓斤；化學(xué)寸穩(wěn)定帆性好來，不開與流浙動(dòng)相柏發(fā)生諷化學(xué)漂反應(yīng)華。21一、漸化學(xué)洞鍵合琴相色栗譜法編的固珠定相（一猛）鍵覽合相啄的種掃類非極策性鍵何合相聞：非極擱性烴留基，尸如C18﹑C8﹑C1與苯北基等維鍵合倍在硅緞膠表商面；用于飛反相館色譜屈；長(zhǎng)鏈盆烷基章可使市溶質(zhì)職的k增大懷，選制擇性鏈改善涉，載射樣量獵提高繞，穩(wěn)彼定性僑更好端。22鍵合圣相的委種類弱極羽性鍵邁合相丈：醚基糖和二糊羥基郊等鍵冤合相用于宿反相該或正賺相色當(dāng)譜極性楊鍵合桂相：常用唉氨基﹑氰基資鍵合株相（捧氰乙泡硅烷孔基≡Si吃(C拼H2)2CN垮)鍵合經(jīng)硅膠一般特用于概正相企色譜特殊稻用途倡的鍵橋合相23（二登）鍵麥合相由的性凝質(zhì)和姓特點(diǎn)鍵合脆反應(yīng)硅氧鉗烷（Si－O－Si－C）型：惠氯硅授烷與駕硅膠仿進(jìn)行硅烷站化反威應(yīng)如：YW架G－C18H37，無定醫(yī)形硅窮膠YW符G上鍵亮合了十八脆硅烷起基；Sp納he協(xié)ri諒so澡rbOD宰S，球形援硅膠Sp歡he速ri義so產(chǎn)rb上鍵善合了OD忙S。24鍵合羨相的甲性質(zhì)姥和特押點(diǎn)鍵合職相的池性質(zhì)含碳剩量：焰含碳肺的百饞分?jǐn)?shù)覆蓋蝕度儲(chǔ)：已凳反應(yīng)分的硅控醇基喉數(shù)目膨占硅量膠表堅(jiān)面硅席醇基茅總數(shù)般的比篇例封尾賽（en惹d-黃ca聾pp課in累g）：在鍵穗合反山應(yīng)后鼓，用追三甲棕基氯匹硅烷參等進(jìn)胸行鈍將化處奮理，尺減少易殘余訪硅醇鎖基。25鍵合州相的敗特點(diǎn)使用戰(zhàn)過程恩中不傘流失看；化學(xué)吉穩(wěn)定鼠性好順；適于睡梯度棒洗脫語(yǔ)；載樣近量大注意皂：流動(dòng)憶相的pH一般征應(yīng)在3-孕8，否瓣則會(huì)雹引起貫硅膠愁溶解爐；(也有塔適用姻寬pH范圍些的鍵忘合相)。鍵合琴相的兔性質(zhì)置和特栗點(diǎn)26二、劈燕化學(xué)奏鍵合纏相色極譜法周的流挖動(dòng)相對(duì)流畜動(dòng)相旱的要逼求：與固裳定相泰不發(fā)嚴(yán)生化喉學(xué)反劫應(yīng)。對(duì)試覆樣有鵝適宜肯的溶吸解度魔。使k在1~什10范圍樂內(nèi)，與檢賺測(cè)器巨相適位應(yīng)。閱例如洽用紫誰(shuí)外檢技測(cè)器讀時(shí)，盡選用賤截止沖波長(zhǎng)籮小于御檢測(cè)案波長(zhǎng)扎的溶定劑。純度僻高，謙粘度鬧小。釀低粘塑度流啞動(dòng)相勺如甲既醇﹑乙腈故等可趙以降領(lǐng)低柱撒壓，耗提高廈柱效好。27（一艇）流認(rèn)動(dòng)相啦對(duì)分眨離的摟影響n由色俗譜柱紹（固宏定相姜）性解能決息定，α主要誦受溶蘭劑種篇類的檔影響慮，k受溶泛劑配鍬比的制影響矮。28（二）劇流動(dòng)雙相的兔強(qiáng)度閣和選蔥擇性溶劑說的極虹性（波強(qiáng)度尸）正相漏色譜廁：溶站劑極土性越斬強(qiáng)，僑洗脫礦能力惜越強(qiáng)反相機(jī)色譜瀉：極體性弱鏡的溶鎖劑洗律脫能毀力強(qiáng)溶劑爽的選塌擇性不同叫種類裁的溶饞劑，層分子練間的無作用嗓力不萬同，茄故選盜擇性逮不同混合艇溶劑糖（二邪元或戴多元適流動(dòng)土相）29三、文分離孩條件門的選嘉擇（一）HP區(qū)LC中的逼速率籍理論渦流吳擴(kuò)散A=2λdp球形佩、小慌粒度隆、均飯勻（RS臉D＜5%）固定符相，笑勻漿勝高壓攔填充障，以秋降低A?？v向牢擴(kuò)散β=2γDm可以廚忽略筋。因?yàn)镈l很小念，室漁溫操灑作，醫(yī)且U大于U最佳，30HP南LC中的乳速率尋理論傳質(zhì)延阻抗固定歌相傳賞質(zhì)阻惡抗CS可以伸忽略嫩，瞇因df極小流動(dòng)圣相傳現(xiàn)質(zhì)阻腰抗Cm要求辱：dp小，Dm大31靜態(tài)防流動(dòng)估相傳料質(zhì)阻癥抗漠：由于忍部分抗流動(dòng)螺相在泄固定給相微鉆孔內(nèi)夜的滯薄留靜態(tài)畜流動(dòng)務(wù)相傳夫質(zhì)阻認(rèn)抗系往數(shù)CsmCsm∝dp2，Csm∝1/Dm，而Dm∝T/η要求:固定宰相dp2、流動(dòng)駐相η都小HP虧LC中的荷速率伏理論32H=A+Cmu+Csmu原因圈：化般學(xué)鍵嗽合相漿，液中體流棋動(dòng)相結(jié)果美：HP麻L(zhǎng)C的實(shí)蠟驗(yàn)條陡件應(yīng)霉該是錦：①小粒永度、塘均勻宅的球胸形化拆學(xué)鍵瞇合相神；②低粘體度流航動(dòng)相腳，流址速不妨宜過假快；③柱溫沃適當(dāng)裁。HP梢LC中的每速率讓理論33（二準(zhǔn)）正售相鍵仰合相療色譜裳法的染分離刪條件固定藝相極性妄鍵合崖相周如氰顛基、叨氨基虎鍵合愉相等流動(dòng)捷相烷烴障加適開量極哪性調(diào)秩節(jié)劑34（三帶）反魔相鍵版合相合色譜桂法的尼分離代條件固定夢(mèng)相非極漁性鍵粘合相盯如OD而S流動(dòng)淘相以水唱為基殲礎(chǔ)溶超劑，柿加入給甲醇均、乙纏腈等斜極性梨調(diào)節(jié)賞劑弱酸昨、弱搏堿或誕緩沖脆鹽作春為離勒子抑紙制劑加入0.攪1%韻∽1血%的醋燒酸鹽旱、磷至酸鹽很可減規(guī)少殘?bào)H余硅炊醇基身的作謠用35（四敏）反春相離熊子對(duì)燒色譜衡法的餐分離愁條件固定妄相晉盡可此能選粘擇表牲面覆橫蓋度評(píng)高且雄疏水陳性強(qiáng)瞎的非罷極性出鍵合槳相，離子何對(duì)試配劑居離子瘋對(duì)試淋劑所高帶的永電荷澡應(yīng)與悲試樣受離子演的電位荷相塞反流動(dòng)市相pH使試逢樣組宴分與穩(wěn)離子槍對(duì)試棵劑全堆部離翠子化有機(jī)而溶劑恢及其優(yōu)濃度憶同一遷般HP眠LC36第三景節(jié)爹高效脂液相殖色譜鋪儀組成輸液憑系統(tǒng)進(jìn)樣傷系統(tǒng)色譜錄柱系毒統(tǒng)檢測(cè)料系統(tǒng)數(shù)據(jù)耀記錄抖處理檢系統(tǒng)37一、今輸液資系統(tǒng)高壓蚊輸液藥泵恒流溉泵：猾在輸舉送流囑動(dòng)相戀過程格中流趙量恒遙定。歉常用盜柱塞始往復(fù)普泵雙泵氣：為頸了克窯服流平量的擊脈動(dòng)短。糠有微串聯(lián)妨式和朗并聯(lián)敏式3839輸液舌系統(tǒng)輸液箭泵應(yīng)矩具備壟的性通能：流量娃精度遼高且戒穩(wěn)定流量倉(cāng)范圍寶寬能在租高壓比下連費(fèi)續(xù)工節(jié)作液缸壤容積睜小密封度性能紹好，身耐腐肚蝕40輸液淘系統(tǒng)輸液授泵操敞作注哈意事垂項(xiàng)：防止艱固體要微粒菊進(jìn)入幼泵體流動(dòng)考相不循應(yīng)含挺有腐常蝕性兩物質(zhì)防止墨溶劑本瓶?jī)?nèi)換的流欠動(dòng)相鳥被用狐完不超殘過規(guī)滿定的欣最高肢壓力流動(dòng)奮相一環(huán)般應(yīng)幕該先殖脫氣41二、沸分離農(nóng)和進(jìn)甲樣系堡統(tǒng)進(jìn)樣器進(jìn)樣損閥（鑰六通較閥）構(gòu)、自腎動(dòng)進(jìn)戰(zhàn)樣裝培置色譜棕柱（co逐lu丸mn）由柱余管和先固定搜相組跨成分析代柱、的制備蹤蝶柱性能習(xí)評(píng)價(jià)H、n、fs、k和α的重隸復(fù)性斃，或R。4243三、帖檢測(cè)仁系統(tǒng)（一渠）檢該測(cè)器(d嫁et爺ec藝to征r)的主讓要性脖能要求看：靈敏呆度（se匯ns蛋it暖iv環(huán)it救y）高（搬檢測(cè)餓限低鞋）噪音灶（no侍is鼓e）低線性耗范圍各（li檢ne算ar皂r句an灘ge）寬重復(fù)攜性（re形pe鏟at秋ab岡il飛it比y）好適用以范圍杠廣（削通用吸型、騎專屬羊型）44（二拉）紫測(cè)外檢法測(cè)器(u治lt棚ra妥vi術(shù)ol蕉et必d駝et黑ec久to抖r)檢測(cè)誼原理著：朗伯局－比惹爾(L稿am朵be德rt礙-B趁ee宜r)定律曠，響毛應(yīng)信畏號(hào)（靠吸光谷度）傲與濃鐮度成園正比A=εC乳l特點(diǎn)籌：靈敏鍵度較揚(yáng)高（10-6—1央0-9g/飾ml），噪音扭低，雹線性遼范圍糾寬，禍穩(wěn)定嗎性好槳，適今于梯棕度，坐不破廟壞樣旅品，卸應(yīng)用藥廣（賊分析冤、制騙備）漁。局限皮：只能男檢測(cè)騎有紫邪外吸驕?zhǔn)盏钠尬镔|(zhì)噴，流鹽動(dòng)相戚的截幻玉止波壩長(zhǎng)應(yīng)饒小于州檢測(cè)山波長(zhǎng)鴨。專屬型、固濃度掀型檢暖測(cè)器45紫外筒檢測(cè)梅器固定講波長(zhǎng)桃檢測(cè)帶器來：25撤4n圈m可變責(zé)波長(zhǎng)量檢測(cè)山器：光源禾：氘余燈（旁和鎢景燈），20油0—梳40輔0（80畫0）nm，單色子器，噴流通住池（膏試樣角），厘光電管光路壟系統(tǒng)毯和紫原外分我光光播度計(jì)嬌相似光電必二極稻管陣羨列檢屢測(cè)器(p幼ho眾to辦di考o(jì)d奸e續(xù)ar殲ra毀y靜de切te碼ct紛or；PD嗚AD句)：一系介列光脆電二恩極管蜂，一個(gè)陽(yáng)二極瘋管對(duì)紙應(yīng)接崗受光市譜上領(lǐng)約1n題m譜帶佳寬的欺單色抵光4647紫外肝檢測(cè)罩器光電妹二極凡管陣執(zhí)列檢慈測(cè)器工作將原理豎：復(fù)奸光通宴過流銅通池留，再獨(dú)進(jìn)入杏單色使器，倡分光知后照亂射在拋二極截管陣跟列裝仍置上瞧，同請(qǐng)時(shí)獲漆