假單胞菌屬解析課件

假單胞菌屬主講：王國興內(nèi)容提要假單胞菌簡介及分類銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制研究熒光假單胞菌惡臭假單胞菌斯氏假單胞菌產(chǎn)堿假單胞菌假單胞菌與環(huán)境生物修復(fù)假單胞菌的生物防治作用假單胞菌與生物轉(zhuǎn)化假單胞菌的致病性假單胞菌產(chǎn)生的抗生素研究簡介及分類假單胞菌屬是微生物的重要類群,也是分布最廣的微生物之一。多樣的生境不僅造就了假單胞菌擁有較廣的生長溫度、pH值范圍,較多的營養(yǎng)代謝類型,同時(shí)也為人類提供了多樣的遺傳資源。專性需氧的革蘭氏染色陰性無芽胞桿菌，呈桿狀或略彎。菌體大小(0.5～1)×(1.5～4)微米。具端鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。有些株產(chǎn)生熒光色素或（和）紅、藍(lán)、黃、綠等水溶性色素，不發(fā)酵糖類。大多數(shù)菌的適溫為30℃。DNA中的G+C克分子含量為58～70%。存在于土壤、淡水、海水中。目前已確認(rèn)有29種，其中至少有3種對動(dòng)物或人類致病。盡管假單胞菌科的絕大部分細(xì)菌原先都被歸類于假單胞菌屬，但現(xiàn)在只有rRNAⅠ群的細(xì)菌屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）共7種細(xì)菌，代表菌種為銅綠假單胞菌。種類：銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)熒光假單胞菌(P.fluorescence)惡臭假單胞菌(P.putica)斯氏假單胞菌(P.stutizeri)曼多辛假單胞菌(P.mendocina)產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)假產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa）原稱綠膿桿菌。在自然界分布廣泛，為土壤中存在的最常見的細(xì)菌之一。各種水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有本菌存在。本菌存在的重要條件是潮濕的環(huán)境。銅綠假單胞菌－形態(tài)染色

銅綠假單胞菌－生物學(xué)性狀專性需氧、營養(yǎng)要求不高。最適溫度35℃，42℃生長，4℃不生長。產(chǎn)生熒光素和藍(lán)綠色水溶性的綠膿素，培養(yǎng)物呈藍(lán)綠色。培養(yǎng)物有生姜?dú)馕丁ｃ~綠假單胞菌－致病性廣泛存在環(huán)境中的條件致病菌，是醫(yī)院內(nèi)感染主要病原菌。可引起皮膚感染、呼吸道感染、泌尿道感染、燒傷感染、囊性纖維變性等。有多種毒力因子：包括菌毛、莢膜多糖、內(nèi)毒素、外毒素、綠膿菌素、蛋白酶、磷脂酶等。角膜炎銅綠假單胞菌－－微生物學(xué)檢查采取濃汁，創(chuàng)面滲出液，痰，尿，血液等標(biāo)本，或在可疑物品器械上取材，在利用血瓊脂培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)細(xì)菌。根據(jù)菌落特點(diǎn)，色素，生化反應(yīng)等進(jìn)行鑒定。運(yùn)用血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，噬菌體分型做醫(yī)院內(nèi)感染的追蹤調(diào)查銅綠假單胞菌的菌落分型典型型大腸菌樣型粘液型侏儒型粗糙型粘液型（麥康凱平板）粘液型（血平板）菌落光滑凸起成粘液狀侏儒型（麥康凱平板）細(xì)小，無光澤半透明菌落典型型（麥康凱平板）菌落呈灰綠色大小不一扁平濕潤邊緣不規(guī)則呈傘狀伸展表面?？梢娊饘俟鉂?/p>

典型型（普通平板上）產(chǎn)綠膿素瓊脂染成黃綠色粗糙型（麥康凱平板）菌落中央凸起邊緣扁平表面粗糙大腸型（麥康凱平板）菌落圓形凸起似大腸埃希菌菌落銅綠假單胞菌－－檢驗(yàn)程序標(biāo)本

增菌

分離培養(yǎng)（血平板）最后鑒定可疑菌落（性狀、色素）初步鑒定

涂片染色鏡檢血標(biāo)本色素鑒定生化反應(yīng)42℃生長分型涂片鏡檢氧化酶菌落特征綠膿素氣味銅綠假單胞菌－防治原則加強(qiáng)一些特殊病房及檢查室、診療器械的消毒管理。避免醫(yī)務(wù)人員與病人之間的交叉感染。治療過程中，應(yīng)合理選擇有效抗生素。銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制研究銅綠假單胞菌常引起菌血癥、肺炎、泌尿系統(tǒng)感染燒傷感染和囊性纖維化繼發(fā)感染等疾病,由于其耐藥菌株不斷產(chǎn)生,耐藥性不斷變化,已成為醫(yī)院內(nèi)獲得性感染最嚴(yán)重的條件致病菌之一。銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制的研究,對監(jiān)控醫(yī)院內(nèi)感染菌群、檢測其耐藥性、指導(dǎo)抗生素的合理利用極為重要。同時(shí),由于銅綠假單胞菌分布廣泛,可以推知其耐藥機(jī)制在其他病原菌中也極可能廣泛存在,對銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制的研究對其他許多病原菌的控制也具有指導(dǎo)意義。銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)理主要有4種,一是產(chǎn)生抗生素滅活酶或抗生素修飾酶;二是改變抗菌藥物的作用靶位,逃避抗菌藥物的抗菌作用;三是膜屏蔽與主動(dòng)外排,限制藥物到達(dá)作用靶位;四是形成生物膜。有研究顯示，不合理的單藥應(yīng)用及長時(shí)間輪流使用多種抗菌藥物是導(dǎo)致泛耐藥銅綠假單胞菌出現(xiàn)的重要因素。熒光假單胞菌主要特征1．細(xì)菌特性革蘭陰性桿菌，呈單個(gè)或成對排列，一端叢毛菌，運(yùn)動(dòng)活潑，偶見無鞭毛無動(dòng)力的菌株。專性需氧，營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上可生長，在麥康凱和SS平板上亦可生長，最適生長溫度為25℃~30℃，大多數(shù)菌株在4℃生長，37℃或42℃不生長。約94%的菌株產(chǎn)生水溶性熒光素（青膿素），在紫外線（360nm）照射下呈黃綠色熒光，有些菌株產(chǎn)生藍(lán)色色素，不擴(kuò)散。氧化酶陽性，氧化葡萄糖、木糖產(chǎn)酸，對麥芽糖多不分解，水解精氨酸，多能液化明膠，卵磷酯酶陽性。本菌對卡那霉素敏感。被檢驗(yàn)的肉含有熒光假單胞菌2．臨床意義熒光假單胞菌（P.fluorescens）存在于土壤和水等環(huán)境中，常與食物（雞蛋、血、牛乳等）腐敗有關(guān)，可作為咽部的正常菌群存在，是人類少見的條件致病菌，偶從泌尿道感染病人尿中分離出。由于具有嗜冷性，可在冰箱儲(chǔ)存血液中繁殖，若輸入含有此菌的血庫血液，可導(dǎo)致病人不可逆性的休克而死亡。3．微生物學(xué)檢驗(yàn)?zāi)?、分泌物等臨床標(biāo)本可直接接種在血平板上，血液標(biāo)本可先于20℃~30℃進(jìn)行增菌后再接種血平板分離。不能在35℃或37℃進(jìn)行培養(yǎng)，以免發(fā)生假陰性。本菌鞭毛3根以上，42℃不能生長，不產(chǎn)生綠膿素，可以與銅綠假單胞菌相區(qū)別。本菌的最低鑒定特征有：單端鞭毛3根以上，動(dòng)力陽性；氧化分解葡萄糖，不分解麥芽糖，氧化酶陽性，精氨酸水解陽性，明膠液化陽性；可產(chǎn)生熒光素，不產(chǎn)生綠膿素，4℃生長，42℃不生長?；加谐嗥げ〉聂~，病源為熒光假單胞菌熒光假單胞菌染色圖片4.熒光假單胞菌植物病害防治作用熒光假單胞菌對多種植物病害具有防治作用，它首先在植物根際定殖，然后靠噬鐵索對鐵離子的競爭和抗生素的拮抗作用抑制病原菌的生長發(fā)育，保護(hù)植物體免受病菌危害，熒光菌在根際的定殖能力與它同根系分泌物的凝集能力有關(guān)，與它在根表的短期不可逆吸附也有一定關(guān)系.熒光菌菌劑研究較多，目前最好的可貯存一年.雖然熒光菌已成功地用于一些病害的生物防治，但仍有許多問題有待解決。葉面噴施后，菌劑能在植物體內(nèi)快速傳導(dǎo)，可有效抑制侵染到植物體內(nèi)的青枯病菌，立枯絲核菌，鐮刀菌以及軟腐病菌。許多問題有待解決，比較突出的有:

1、菌株的有效性．熒光假單胞菌生防菌株的防治效果一般為50-60%，還有很大潛力可控，擴(kuò)大篩選范圍和在田間直接篩選可能是找到優(yōu)良菌株的可靠途徑。2、作用機(jī)制研究．已明確熒光假單胞菌首先在作物根際定殖，然后靠競爭及抗生作用抑制病害發(fā)展;其它作用機(jī)制尚無定論．但噬鐵素及抗生素的種類與防病效果有很大關(guān)系，如在小麥全蝕病生防中，熒光菌B10的防治作用受FeCl3抑制，而在煙草黑脛病中，熒光菌CHAO的防治效果需要有足夠FeCl3才能表達(dá)，這反映了熒光菌防病機(jī)制的復(fù)雜性.研究不同噬鐵素及抗生素的作用機(jī)制，對于篩選有效菌株，指導(dǎo)病害生物防治具有重要意義．3、菌株篩選的依據(jù)．大多數(shù)熒光菌的篩選僅依靠平皿上對目標(biāo)病原菌的拮抗作用，而實(shí)際上與生防有關(guān)的性狀很多，如在根際的定殖能力，對不同環(huán)境的適應(yīng)能力等;這需要簡便快速的篩選技術(shù)及可靠的篩選標(biāo)準(zhǔn)，但目前這兩方面的研究工作尚有許多不足之處．4、菌劑制備．目前，熒光假單胞菌菌劑的生產(chǎn)成本較高，貯存期較短，在應(yīng)用上處于不利局面．雖然改善培養(yǎng)條件后有效貯存期大大延長，成本顯然不夠經(jīng)濟(jì)。5、防效不穩(wěn)定．這是大部分生物防治研究在應(yīng)用方面普遍遇到的問題，熒光菌也不例外．應(yīng)對菌株進(jìn)行人工改良，或采用混合群體，使之具有更好的抗菌能力和較強(qiáng)的適應(yīng)能力，發(fā)揮最大的防病潛力，在這一方面，彭于發(fā)等作了有益嘗試，他們使用轉(zhuǎn)座子誘變法對熒光菌菌株CNl2進(jìn)行遺傳改造，得到突變株熒光93，熒光93對小麥全蝕病的防效高于自然菌株CNl12說明人工改良是獲得優(yōu)良生防菌的一種可行手段。6、菌株的有害性．菌株對作物的不利影響是生防菌篩選過程中應(yīng)注意的問題，植物體對噬鐵素的種類具有選擇性，不相適應(yīng)的組合中，植物體產(chǎn)生缺鐵癥狀，例如，假單胞菌素(Pseudobactin)可抑制玉米等幾種作物對鐵的吸收，玉米表現(xiàn)缺鐵癥.惡臭假單胞菌1.主要特征革蘭陰性桿菌，有些菌株為卵圓形，單端叢毛菌，運(yùn)動(dòng)活潑。專性需氧，最適生長溫度25℃~30℃，42℃不生長，4℃生長不定，菌落與銅綠假單胞菌相似，但只產(chǎn)生熒光素（青膿素），不產(chǎn)生綠膿素，借此可與銅綠假單胞菌相區(qū)別，其陳舊培養(yǎng)物有腥臭味。2.臨床意義惡臭假單胞菌（P.putica）為魚的一種致病菌，常從腐敗的魚中檢出，可作為人類咽部的正常菌群，是人類少見的條件致病菌，偶從人類尿道感染、皮膚感染和骨髓炎標(biāo)本中分離出，分泌物有腥臭味。3.微生物學(xué)檢驗(yàn)鑒定中注意與其他假單胞菌相區(qū)別，只產(chǎn)生熒光素不產(chǎn)生綠膿素，42℃不生長可與銅綠假單胞菌區(qū)別；不液化明膠、不產(chǎn)生卵磷酯酶、陳舊培養(yǎng)物上有腥臭味，有別于熒光假單胞菌。血平板檢驗(yàn)由惡臭假單胞菌及熒光假單胞菌等革蘭氏陰性短桿菌引起?；疾〕跗诳梢婔~的體表有點(diǎn)狀白色黏液物附著并逐漸蔓延擴(kuò)大，嚴(yán)重時(shí)鱗片基部充血、豎起，鱗片脫落，體表及鰭基部充血，肝、腎充血，靠邊緩游不吃食，不久即死亡。斯氏假單胞菌

1．細(xì)菌特性革蘭陰性桿菌，一端單鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑；最適生長溫度35℃，4℃不生長，大部分菌株在42℃生長，氧化葡萄糖產(chǎn)酸，在6.5%高鹽培養(yǎng)基中可生長；營養(yǎng)要求不高，普通平板可生長，新分離菌株在培養(yǎng)基上可形成特征性干燥、皺縮樣菌落，黏附于瓊脂表面難以移動(dòng)，可產(chǎn)生黃色色素，無熒光。黃色的為斯氏假單胞菌2．臨床意義斯氏假單胞菌(P.stutizeri)存在于土壤和水中，在醫(yī)院設(shè)備及各種臨床標(biāo)本中亦有發(fā)現(xiàn)，本菌引起的感染并不多見，偶可引起抵抗力低下患者傷口、泌尿道、肺部感染等。3．微生物學(xué)檢驗(yàn)注意與曼多辛假單胞菌相鑒別，其特征性菌落、精氨酸雙水解試驗(yàn)陽性、不分解麥芽糖和甘露醇，有別于曼多辛假單胞菌。斯氏假單胞菌產(chǎn)堿假單胞菌產(chǎn)堿假單胞菌是革蘭陰性無芽胞桿菌，為臨床常見條件致病菌，可引起人體感染，該菌常污染自來水和環(huán)境表面及各種醫(yī)療器械，可引起醫(yī)院內(nèi)感染。顯微圖患病的西瓜，病原菌為產(chǎn)堿假單胞菌產(chǎn)堿假單胞菌的耐藥性分析（藥敏試驗(yàn)用K-B紙片擴(kuò)散法）假單胞菌與環(huán)境生物修復(fù)環(huán)境生物修復(fù)就是利用生物對環(huán)境中的有毒、有害物質(zhì)進(jìn)行降解。與傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法相比,環(huán)境生物修復(fù)具有投資小、環(huán)境友好、無二次污染、易于為公眾接受等優(yōu)點(diǎn),越來越受到全世界的認(rèn)同。假單胞菌是自然界的土著微生物(尤其是在土壤中),其生長溫度、pH值變化范圍較大,營養(yǎng)代謝類型多樣,人類的研究也較其他絕大多數(shù)自然界土著微生物深入,在該領(lǐng)域具有較大的優(yōu)勢。假單胞菌在環(huán)境的生物修復(fù)方面進(jìn)行了廣泛的研究,大體可分為有機(jī)物污染和重金屬污染的生物修復(fù)兩大類。研究發(fā)現(xiàn),假單胞菌降解有機(jī)污染物質(zhì)的基因多數(shù)是在質(zhì)粒上,降解性質(zhì)粒的存在為降解工程菌的構(gòu)建提供了可能。假單胞菌對重金屬污染環(huán)境的生物修復(fù)機(jī)理包括以下幾點(diǎn):(1)通過表面吸附、胞內(nèi)沉淀以及成礦作用來降低重金屬離子的沉淀性;(2)通過氧化還原反應(yīng)改變重金屬離子的價(jià)態(tài)而減弱或消除重金屬離子的毒性;(3)分泌一些與重金屬離子緊密結(jié)合的蛋白,而且形成的重金屬離子-蛋白質(zhì)復(fù)合體不易為動(dòng)植物吸收,限制了重金屬離子在食物鏈中的流動(dòng)。目前,國內(nèi)外用假單胞菌對重金屬污染進(jìn)行環(huán)境生物修復(fù)主要是利用假單胞菌的某些種對重金屬有抗性并可將其在體內(nèi)富集的特性。利用假單胞菌分解垃圾（具有很強(qiáng)的產(chǎn)生氨等腐敗產(chǎn)物的能力。）假單胞菌的生物防治作用假單胞菌能產(chǎn)生多種抗生素,改善植物營養(yǎng),促進(jìn)植物生長,且能降解土壤中有毒物質(zhì),對植物促生長防病作用顯著。部分假單胞菌株具有殺蟲功能,由假單胞菌可開發(fā)一系列生物防治產(chǎn)品。1.假單胞菌防治害蟲作用類產(chǎn)堿假單胞菌為昆蟲病原菌,對草地蝗蟲和竹蝗等具有良好的致死作用,其殺蟲作用主要靠產(chǎn)生蛋白質(zhì)。2.假單胞菌對植物病害的生物防治作用改善植物營養(yǎng)、降解有毒物質(zhì)、產(chǎn)生抗生素和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、改善植物微環(huán)境和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性等生物防治作用。沼澤紅假單胞菌解決水產(chǎn)養(yǎng)殖的藍(lán)藻污染防治由小麥全蝕病菌Ggt引起的小麥全蝕病低溫有助于蛋白質(zhì)的正確折疊,假單胞菌有很大一部分屬于耐冷菌,用其作為宿主可生產(chǎn)一些用E.coli等中溫菌宿主表達(dá)不甚理想的蛋白質(zhì)。同時(shí),假單胞菌的營養(yǎng)類型多樣,利用其多樣的代謝途徑可以為人類生產(chǎn)某些其他菌株無法生產(chǎn)的物質(zhì)。另外,人們對假單胞菌的研究也較為深入,故假單胞菌在工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域潛力巨大。假單胞菌在生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的研究可分為兩個(gè)大的方面：

一是以假單胞菌細(xì)胞體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。二是用假單胞菌產(chǎn)生的酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。假單胞菌與生物轉(zhuǎn)化假單胞菌全細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化主要用于一些化學(xué)物質(zhì)、藥物和農(nóng)用化合物中間體的大批量工業(yè)合成。假單胞菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化的應(yīng)用范圍比較狹窄,典型的例子較少,這主要是由于全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化有菌株不穩(wěn)定、產(chǎn)率低等原因,但是當(dāng)用酶轉(zhuǎn)化需要很昂貴的輔酶或者轉(zhuǎn)化需要多步反應(yīng)時(shí),全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化不失為一個(gè)很好的選擇。用假單胞菌的酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的研究較全細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究廣泛和深入,常見的用于生物轉(zhuǎn)化的假單胞菌的酶有:Aminopeptidase(DSM,TheNetherlands)、Arylalcoholdehydrogenase(Pfizer,USA)等。含有沼澤紅假單胞菌，養(yǎng)殖動(dòng)物營養(yǎng)添加劑菌體改善動(dòng)物腸道微生態(tài)環(huán)境假單胞菌的致病性假