代謝物酶法分析技術(shù)

代謝物酶法分析技術(shù)第1頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月

第五章代謝物酶法分析技術(shù)江蘇大學鄭鐵生全國高等醫(yī)藥院校醫(yī)學檢驗專業(yè)規(guī)劃教材臨床生物化學檢驗（第二版）第2頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月教學目標與要求掌握：代謝物酶法分析技術(shù)的概念，單酶反應(yīng)直接法、酶促偶聯(lián)法等方法的設(shè)計原理，脫氫酶和過氧化物酶指示系統(tǒng)的應(yīng)用原理，以及平衡法和速率法的設(shè)計要求。熟悉：代謝物酶法分析技術(shù)的理論基礎(chǔ)，酶循環(huán)法、酶活性恢復法、激活劑和抑制劑測定法的設(shè)計原理，平衡法和速率法的優(yōu)缺點。了解：試劑酶的質(zhì)量要求，以及代謝物酶法分析技術(shù)的發(fā)展前景。3第3頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月代謝物酶法分析技術(shù)是指用酶法分析的方法來測定人體內(nèi)的代謝物或代謝產(chǎn)物的技術(shù)。

酶法分析（enzymaticmethod）是以酶為試劑測定酶促反應(yīng)的底物、輔酶、輔基、激活劑或抑制劑，以及利用酶促反應(yīng)測定酶活性的一類方法。代謝物酶法分析技術(shù)的概念4第4頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月目錄

代謝物酶法分析的理論基礎(chǔ)1代謝物酶法分析的方法

2代謝物酶法分析的設(shè)計要求

3小結(jié)與展望4返回總目錄5第5頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月

代謝物酶法分析

平衡法（終點法）

速率法（動力學法）

代謝物酶法分析的理論基礎(chǔ)16第6頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月平衡法是指標本中待測物的量有限，經(jīng)過酶促反應(yīng)逐漸被消耗，當剩余的底物量很?。?lt;1%～5%）時，指示反應(yīng)信號逐漸達到平衡，即通常所說的終點，所以又稱為終點法(end-pointmethod)。平衡法的特點是測定底物的總變化量，即測定的是“濃度”。平衡法基本理論(1)7第7頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月積分得：

米氏方程

改寫為

式中[S0]為待測物，[St]為待測物至反應(yīng)t時間后的濃度。平衡法基本理論(1)8第8頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月若反應(yīng)達到平衡，假設(shè)，即[S0]－[St]≈[S0]，

以上積分式：

則可簡化為：說明達到平衡所需的時間與Km、Vmax、[S0]有關(guān)，Km越小、Vmax越大（加入酶量越多）、[S0]越?。ù郎y物越少）則達到平衡所需的時間越短。平衡法基本理論(1)9第9頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月若[S0]<<Km

積分得：

可簡化為：

若同時做標準管，不管反應(yīng)到達何種程度，只要標準管與測定管反應(yīng)時間（t）一致，則有：平衡法基本理論(1)10第10頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月

標準管的[S0－St]與待測管的[S0－St]分別代表消耗量，也代表轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的量，可以用產(chǎn)物的吸光度來表示（As和Au）。標準管的[S0]與測定管的[S0]分別表示為Cs和Cu?？珊喕癁椋?/p>

平衡法基本理論(1)11第11頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月當[S0]－[St]≈[S0]，即反應(yīng)基本達到平衡，Au和As基本穩(wěn)定不變，此時測定誤差最小。如果存在基質(zhì)效應(yīng)，兩者反應(yīng)程度不一，若按上式計算就會帶來誤差。此式是平衡法測定代謝物的基本原理此公式成立是前提條件平衡法基本理論(1)12第12頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月速率法(rateassay)又稱動力學法、連續(xù)監(jiān)測法，測定的是速率（通常指的是初速度），依據(jù)是當?shù)孜锏南牧枯^小時(<5%)，酶促反應(yīng)呈一級反應(yīng)，此時的反應(yīng)速度（v）與代測物的濃度成正比例。速率法的關(guān)鍵是如何使酶促反應(yīng)成一級反應(yīng)。

速率法基本理論(2)13第13頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)米氏方程：

①當[S]<<Km，則[S]+Km≈Km②當酶量固定不變時，酶促反應(yīng)的最大速度Vmax也不變符合一級酶促反應(yīng)米氏方程改為：

速率法基本理論(2)14第14頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月若同時帶標準管，則有：標準管的[S0]與測定管的[S0]分別表示為Cs和Cu，速度用△A/min來表示。上式改寫為：速率法測定代謝物濃度的原理

前提條件是測定初速度。越偏離初速度，測定誤差則越大。速率法基本理論(2)15第15頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月在臨床操作中，只要測定期間待測物消耗<5%，只要測定兩個固定時間的吸光度差值，就可以采用標準濃度對照法計算樣本濃度，這種方法又稱為固定時間法(fixedassay)。速率法基本理論(2)16第16頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月平衡法的開始一段時間都有可能遵循一級反應(yīng)規(guī)律。相反，速率法只要時間足夠長，也會達到平衡。對于平衡法來說關(guān)鍵是確定達到平衡所需的時間。對于速率法來說關(guān)鍵是如何使酶促反應(yīng)成一級反應(yīng)。

平衡法與速率法的相互聯(lián)系返回章目錄17第17頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月酶作用的特異性高，血清等體液樣品不需預處理就能測定，簡化了實驗程序；試劑酶大多是蛋白質(zhì)，沒有毒性，避免了化學品對環(huán)境的污染；酶促反應(yīng)溫和，制成試劑盒可適用于自動分析。

代謝物酶法分析主要優(yōu)點代謝物酶法分析在準確性、精密度、靈敏度和線性測定范圍等方面都優(yōu)于傳統(tǒng)的化學法代謝物酶法分析的方法

218第18頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月待測物與產(chǎn)物在理化性質(zhì)上有便于檢測的信號，如吸收光譜不同則可直接測定待測物或產(chǎn)物本身信號的改變來進行定量分析的方法稱為直接法。單酶反應(yīng)直接法(1)19第19頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月單底物反應(yīng)直接測定法

尿酸+O2+H2O尿囊素+CO2+H2O2膽綠素+H2O膽紅素+O2

尿酸在293nm

處有吸收，而尿囊素沒有吸收，在293nm

處測定吸光度下降膽紅素在450nm處有吸收，而膽綠素沒有吸收，在450nm處測定吸光度下降尿酸紫外法測定膽紅素測定20第20頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月雙底物反應(yīng)直接測定法

對于雙底物反應(yīng)，為了便于實驗分析，在實驗設(shè)計時一般將所加的另一種底物濃度設(shè)計得相當大，即[S2]>>Km2，這時的酶促反應(yīng)動力學可按單底物法處理，整個反應(yīng)只與待測物有關(guān)，呈一級反應(yīng)動力學。但在以NADH或NADPH為底物的終點法測定中，因340nm吸光度的限制，輔酶的用量不可能過高。

21第21頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月在340nm處測定吸光度的增加來進行定量的方法乳酸測定雙底物反應(yīng)直接測定法

乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+丙酮酸測定

在340nm處測定吸光度的下降來進行定量的方法

乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+22第22頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月酶促反應(yīng)的底物或產(chǎn)物如果沒有可直接檢測的成分，將反應(yīng)某一產(chǎn)物偶聯(lián)到另一個酶促反應(yīng)中，從而達到檢測目的的方法稱酶促偶聯(lián)法。最常用的偶聯(lián)指示系統(tǒng)有兩個：一個是脫氫酶指示系統(tǒng)，另一個為過氧化物酶指示系統(tǒng)。

酶偶聯(lián)法(2)23第23頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月脫氫酶指示系統(tǒng)

氧化型輔酶NAD(P)+在340nm處沒有吸收峰,還原型輔酶NAD(P)H在340nm處有吸收峰.24第24頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月脫氫酶指示系統(tǒng)

以脫氫酶為指示酶的系統(tǒng)測定的是氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)

或氧化型輔酶Ⅱ(NADP+)變?yōu)檫€原型NAD(P)H后在340nm

處的吸光度增高來計算出被測物的濃度，也可利用脫氫酶的逆反應(yīng)，將還原型NAD(P)H變?yōu)檠趸蚇AD(P)+，測定340nm

處吸光度的下降來計算被測物的濃度。25第25頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月脫氫酶指示系統(tǒng)

血清葡萄糖己糖激酶法測定

Glu+ATPG-6-P+ADPG-6-P+NADP+P-6-GA+NADPH+H+指示酶反應(yīng)將NADP+轉(zhuǎn)化為NADPH+H+，測定340nm吸光度上升的速度與葡萄糖的含量成正比

26第26頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月脫氫酶指示系統(tǒng)

血清尿素測定

尿素+H2O2NH3+CO2NH3+α-酮戊二酸+NADH+H+谷氨酸+H2O+NAD+測定340nm吸光度下降的速度與尿素的含量成正比，可以用速率法測定；也可以用平衡法測定27第27頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月常用的試劑酶有乳酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等。體液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、膽汁酸、乳酸、丙酮酸、酮體、乙醇、唾液酸以及氨、鉀、鎂等離子的酶法測定大多使用該指示系統(tǒng)。脫氫酶指示系統(tǒng)

28第28頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月過氧化物酶指示系統(tǒng)

共用的指示反應(yīng)最早由Trinder氏等人提出，被稱為Trinder反應(yīng)

最大吸收峰為500nm，在可見光范圍內(nèi)比色。已廣泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、膽固醇、甘油三酯等項目的測定29第29頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月過氧化物酶指示系統(tǒng)

血清總膽固醇氧化酶測定法

膽固醇酯+H2O膽固醇+O2膽固醇+脂肪酸△4-膽甾烯酮+H2O2紅色醌類化合物H2O2+4-AAP+

酚指示酶反應(yīng)生成的紅色醌類化合物可在500nm處比色測定30第30頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月化學名英文縮寫最大吸收峰（nm）酚2，4-二氯酚N-乙基-N-（3-甲苯）-N-乙酰乙二胺N-乙基-N-（2-羥基-3-丙磺酰）間甲苯胺N-乙基-N-（3-丙磺酰）-3，5二甲氧基苯胺P2，4-DCPEMAETOOSESPDMA500510555555585過氧化物酶指示系統(tǒng)

常用的Trinder反應(yīng)生色基團

表內(nèi)這些酚類衍生物，有的是提高生色基團的穩(wěn)定性和溶解度、產(chǎn)物的靈敏度和穩(wěn)定性；有些生色基團的產(chǎn)物是蘭色醌類，能避免溶血等色素干擾。

31第31頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月利用底物和輔酶的反復反應(yīng)，使待測物的酶促反應(yīng)產(chǎn)物不斷擴增，擴增量決定于循環(huán)次數(shù)，反應(yīng)產(chǎn)物的增加，提高了檢測靈敏度，減少了共存物質(zhì)的干擾，達到高靈敏度和特異的要求。酶循環(huán)法(enzymaticcyclingassay)的靈敏度決定于循環(huán)反應(yīng)速度和時間，循環(huán)反應(yīng)速度又取決于兩種試劑酶(Ea和Eb)的量。該法測定中所選擇酶的Km

值要小，以便用較少的酶量保持所需的靈敏度。

酶循環(huán)法(3)32第32頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月使用兩種酶，即一種氧化酶用于靶物質(zhì)的氧化，一種脫氫酶使其回到還原狀態(tài)，促使靶物質(zhì)(或其衍生物)或靶物質(zhì)的氧化產(chǎn)物作為底物循環(huán)。檢測指示系統(tǒng)：①循環(huán)前、后用速率法測定NADH(340nm)的變化。②檢測產(chǎn)物H2O2可通過Trinder反應(yīng)比色測定。產(chǎn)物循環(huán)－氧化酶－脫氫酶系統(tǒng)

33第33頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月產(chǎn)物循環(huán)－氧化酶－脫氫酶系統(tǒng)

甘油濃度測定

通過GPO和G-3PDH使G-3P與DHAP之間循環(huán)，在反復循環(huán)中G-3P和DHAP的量不變，而產(chǎn)物H2O2

隨每次循環(huán)不斷遞增，同時NADH遞減。在規(guī)定時間t內(nèi)，H2O2

累計的量決定于t和每min循環(huán)次數(shù)。34第34頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月底物循環(huán)－脫氫酶－輔酶系統(tǒng)用一種脫氫酶和兩種輔酶(thio-NAD+

和NADH)。用395nm～415nm波長測定反應(yīng)中氧化型thio-NAD+

轉(zhuǎn)為還原型thio-NADH的增加速度。循環(huán)反應(yīng)條件：酶對thio-NAD+

和NADH應(yīng)有高度親和力。溶液pH和緩沖體系同時有利于雙向反應(yīng)。thio-NAD+

和NADH二者的濃度和配比達最適條件。

35第35頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月底物循環(huán)－脫氫酶－輔酶系統(tǒng)血淸膽汁酸測定

膽汁酸與3-酮類固醇之間構(gòu)成循環(huán)，不斷產(chǎn)生硫代還原型輔酶Ⅰ（黃色），控制好條件，反應(yīng)速度與代測物膽汁酸呈正比。靈敏度可增加數(shù)十倍。

36第36頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月氨循環(huán)－合成酶－脫氫酶系統(tǒng)

NH4+在NAD合成酶和Mg2+存在下催化脫氨-NAD轉(zhuǎn)化為NAD+，經(jīng)脫氫酶將亮氨酸轉(zhuǎn)化為氧化異己酸和NH4+同時生成NADH，生成的NH4+進入循環(huán)再次生成NADH，在340nm測定。

37第37頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月酶循環(huán)法具有的特點

靈敏度隨反應(yīng)時間的延長而提高靈敏度隨酶在擴增反應(yīng)中的用量而提高利用酶對底物的特異性,使測定系統(tǒng)簡化利用四唑鹽類的顯色反應(yīng)可實現(xiàn)比色測定

38第38頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月酶活性恢復法

很多酶必需某些無機離子、微量元素或輔酶存在才發(fā)揮其催化活性。脫去酶中關(guān)鍵的無機離子、微量元素或輔酶之后，酶即失去了其催化活性，無活性的酶與標本混合，標本中的無機離子、微量元素或輔酶使該酶重新復活，復活的比例可以反映這些無機離子、微量元素或輔酶的含量。

其他酶法(4)39第39頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月異檸檬酸脫氫酶法測定血清鎂離子

酶活性恢復法異檸檬酸+NADP+α-酮成二酸+CO2+NADPH+H+用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(GEDTA)抑制鈣離子，標本中Mg2+通過恢復ICD活性，催化異檸檬酸脫氫的正向反應(yīng)，使NADP+還原，與鎂標準一起在340nm測定吸光度的増加。

40第40頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月酶活性恢復法應(yīng)用舉例丙酮酸激酶法或色氨酸酶法測定鉀離子α-半乳糖苷酶法測定鈉離子淀粉酶法測定氯離子超氧化物歧化酶法測定銅離子碳酸酐酶或堿性磷酸酶法測定鋅離子等

41第41頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月激活和抑制法

有機磷是乙酰膽堿酯酶的抑制劑，用標準乙酰膽堿酯酶與標本在37℃水浴10min，測定剩余的乙酰膽堿酯酶的活性，被抑制的乙酰膽堿酯酶的活性可以計算出標本中有機磷的含量。有機磷的酶法測定根據(jù)酶有否激活劑和抑制劑存在時酶促反應(yīng)動力學發(fā)生改變來測定激活劑和抑制劑的含量。另有抑制ALP法測定茶堿、激活HK法測定鎂離子等。返回章目錄42第42頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月試劑酶質(zhì)量試劑酶概念試劑酶特征試劑酶純度酶法設(shè)計要求

酶法設(shè)計共性要求平衡法設(shè)計的要求速率法設(shè)計的要求代謝物酶法分析的設(shè)計要求

3試劑酶來源43第43頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月試劑酶是指作為診斷試劑來測定化合物濃度或酶活性的一類酶。它是酶試劑的核心，它的質(zhì)量是酶試劑質(zhì)量的決定性因素。試劑酶的質(zhì)量要求(1)試劑酶的概念44第44頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月主要來自動植物組織提取及微生物發(fā)酵工程?；蛑亟M酶蛋白也有應(yīng)用，活力高，雜酶含量少且價格低廉。不同來源的同一種試劑酶有不同的理化特征。必須掌握專一性和分子量、等電點、Km、最適pH，最適溫度等，并熟悉輔助因子、激活劑和抑制劑對酶活性的影響。

試劑酶的來源和理化特征試劑酶的質(zhì)量要求(1)45第45頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月不同的酶試劑系統(tǒng)對試劑酶的純度有不同的要求。以NAD(P)H為指示反應(yīng)中，要求試劑酶有較高的純度。而在Trinder反應(yīng)中要求相對低一些。

純度主要指標①酶的比活性，酶的比活性越高，酶的純度越高。②雜酶含量，容易引起副反應(yīng)的一些酶含量按“允許限度”的要求（見表5-2）。

試劑酶的質(zhì)量要求(1)試劑酶的純度要求46第46頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月表5-2常用試劑酶的理化特征及質(zhì)量要求名稱來源分子量等電點比活性(U/mg)雜酶占試劑酶活性的%（允許限度）葡萄糖氧化酶（GOD）A.nigerp.notatum1860001520004.30＞20蔗糖酶含量＜0.01%,過氧化氫酶＜10U/mg蛋白己糖激酶(HK)酵母1050004.50-4.80＞140磷酸葡萄糖異構(gòu)酶＜0.01%,G-6-P脫氫酶＜0.01%葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)酵母2120004.50＞140己糖激酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶＜0.02%過氧化物酶(POD)辣根402007.20＞50不含胺氧化酶及過氧化氫酶47第47頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月名稱來源分子量等電點比活性(U/mg)雜酶占試劑酶活性的%（允許限度）脲酶巨豆4830004.905-100天冬氨酸酶≤0.02%,精氨酸酶≤0.002%,NH4+≤0.0005μg/U,谷氨酸脫氫酶(GLDH)變形桿菌3000004.60≥90醇脫氫酶、乳酶脫氫酶、蘋果酸脫氫酶＜0.01%乳酸脫氫酶心1350004.5-4.8≥500丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶＜0.01%,丙酮酸激酶、醛縮酶＜0.001%脂蛋白脂肪酶（LPL）心，假單胞菌屬470005.95±0.05＞100ATP酶＜0.00008%,NADH氧化酶＜0.001%,膽固醇氧化酶＜0.002%,過氧化氫酶＜0.02%甘油激酶（GK)嗜熱脂肪芽胞桿菌209000

≥85NADH氧化酶＜0.01%,己糖激酶＜0.02%48第48頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月名稱來源分子量等電點比活性(U/mg)雜酶占試劑酶活性的%（允許限度）磷酸-3-甘油氧化酶足球菌760004.6±0.1＞40乳酸氧化酶≤0.001%膽固醇酯酶(CEH)假單胞菌302000

＞25ATP酶＜0.00008,NADH氧化酶＜0.001%,GOD＜0.00001%,尿酸酶＜0.00004%,過氧化氫酶＜1U/mg膽固醇氧化酶(CHOD)鏈霉菌340005.1-5.4＞25CEH＜0.005%,GOD＜0.00014%尿酸酶＜0.0004%膽紅素氧化酶(BOD)疣胞漆斑菌520004.10＞0.2NADH氧化酶＜0.0007%尿酸酶肝1000006.30≥15過氧化氫酶＜1.0%丙酮酸氧化酶

2600004.30≥1.5ATP酶≤0.05%，ALT、AST≤0.05%49第49頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月所用試劑酶的特異性：指示酶要有更高特異性；怎樣消除干擾因素：加消除劑、抑制劑和用雙試劑法；試劑中的附加劑：應(yīng)不抑制酶的活性，不影響試劑的穩(wěn)定性，不與底物和體液中的物質(zhì)作用；如何提高靈敏度：①用PMS或黃遞酶，將NADH上的氫交給四氮唑鹽，在可見光監(jiān)測；②用酶循環(huán)法；③測定熒光法。酶法分析的設(shè)計要求(2)酶法設(shè)計的共性要求50第50頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月酶的用量要足夠大，能使反應(yīng)1min～3min

達到平衡，以保證較快完成測定。反應(yīng)要朝正反應(yīng)方向進行，如果反應(yīng)的平衡常數(shù)太低，可用增加底物濃度、偶聯(lián)反應(yīng)移去生成物、改變反應(yīng)pH

等方法,并設(shè)標準管一起到達平衡以后測定。

Km

在保證測定線性的前提下要盡量小。平衡法設(shè)計的要求酶法分析的設(shè)計要求(2)51第51頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月所用酶的

Km

應(yīng)足夠大，以保證測定線性和較長的反應(yīng)動態(tài)期。Km太小，可加入競爭性抑制劑加大

Km。酶用量要合適，用少了可能導致線性期縮短，甚至一級反應(yīng)喪失。一般認為酶用量比平衡法小。速率法酶促反應(yīng)受很多因素影響，只有很好控制反應(yīng)速度（v）才與代測物的濃度成正比例。