工業(yè)微生物誘變育種

工業(yè)微生物誘變育種第1頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月工業(yè)微生物育種過程分為三個階段:1、菌種基因型改變；2、篩選菌種，確認(rèn)并分離出具有目的基因型或表型的變異株；3、產(chǎn)量評估，全面考察此變異株在工業(yè)化生產(chǎn)上的接受性。第2頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月目的：1、提高有效產(chǎn)物的產(chǎn)量2、改善菌種特性、提高產(chǎn)品質(zhì)量3、簡化工藝條件4、開發(fā)新品種第3頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

第一節(jié)誘變育種的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和準(zhǔn)備工作

變異對微生物本身來說使其代謝向著異常方向發(fā)展，必然引起菌體基本代謝失調(diào)，此時菌體雖然具有生活能力，但細(xì)胞的某些功能卻顯著地降低了。高產(chǎn)突變型是一種數(shù)量性狀的遺傳變異，是由多基因決定的。結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、滲透基因、輔助基因等，這些基因不可能通過一次誘變?nèi)恳鹜蛔儭５?頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

誘變育種工作包括誘發(fā)突變、突變株的篩選和高產(chǎn)突變株最佳環(huán)境條件的調(diào)整。

誘發(fā)突變包括出發(fā)菌株、誘變劑及其劑量的選擇、影響誘變效果的因素。

突變株的篩選包括篩選培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件及選擇一個簡便、快速、有效的篩選方法。

環(huán)境條件調(diào)整是突變株的最佳培養(yǎng)條件改變。

第5頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

具體要選育怎樣的菌種，在誘變育種前，應(yīng)該對大生產(chǎn)的設(shè)備和工藝具有相當(dāng)?shù)闹R和全面的了解。

誘變育種工作量大，周期長，對一般周期為7-10d的抗生素菌種來說，一代誘變需2-3個月。第6頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月一、誘變前對出發(fā)菌株的了解1、區(qū)分不同菌落類型一般情況下在同一種培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下往往會出現(xiàn)多種形態(tài)類型的菌落（約有2～5種），不同類型的菌落其代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力有較大的差異。2、出現(xiàn)不同菌落的原因遺傳因素決定；常因?yàn)榕囵B(yǎng)基組成或培養(yǎng)條件等的改變，引起菌落形態(tài)的變化。第7頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

二、全面了解菌種特性及其與生產(chǎn)性能的關(guān)系1、考查菌種的生活史，了解它們的形態(tài)、生理，生化等生物學(xué)特性，以及這些特性與代謝產(chǎn)物合成的關(guān)系。2、菌種的某些生物學(xué)特性與產(chǎn)量合成的相關(guān)性。第8頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

三、了解影響菌種生長發(fā)育的主要因素1、培養(yǎng)基2、培養(yǎng)基斜面制備技術(shù)3、移種的密度4、溫度5、濕度6、藥品和原材料質(zhì)量第9頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月四、了解菌種有效產(chǎn)物中的各種組分在代謝合成過程中與培養(yǎng)條件的關(guān)系。五、建立一個準(zhǔn)確、簡便、快速檢測產(chǎn)物的方法六、研究最佳的菌種保藏培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件第10頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)誘變育種的步驟與方法誘變育種的步驟和方法包括：出發(fā)菌株的選擇；單孢子（或單細(xì)胞）菌懸液的制備；誘變劑及誘變劑量的選擇；誘變的處理方法；以及菌種的純化分離等。第11頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月一、出發(fā)菌株1、對一般出發(fā)菌株的要求2、選擇具有一定生產(chǎn)能力或某種特牲的菌株作為出發(fā)菌株3、選擇純種作出發(fā)菌株誘變中要選用單倍體、單核或少核的細(xì)胞為出發(fā)菌株。第12頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月4、選擇出發(fā)菌株應(yīng)考慮其穩(wěn)定性5、連續(xù)誘變育種如何選擇出發(fā)菌株

“增變菌株”

-缺乏DNA修復(fù)機(jī)制6、選擇出發(fā)菌株的其他因素7、采用多出發(fā)菌株8、菌種代謝特點(diǎn)第13頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

二、出發(fā)菌株的純化純種分離方法:常用劃線分離法和稀釋分離法。顯微鏡操縱器分離單孢子

第14頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月三、單孢子（或單細(xì)胞）懸液的制備1、供試菌株的孢子或菌株要年輕、健壯。對數(shù)期霉菌孢子濃度約為106/ml，放線菌孢子約為106～107/ml。菌懸液的孢子或細(xì)菌數(shù)可用平皿計(jì)數(shù)，血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)或光密度法測定。制備菌懸液通常采用生理鹽水。如果用化學(xué)誘變劑處理時，應(yīng)采用相應(yīng)的緩沖液配制。第15頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月2、菌懸液的制備方法

細(xì)菌：最好在誘變處理前進(jìn)行振蕩預(yù)培養(yǎng)，這不僅使菌體分散，得到單個細(xì)胞，還可利用溫度和碳源控制其同步生長，取得年輕的、生理活性一致的細(xì)胞；

第16頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月孢子：在試驗(yàn)中應(yīng)盡量采用成熟而新鮮的孢子，并且置于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)到孢子剛剛萌發(fā)，即芽長相當(dāng)孢子直徑的0.5～1倍、離心洗滌，加入生理鹽水或緩沖液制成孢子懸液，用血球計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整菌體濃度。第17頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月不產(chǎn)孢子的菌絲體進(jìn)行誘變處理,有三種方法:第一、菌絲尖端法；第二、處理單菌落周圍尖端菌絲；第三、混合處理法。第18頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

3、制備原主質(zhì)體作為誘變材料（1）在絲狀真菌中（2）細(xì)胞具有細(xì)胞壁（3）不產(chǎn)生孢子絲狀菌第19頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月四、誘變劑及誘變劑量（一）誘變劑種類的選擇實(shí)踐證明并非所有的誘變劑對某個出發(fā)菌株都是有效的。一種誘變劑對A菌株有較高的誘變效應(yīng)；對B菌株則可能相反。不同微生物對同一種誘變劑敏感性有很大區(qū)別。第20頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月1、選擇誘變劑選擇誘變劑時要注意選擇專一性比較強(qiáng)的誘變劑。2．根據(jù)菌種特性和遺傳穩(wěn)定性選擇誘變劑3．參考出發(fā)菌株原有的誘變系選擇誘變劑第21頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）最適誘變劑量的選擇

由于各種微生物間遺傳特性的差異，不同微生物或同一種微生物的各個菌種對同一種誘變劑的最適劑量是有區(qū)別的。在實(shí)際育種工作中，具體到某個菌種對某種誘變劑最適劑量的確定，作突變劑量曲線是比較可靠的。在判斷誘變劑量時，采用抗藥性突變是比較可靠的。劑量的大小常以致死率和變異率來確定。

第22頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月五、誘變劑的處理方式可分為單因子處理和復(fù)合因子處理。第23頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

單因子處理，是采用單一誘變劑處理，一般認(rèn)為單因子不如復(fù)合因子處理效果好，這己經(jīng)被很多事實(shí)所證實(shí)。但當(dāng)一種誘變劑對某個菌株確實(shí)是有效的誘變因子，那么單因子處理同樣能夠引起基因突變，效果也不錯．單一誘變劑處理，還可以減少菌種遺傳背景復(fù)雜化、菌落類型分化過多的弊病，使篩選工作趨向簡單化。當(dāng)然單因子處理，一般情況突變率比復(fù)合因子要低，而且突變類型也比較少。第24頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月復(fù)合因子處理是指兩種以上誘變因子共同誘發(fā)菌體突變。又可以分為以下處理方式：1、兩種以上因子同時處理2、不同誘變劑交替處理通常以化學(xué)因子和物理因子交替進(jìn)行效果較好。第25頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月3、同一種誘變劑連續(xù)重復(fù)使用經(jīng)過一種誘變劑處理后的菌懸液，培養(yǎng)數(shù)小時之后（細(xì)菌或酵母），使細(xì)胞分裂1-2代，接著再處理，有時還可反復(fù)多次，最后進(jìn)行分離篩選。誘發(fā)能力強(qiáng)的、對基因作用較為廣譜的誘變劑可連續(xù)重復(fù)使用，有益于變異乎的提高。但是單因子連續(xù)使用代數(shù)不能過多，否則也會出現(xiàn)“鈍化”現(xiàn)象。第26頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月4、紫外線光復(fù)活交替處理經(jīng)紫外線照射后的菌體或菌懸液，暴露在日光中一定時間，接著用劑量更大的紫外線繼續(xù)照射，然后再讓其光照復(fù)活，經(jīng)多次紫外線照射和光照復(fù)活交替，可以增加變異率，提高變異幅度。第27頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月5、誘變劑處理時間與誘變效應(yīng)的關(guān)系

在頭孢菌素C產(chǎn)生菌選育中用甲基磺酸乙酯低濃度、長時間處理與高濃度、短時間處理的誘變效應(yīng)是不同的，在致死率大致相同的情況下，前者比后者不僅正突變率高，而且提高的幅度也大。第28頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月處理具體方法1、直接處理方式，將菌懸液用物理、化學(xué)因子處理，然后分離，直接處理是最常用的方式。2、生長過程處理，適用于誘變作用強(qiáng)的而殺菌率較低的誘變劑，或在分裂過程中只對DNA起作用的誘變劑，如NTG、秋本仙堿等。第29頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月六、影響突變體的因素（一）菌種遺傳特性不同（二）菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)絲狀菌孢子壁的厚度及表面的蠟質(zhì)會阻礙誘變劑滲人細(xì)胞，減弱與DNA的作用。一般加大誘變劑量，效果會好一些。有的微生物細(xì)胞壁含有蠟質(zhì)，常用一定濃度的洗衣粉、脂肪酶處理，除去蠟質(zhì)，提高誘變效果。（三）環(huán)境條件的影響第30頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月1、誘變前預(yù)培養(yǎng)和誘變后培養(yǎng)出發(fā)菌株不管在誘變前或誘變后進(jìn)行培養(yǎng)時，營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中出現(xiàn)突變株的數(shù)量總是比營養(yǎng)貧乏的培養(yǎng)基中多。

后培養(yǎng)是指誘變后的菌懸液不直接分離于平板，而是立即轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)代。

誘變處理后保存于冰箱中的菌體懸液成分會影響突變體的成活率，應(yīng)加一些使正突變個體和總菌數(shù)的死亡率減低的物質(zhì)，如酪素水解蛋白、色氨酸等。第31頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月2、溫度、pH值、氧氣等外界條件對誘變效應(yīng)的影響3、平皿密度效應(yīng)第32頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

第三節(jié)突變株的分離與篩選

對抗性突變株或營養(yǎng)缺陷突變株，常常用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。

對產(chǎn)量突變來說，由于高產(chǎn)菌株和負(fù)變菌菌株都能在同一個培養(yǎng)基上生長，難以采用選擇性培養(yǎng)法進(jìn)行篩選。

第33頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

篩選突變株，首先根據(jù)篩選目的進(jìn)行。由于微生物正突變概率極小，僅0.05％～0.2%，產(chǎn)量提高10％以上突變株也只有1/300，所以挑選的菌落愈多，概率就愈高。第34頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月投產(chǎn)率多數(shù)不宜投產(chǎn)少數(shù)適宜投產(chǎn)大多死亡少數(shù)存活存活率多數(shù)未變少數(shù)突變突變率多數(shù)負(fù)變少數(shù)正變正變率多數(shù)幅度小少數(shù)幅度大高產(chǎn)率出發(fā)菌株誘變一、誘變育種的基本環(huán)節(jié)第35頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月二、篩選的程序1、常規(guī)篩選程序這是傳統(tǒng)選育中常用的方注，挑選的菌落直接接入搖瓶培養(yǎng)，產(chǎn)物用常規(guī)法測定。

2、簡便法篩選程序在常規(guī)篩選法甚礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)：一方面分離在平皿上的菌落采用瓊脂塊法，每代誘變處理后打1000—3000塊瓊脂菌落，甚至更多、另一方面，初篩搖瓶發(fā)酵液中產(chǎn)物分析，采用簡便、快速的瓊脂平板測定祛或其他簡便方法。

第36頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月設(shè)計(jì)或采用高效篩選方案或方法一個出發(fā)菌株誘變劑處理選出200個單孢子菌菌株初篩（每株1瓶）選出50株復(fù)篩（每株4瓶）選出5株第一輪第二輪五個出發(fā)菌株初篩（每株1瓶）選出50株復(fù)篩（每株4瓶）選出5株40株40株40株40株40株誘變劑處理第37頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月三、分離和篩選

多級水平篩選中經(jīng)過平板篩選。留取5-10%，約挑選200株；第二階段是搖瓶初篩，選取25％-30％，第三階段搖瓶復(fù)篩，選出1-3株高產(chǎn)變株。有條件再進(jìn)行小型發(fā)酵罐試驗(yàn)。第38頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）隨機(jī)篩選也稱搖瓶篩選。主要是隨機(jī)挑選的平皿菌落進(jìn)行搖瓶篩選。初篩挑選菌落起碼要200個。（二）平板菌落預(yù)篩1、根據(jù)形態(tài)篩選變株2、根據(jù)平皿生化反應(yīng)篩選突變株透明圈、顯色圈、抑制圈及混濁圈等生化反應(yīng)來篩選。3、采用冷敏感菌篩選抗生素突變株4、濃度梯度法5、應(yīng)用復(fù)印技術(shù)快速篩選突變體6、瓊脂塊法篩選變株第39頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

四、搖瓶液體培養(yǎng)

常規(guī)隨機(jī)篩選的全過程，都要通過搖瓶培養(yǎng)，而平板菌落篩選是經(jīng)過平板菌落預(yù)篩后，棄去大量低產(chǎn)菌株，被挑選的菌落移入試管斜面，然后再迸行搖瓶液體培養(yǎng)；才艷逐步地篩選出高產(chǎn)菌株。第40頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月五、產(chǎn)物活性測定1、瓊脂平板活性圈法2、濾紙片法3、瓊脂薄層紙片法篩選菌種為一種重復(fù)性和計(jì)量性的工作，所以必須應(yīng)用統(tǒng)什方法。區(qū)別并肯定其產(chǎn)量上的差異。以便迸行下輪育種的評估。第41頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

六、搖瓶數(shù)據(jù)的調(diào)整和有觀菌株特性的觀察分析

對搖瓶發(fā)酵液的測試數(shù)據(jù)要盡量應(yīng)用生物學(xué)統(tǒng)計(jì)方法來處理，以便從復(fù)雜的差異中，去偽存直，由比及彼，抓住本質(zhì)，找出其中真正的規(guī)律性。第42頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月七、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的調(diào)整

培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的調(diào)整，常采用正交法和二次旋轉(zhuǎn)均勻設(shè)計(jì)。第43頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月八、變種的特性研究與鑒定

要研究菌種的純度、遺傳穩(wěn)定性、菌落類型、群體的形態(tài)、生活能力、產(chǎn)孢子多少，保藏培養(yǎng)基及保藏方法、菌種碳、氮源利用情況、菌絲生長速度、菌絲量、發(fā)酵液粘度、過濾難易狀況；注意考察菌種抗生素的組分變化，色素等質(zhì)量問題；研究最適移種期、移種量、通氣攪拌、溫度、pH等。優(yōu)良菌株選育后，還應(yīng)該從分子水平進(jìn)一步對變株的生理生化特性加以鑒定以全面了解菌株各種屬性．這是考核菌株突變的重要指標(biāo)，也是為菌株迸一步的研究和應(yīng)用提供有指導(dǎo)意義的參考數(shù)據(jù)。第44頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月九、誘變育種實(shí)例（一）堿性脂肪酶高產(chǎn)變株FS1884的選育1．原生質(zhì)體作為誘變材料2．采用定向控制的理性篩選—抗阻遏和解除反饋抑制篩選模型3．初篩來用大通量的瓊脂塊法4．結(jié)合飾變育種第45頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月1．原生質(zhì)體作為誘變材料制備原生質(zhì)體，用0.6％纖維素酶+0.6%蝸牛酶處理3h，0.6％NaCI＋0.3%CaCl2作穩(wěn)定劑，可獲得原生質(zhì)體。采用麩皮＋瓊脂粉作為再生培養(yǎng)基。將菌體制備成原生質(zhì)體后，用UV、和He-Ne，激光進(jìn)行誘變。經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)，原生質(zhì)體對誘變劑的敏感性要比孢子大得多。第46頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月

2．采用定向控制的理性篩選—抗阻遏和解除反饋抑制篩選模型脂肪酶和其他水解酶類同樣受終點(diǎn)產(chǎn)物或分解代謝產(chǎn)物阻遏的調(diào)節(jié)，琥珀酸鈉是脂肪酶的產(chǎn)物類似物，是該酶合成的阻遏物結(jié)構(gòu)類似物，因此．可以用琥珀酸鈉來篩選抗阻遏突變株。篩選高滲透性菌株以解除胞內(nèi)產(chǎn)物反饋抑制作用，達(dá)到提高酶產(chǎn)量的目的。制霉菌素能抑制真菌細(xì)胞膜麥角固醇的合成，引起胞膜透性的改變，可以用它師選高滲透型突變株。將琥珀酸鈉和制霉菌素分別以一定濃度加人到分離平板、有抗性的菌落陸續(xù)長出，這樣大幅度的濃縮了所需要篩選的菌株，加速育種的進(jìn)度,從75U/ml逐步提高到7800U/m。第47頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月3．初篩來用大通量的瓊脂塊法

把瓊脂塊的菌落培養(yǎng)到產(chǎn)酶高峰期，然后移至油脂乳化液作為底物的鑒定平板上；在一定溫度下培育后，根據(jù)透明圈出觀快慢、大小及清晰度來決定取舍。每代誘變后可挑取菌落l000一3000株，在初篩階段可淘汰約95%低產(chǎn)菌株，這樣大大提高了篩逸的工作效率。第48頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)溫敏突變株的篩選溫敏突變株（temperature-sensitivemutant,TS突變株）：在許可的溫度下能正常生長，其表型和野生型沒有區(qū)別，在非許可的溫度條件下不能生長或微弱生長，表型和野生型不同。第49頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月一溫敏突變株的特性1、主要是必須基因的突變2、錯義突變或移碼突變二溫敏突變株的篩選方法1、誘發(fā)抗生素法2、富集過濾或離心法H3-前體法3、分離篩選常規(guī)法和特殊分離篩選第50頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月第51頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月三溫敏突變株在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用1、TS突變株在谷氨酸的發(fā)酵中的應(yīng)用2、TS突變株在絲氨酸發(fā)酵中的應(yīng)用3、微生物單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)第52頁，課件共59頁，創(chuàng)作于2023年2月第六節(jié)抗噬菌體菌株的選育一、烈性噬菌體及其效價的測定一般情況下每種噬菌體所形成噬菌斑的形態(tài)是相對穩(wěn)定的，但有時也隨著寄主生理狀態(tài)、菌齡及培養(yǎng)條件不同而變化。噬菌斑的這些形態(tài)特征可以作為鑒定指標(biāo)，也可利用其進(jìn)行純種分離和計(jì)數(shù)。每毫升試樣中所含有的侵染性的噬菌體粒子數(shù)稱為效價，以下是幾種噬菌體的