第二章-培養(yǎng)基滅菌課件

第二章培養(yǎng)基滅菌雜菌污的危害：①、基質(zhì)或產(chǎn)物消耗，產(chǎn)率下降；②、產(chǎn)物提取困難，收率低，產(chǎn)品質(zhì)量下降；③、分解產(chǎn)物，生產(chǎn)失?。虎?、改變反應(yīng)介質(zhì)pH值，使生化反應(yīng)異常；⑤、噬菌體污染，菌體裂解，生產(chǎn)失敗等。保證純種培養(yǎng)的具體措施：

①、設(shè)備滅菌并確保無泄漏；②、培養(yǎng)基滅菌；③、通入氣體(如空氣)先除菌；④、確保純種；⑤、補料應(yīng)經(jīng)滅菌常用方法：化學(xué)滅菌、射線滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌、過濾除菌。第一節(jié)滅菌方法

機理：使微生物中Pr、酶及核酸發(fā)生反應(yīng)。

常用化學(xué)藥劑:甲醛、氯(或次氯酸鈉)、高錳酸鉀、環(huán)氧乙烷、季銨鹽(如新潔爾滅)、臭氧等。不適于培養(yǎng)基。但染菌后的培養(yǎng)基可以用化學(xué)藥劑處理。一、化學(xué)滅菌三、干熱滅菌

160oC、1h。不如濕熱滅菌有效。其Q10為2～3，濕熱滅菌對耐熱芽孢可達8～10，對營養(yǎng)細胞則更高。Q10：溫度升高10oC，滅菌常數(shù)增加的倍數(shù)。適于一些要求保持干燥的器具和材料。四、濕熱滅菌濕熱滅菌：利用飽和水蒸氣進行滅菌。蒸汽穿透力強、放出大量冷凝熱，很容易使Pr凝固而殺滅微生物。蒸汽價格低廉，來源方便，滅菌效果可靠。

適于：培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備及管道、實驗器材滅菌。

蒸汽滅菌條件：121℃/30min。五、過濾除菌利用過濾方法截留M，達到除菌目的。適于：澄清流體?？諝?、熱敏性培養(yǎng)基、某些產(chǎn)品采用過濾除菌。一、微生物的死亡速率與理論滅菌時間濕熱滅菌時，培養(yǎng)基中微生物受熱死亡速率與殘存微生物數(shù)量成正比：

第二節(jié)培養(yǎng)基的濕熱滅菌N：培養(yǎng)基中活M數(shù)；

τ：M受熱時間，s；

k：比死亡速率，s-1

若開始滅菌時(τ=0)，培養(yǎng)基中活微生物數(shù)為N0，式(5-1)積分則得：t=kNoN-ln或N=N0e-kτ5-25-3

此即：對數(shù)殘留定律。

N為經(jīng)τ時間滅菌后培養(yǎng)基中活菌數(shù)。

將存活率N/N0對時間τ在半對數(shù)坐標上繪圖，斜率的絕對值為比死亡速率k，又稱滅菌速度常數(shù)。下圖為大腸桿菌不同溫度下的殘留曲線，K值越大，微生物越易死亡。

一定溫度下，比死亡速率隨M種類不同而異。

一般來說，細菌營養(yǎng)體、酵母菌、放線菌、病毒及噬菌體對熱的抵抗力較弱，而細菌芽孢、霉菌孢子則較強。

隨著溫度的變化，比死亡速率是值有很大變化。溫度對k的影響遵循阿侖尼烏斯定律：Dk=Ae-RTE5-4A：系數(shù)，s-1；△E：活化能，J/mol；

R：氣體常數(shù)，8.314J/(mol·K)；

T：絕對溫度，K。阿侖尼烏斯定律

各種各樣的微生物，k值各不相同。計算時取耐熱的芽孢桿菌的k進行計算，這時A=1.34×1036s-1，△E=2.844×105J/mol，式(5-4)可寫作：+-=Tk14845lg36.1275-5

式(5-5)：k只隨滅菌溫度變化。

理論滅菌時間：NsNokln1=t5-6Ns：滅菌結(jié)束時培養(yǎng)基中活M數(shù)，取0.001個，即滅菌失敗概率為千分之一；

N0：為滅菌開始時培養(yǎng)基中活M數(shù)，取每毫升(1～2)×107個。式(5-6)是理論滅菌時間，實際設(shè)計和操作計算時可作適當比例的延長或縮短。

培養(yǎng)基中熱敏性物質(zhì)會因受熱而破壞。如，糖溶液焦化變色、Pr性、維生素失活、醛糖與氨基化合物反應(yīng)、不飽和醛聚合、一些化合物發(fā)生水解等等。

培養(yǎng)基成分的受熱破壞也可看做一級反應(yīng)：c：熱敏性物質(zhì)濃度；

kd：分解速率常數(shù)，s-1。=-dtdcKdc5-7熱滅菌對營養(yǎng)物質(zhì)的破壞：

溫度對分解速率常數(shù)kd的影響遵循阿侖尼烏斯定律。由于M的△E比維生素高，因此，隨滅菌溫度升高，比死亡速率增加較分解速率常數(shù)快，因而高溫度短時間滅菌可保留較多的營養(yǎng)物質(zhì)。

高溫度短時間滅菌的理論基礎(chǔ)：

某些M受熱死亡的速率不符合對數(shù)殘留定律。將其N/N0對滅菌時間τ在半對數(shù)坐標中標繪得到殘留曲線(圖5-2)，這主要是M的芽孢在起作用。循序死亡模型：

如果培養(yǎng)基內(nèi)含有大量熱敏感微生物和一些耐熱微生物，則滅菌時微生物的殘留曲線可能如下：二、培養(yǎng)基的分批滅菌

概念：將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他容器中，通入蒸汽將其和所用設(shè)備一起滅菌的操作過程，也稱實罐滅菌。實驗室中普遍采用的滅菌鍋滅菌也是分批滅菌。

優(yōu)缺點：

工業(yè)上，培養(yǎng)基分批滅菌無需專門設(shè)備，設(shè)備投資少，滅菌效果可靠，滅菌用蒸汽要求低(0.2～0.3MPa表壓)，但滅菌溫度低、時間長而對培養(yǎng)基成分破壞大，操作難于自動控制。分批滅菌是中小型發(fā)酵罐常采用的一種培養(yǎng)基滅菌方法。（1）、分批滅菌的操作

分批滅菌在發(fā)酵罐中進行。將培養(yǎng)基在配料罐中配制好，經(jīng)專用管道泵入發(fā)酵罐，開始滅菌。

通用發(fā)酵罐常見管路一般有：

空氣管和排氣管，取樣管，出料管，接種管，消沫劑管，補料管等。發(fā)酵罐夾套或蛇管，采用間壁傳熱而與發(fā)酵罐內(nèi)部不相通。滅菌操作：進料→開攪拌→慢開夾套蒸汽閥→料液升至80℃→關(guān)閉夾套蒸汽→開3路(空氣、出料、取樣)進汽閥、開排氣閥、包括小辮子(進料管、補料管、接種管排氣閥)→升溫至110℃左右→控制進出汽閥門至121℃(表壓0.1MPa)保溫30min→關(guān)閉過濾器排氣閥、排汽閥、進汽閥→關(guān)閉夾套出水閥，開冷卻水進回水閥→罐壓<過濾器壓力→開空氣進氣閥引入無菌空氣。隨后引入冷卻水，降至培養(yǎng)溫度。(2)、分批滅菌的計算分批滅菌的過程包括升溫、保溫和降溫三個階段。

升溫：可夾套蒸汽加熱，也可直接將蒸汽通入罐中，或二者兼用。但后者會因冷凝水的加入改變消后體積。

保溫：是滅菌的主要時段。習(xí)慣上，把保溫時間看為滅菌時間。

降溫：滅菌后用冷卻水冷卻至培養(yǎng)溫度。

隨著發(fā)酵罐容積的加大，升溫和降溫時間就延長，由此造成培養(yǎng)基成分的破壞。同時，發(fā)酵罐利用率也有所降低。分批滅菌所涉及的計算，主要是滅菌時間及熱量計算。

滅菌主要是在保溫過程中實現(xiàn)，在升溫段后期，也有一定的滅菌作用。a．滅菌時間計算

分批滅菌的時間應(yīng)參考理論時間作適當延長或縮短。如僅考慮保溫時段的滅菌作用，理論滅菌時間NsNokln1=t5-6k是為滅菌常數(shù)，s-1滅菌常數(shù)k:

取決于滅菌溫度和滅菌對象，通常以耐熱芽孢桿菌為滅菌對象，則為滅菌溫度的單一函數(shù)，其計算如式(5—5)。例5-1

發(fā)酵罐內(nèi)裝培養(yǎng)基40m3，121℃分批滅菌。每毫升培養(yǎng)基中含耐熱的芽孢為107個，求理論滅菌時間?

解：No=40×106×107=4×1014個

Ns=0.001個

lgk=-（14845/T）+36.127=－（14845/（273+121））+36.127=－1.55k=0.0281s－1τ=24min

從該例題可以看出一般采用的滅菌條件121℃、30min是有其理論依據(jù)，并被實踐所證實了的分批滅菌條件。

但例5—1沒有考慮升溫階段對滅菌的貢獻，實際上保溫開始時培養(yǎng)基中活微生物數(shù)不是No而是Np，epmNoNpkt=5-8τp為升溫階段時間，可從100℃開始算起，可從經(jīng)驗值或通過熱量恒算取得該數(shù)值。

Km為這一溫度段內(nèi)的滅菌常數(shù)之平均值。例5-2

根據(jù)例5—1中的條件，并且已知升溫階段培養(yǎng)基溫度從100℃升到121℃需要20min，考慮這一階段的滅菌作用，求保溫時間?解：

Tl=273+100=373K;T2=273+121=384K

采用圖解積分法可得：

分別代入公式5－9、5－8、5－6可得:km＝0.0061s－1

Np＝2.65×1011個

保溫時間τ=1182.1s＝19.7min

從例2可以看出，考慮升溫段的滅菌作用后，保溫時間比不考慮的減少了18％。因此，發(fā)酵罐體積越大，其分批滅菌的升溫時間長，就更應(yīng)考慮升溫段的滅菌作用，其保溫時間應(yīng)更短。

從圖5—5可看出，發(fā)酵罐體積越大，培養(yǎng)基在高溫下持續(xù)時間也越長，遭受破壞也越嚴重。

這正是大體積培養(yǎng)基滅菌常選用連續(xù)滅菌的原因。b.分批滅菌的熱量計算

分批滅菌的熱量計算主要包括三個方面：升溫階段的熱量計算保溫階段的熱量計算降溫階段的熱量計算①、升溫階段

A、采用蒸汽通入夾套或蛇管方式加熱B、直接蒸汽加熱升溫階段的滅菌度：附：升溫階段滅菌度的簡易算法：②、保溫階段在此階段，蒸汽仍不斷通人發(fā)酵罐，而由發(fā)酵罐的若干排氣排出。此時蒸汽消耗量可用下式估算。vPFst19.1=5-12F：蒸汽排出口的總面積，m2；P：罐內(nèi)蒸汽的絕對壓力，atm；V：蒸汽的比體積，m3／kg

因排氣口由閥門來控制，而閥門開啟時的通道面積難以估計。公式5-12中較難確定的是排氣口面積F。一般以經(jīng)驗來估計保溫時的蒸汽耗量，例如，可估計為直接加熱時的30％～50％。這樣，一個10m3罐(內(nèi)裝7t培養(yǎng)基)升溫時大約耗用蒸汽1.6t，則保溫時估計蒸汽耗量為0.5—0.8t，共約需蒸汽2.1～2.4t?？展逌缇鷷r消耗的蒸汽體積可估計為罐體積的4—6倍。③、降溫階段

在發(fā)酵罐體積越來越大的今天，分批滅菌的對培養(yǎng)基成分破壞大、升降溫時間長這一缺點就更為突出。而以“高溫、快速”為特征的連續(xù)滅菌能夠很好的避免了這一缺點。

連續(xù)滅菌：就是將配制好的培養(yǎng)基在通入發(fā)酵罐時進行加熱、保溫、降溫的滅菌過程，也稱之為連消。三、培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌的設(shè)備流程圖如圖5—6：圖5－6培養(yǎng)基連續(xù)滅菌設(shè)備流程

連續(xù)滅菌時，培養(yǎng)基在短時間內(nèi)被加熱到滅菌溫度(130—140℃)，短時間保溫(5—8min)后，被快速冷卻，再進入早已滅菌完畢的發(fā)酵罐。連續(xù)滅菌注意事項：發(fā)酵罐應(yīng)預(yù)先前先進行空罐滅菌。加熱器、維持罐及冷卻器也應(yīng)先行滅菌。培養(yǎng)基的不同成分(耐熱與不耐熱、糖與氮源)可在不同溫度下分開滅菌，以減少培養(yǎng)基受熱破壞的程度。連續(xù)滅菌的優(yōu)點：對培養(yǎng)基破壞小、可以實現(xiàn)自動控制、提高發(fā)酵罐的設(shè)備利用率、蒸汽用量平穩(wěn)。連續(xù)滅菌的缺點：對加熱蒸汽的壓力要求較高，一般不小于0.45MPa。需要附加設(shè)備，設(shè)備投資大

培養(yǎng)基滅菌具體采用那一種滅菌方式，應(yīng)視培養(yǎng)基的成分、體積，結(jié)合當?shù)卣羝l(fā)酵罐、場地等情況，分析兩種滅菌法的優(yōu)缺點而確定。一旦確定采用連續(xù)滅菌，也要考慮到萬一蒸汽壓力不夠時和滅菌不透時改用分批滅菌的設(shè)備余量。連續(xù)滅菌的操作單元：配料、預(yù)熱、加熱、保溫、降溫。

(1)、配料

配料罐用于培養(yǎng)基的配制。然后將培養(yǎng)基用泵打入預(yù)熱桶中。(2)、預(yù)熱

預(yù)熱桶的作用：定容、預(yù)熱。

預(yù)熱的目的：使培養(yǎng)基在后續(xù)的加熱過程中能快速地升溫到指定的滅菌溫度，同時可避免太多的冷凝水帶人培養(yǎng)基，還可減少震動和噪聲。一般可將培養(yǎng)基預(yù)熱到70～90℃。(3)、加熱

預(yù)熱好的培養(yǎng)基由連消泵打入加熱器。加熱器也稱連消塔，使培養(yǎng)基與蒸汽混合并迅速達到滅菌溫度。加熱采用的蒸汽壓力一般為0.45～0.8MPa，加熱器有塔式加熱器和噴射式加熱器兩種見圖5—7。

加熱的目的：使培養(yǎng)基在較短的時間(20—30s)里快速升溫。圖5－7；連續(xù)滅菌的加熱設(shè)備

設(shè)培養(yǎng)基流量為G，m3／s；進入加熱器的溫度為tp。；滅菌溫度為t；由熱量平衡得加熱蒸汽用量為ρ：為培養(yǎng)基的密度，kg／m3；C：培養(yǎng)基的比熱容，J／kg；CW：水的比熱容，J／kg入：加熱蒸汽的熱焓，J／kg。a．塔式加熱器塔式加熱器由一根多孔蒸汽管和一根套管組成。多孔管孔徑5～8mm，小孔總截面積應(yīng)等于或小于管截面積。小孔以管壁成45o夾角開設(shè)，上稀下密，以使蒸汽能均勻地從小孔噴出。培養(yǎng)基由下端進入，在內(nèi)外管環(huán)隙內(nèi)流動，流速0.1m／s左右。與蒸汽激烈混合而加熱。塔的有效高度為2～3m，料液在加熱塔里停留20～30s。

塔式加熱器的導(dǎo)入管和外套管的管徑、塔高和導(dǎo)入管壁上的小孔數(shù)目可按下列公式計算：ws.svd7850＝內(nèi)wt＝H）（孔內(nèi)＝ddn2adD.svG27850外內(nèi)++=w5-175-155-165-18d內(nèi)：蒸汽導(dǎo)人管內(nèi)徑，m；S：加熱蒸汽用量，kg／s；υ：加熱蒸汽的比體積，m3／kg；ωs

：加熱蒸汽在導(dǎo)管內(nèi)的流速，常取20~25m／s；D內(nèi)：加熱塔內(nèi)徑，m；G：培養(yǎng)基體積流量，m3／s；ω：培養(yǎng)基在環(huán)隙中的流速，m／s；H：加熱塔高度，m；d孔：小管內(nèi)徑，m。τ：物料在加熱塔內(nèi)的停留時間，s；n：導(dǎo)人管上小孔數(shù)，個；d：小孔總截面積和導(dǎo)人管截面積之比值一般取0.8－1.0；式中：b．噴射式加熱器國內(nèi)大多數(shù)工廠采用。

優(yōu)點：加熱速度快、震動小、噪音低。物料從中間管進，蒸汽從進料管周圍的環(huán)隙進，在噴嘴出口快速均勻混合。噴射出口處設(shè)有拱形擋板的擴大管，使混合更充分。受熱后的培養(yǎng)基則從擴大管頂部排出。

培養(yǎng)基進料管徑：m

.Gdw17850＝內(nèi)5-19G：培養(yǎng)基進入加熱器的流量，m3／s；ω1：培養(yǎng)基進入加熱器時的流速，一般蒸汽噴射口的環(huán)形面積其結(jié)構(gòu)尺寸可按以下幾個公式計算。蒸汽噴射口的環(huán)形面積：5-20vp.SA630=m2S：加熱蒸汽流量，kg／s；P：加熱蒸汽絕對壓強，Pa；υ加熱蒸汽的比體積，m3／kg。蒸汽噴射口內(nèi)徑：dd.A217850外噴+=m5-21d1外為培養(yǎng)基進料管外徑，m。蒸汽套管內(nèi)徑：dd.vS21227850外內(nèi)+=wm5-22ω2：加熱蒸汽流速，一般取20～25m／s。塔內(nèi)徑：5-23w7850.sGDv+＝mτ：蒸汽冷凝水的體積流量，m3／s；ω：培養(yǎng)基在塔內(nèi)的流速，一般取0.1m/s。τ：物料在塔內(nèi)的停留時間，一般為10～15s。塔高：H=ωτm5-24w337850.Gvds+＝內(nèi)m5-25ω3：加熱后培養(yǎng)基在出口管內(nèi)的流速，一般為0.5～0．8m／s。培養(yǎng)基出口管徑：(4)、保溫保溫是將培養(yǎng)基維持滅菌溫度一段時間，是殺滅微生物的主要過程。其設(shè)備有維持罐和管式維持器兩種。保溫設(shè)備一般用保溫材料包裹，但不直接通入蒸汽。a．維持罐維持罐如圖5—8所示，圖5－8維持罐結(jié)構(gòu)維持罐缺點：

維持罐直徑比進料管直徑大得多，培養(yǎng)基不能先進先出，返混較重，維持時間被迫延長，加劇了營養(yǎng)成分破壞。

連續(xù)滅菌的理論滅菌時間計算可沿用對數(shù)殘留定律，如忽略升溫的滅菌作用，得停留時間5-26ccSlnk01=tC0：單位體積培養(yǎng)基在滅菌前活微生物個數(shù)，菌數(shù)／毫升Cs：單位體積培養(yǎng)基在滅菌后活微生物個數(shù)，菌數(shù)／毫升例5-3:

若將例5—1中的培養(yǎng)基采用連續(xù)滅菌，滅菌溫度為131oC，此溫度下的滅菌速度常數(shù)為0.25s—1，求滅菌保溫時間。

由該例可見，滅菌溫度升高10oC后采用連續(xù)滅菌則保溫時間大為縮短。當然，在維持罐內(nèi)的物料會有返混，為保險起見，實際維持時間常取理論滅菌時間的3—5倍。維持罐體積：m3

GVt實=5-27