色譜分析法導論

色譜分析法導論2023/7/191第1頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月主要內(nèi)容：色譜過程和分離原理基本概念和計算公式：保留值、分配系數(shù)、容量因子、n、H、R色譜基本理論：塔板理論、速率理論2023/7/192第2頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月1、色譜法的產(chǎn)生

色譜法是一種分離技術(shù)，它是俄國植物學家茨維特1906年創(chuàng)立的。分離植物葉子中的色素時，將葉片的石油醚（飽和烴混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末（CaCO3有吸附能力)，用純石油醚洗脫（淋洗）。一、色譜分析法簡介第一節(jié)

概述

2023/7/193第3頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）CaCO3吸附，使色素在柱中停滯下來。（2）被石油醚溶解，使色素向下移動各種色素結(jié)構(gòu)不同，受兩種作用力大小不同，經(jīng)過一段時間洗脫后，色素在柱子上分開，形成了各種顏色的譜帶，這種分離方法稱為色譜法。2023/7/194第4頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月Tsweet的實驗2023/7/195第5頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/196第6頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月色譜法中共使用兩相固定相—固定不動的相CaCO3

流動相—推動混合物流動的液體石油醚色譜法：混合物在流動相的攜帶下通過色譜柱分離出幾種組分的方法。

2023/7/197第7頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月固定相：（1）固體吸附劑：CaCO3、Al2O3等（2）液體固定相（載體+固定液——高沸點有機化合物，涂在載體上）色譜分離法一定是先分離。后分析一定具有兩相；固定相和流動相分離：利用組分在兩相中分配系數(shù)或吸附能力的差異進行分離2023/7/198第8頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月色譜法的特點“三高”、“一快”、“一廣”高選擇性——可將性質(zhì)相似的組分分開高效能——反復多次利用組分性質(zhì)的差異產(chǎn)生很好分離效果高靈敏度——10-11~10-13g，適于痕量分析分析速度快——幾~幾十分鐘完成分離一次可以測多種樣品應用范圍廣——氣體，液體、固體物質(zhì)化學衍生化再色譜分離、分析2023/7/199第9頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月氣相色譜高效液相色譜薄層色譜紙色譜柱色譜經(jīng)典液相色譜法色譜－光譜聯(lián)用多維色譜智能色譜超臨界流體色譜毛細管電泳法2.色譜法的發(fā)展2023/7/1910第10頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月二、色譜分析法分類1、按兩相狀態(tài)分類氣相色譜—氣體作流動相

（1）氣固色譜：氣體作流動相，固體吸附劑作固定相。（2）氣液色譜：氣體作流動相，固定液作固定相。2023/7/1911第11頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月液相色譜—液體作流動相（1）液固色譜：液體作流動相，固體吸附劑作固體相。（2）液液色譜：液體作流動相，固定液作固定相。超臨界液體色譜——超臨界流體作色譜流動相。

2023/7/1912第12頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月2、按操作形式分類（1）柱色譜：填充柱色譜—固定相填充到柱管內(nèi)毛細管柱色譜—把固定相涂在毛細管內(nèi)壁上，中間是空的。（2）紙色譜：濾紙為固定相的色譜法，流動相是含一定比例水的有機溶劑，樣品在濾紙上展開進行分離。（3）薄層色譜：把固體固定相壓成或涂成薄膜的色譜法。2023/7/1913第13頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月3、按分離原理分類

固定相分離機制吸附色譜吸附劑吸附能力分配色譜液體分配系數(shù)或溶解度離子交換色譜離子交換劑交換能力或親和力分子排阻色譜凝膠或分子篩阻滯或滲透作用2023/7/1914第14頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月色譜與光譜的區(qū)別：色譜具有分離與分析兩種功能光譜沒有分離功能2023/7/1915第15頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)色譜過程和基本原理

一、色譜過程

實現(xiàn)色譜操作的基本條件是必須具備相對運動的兩相，固定相(stationaryphase)和流動相(mobilephase)。

色譜過程是組分的分子在流動相和固定相間多次“分配”的過程。2023/7/1916第16頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月二、色譜圖中的基本術(shù)語

1.色譜圖（chromatogram）

混合物樣品（A+B）→色譜柱中分離→檢測器→記錄下來。組分從色譜柱流出時，各個組分在檢測器上所產(chǎn)生的信號隨時間變化，所形成的曲線叫色譜圖。記錄了各個組分流出色譜柱的情況，又叫色譜流出曲線。（一）色譜流出曲線與色譜峰2023/7/1917第17頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月2.基線（baseline）在實驗操作條件下，色譜柱后沒有組分流出的曲線叫基線。穩(wěn)定情況下，一條直線?；€上下波動稱為噪音。2023/7/1918第18頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月3.色譜峰（peak）是流出曲線上的突起部分。正常色譜峰、拖尾峰和前延峰對稱因子fs

(symmetryfactor)：0.95~1.05對稱峰<0.95前延峰>1.05拖尾峰2023/7/1919第19頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）色譜保留值——定性的依據(jù)

組分在色譜柱中停留的數(shù)值，可用時間t和所消耗流動相的體積來表示。組分在固定相中溶解性能越好，或固定相的吸附性越強，在柱中滯留的時間越長，消耗的流動相體積越大，固定相、流動相固定，條件一定時，組分的保留值是個定值。2023/7/1920第20頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月1.死時間(deadtime)

t0——不被固定相吸附或溶解的組分流經(jīng)色譜柱所需的時間。2023/7/1921第21頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月2.保留時間tR(retentiontime)組分流經(jīng)色譜柱時所需時間。進樣開始到柱后出現(xiàn)最大值時所需的時間。操作條件不變時，一種組分有一個tR定值，定性參數(shù)。2023/7/1922第22頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月3.調(diào)整保留時間t’R(adjustedretentiontime)—扣除了死時間的保留時間。t’R=tR-t0又稱校正保留時間，實際保留時間。

t’R體現(xiàn)的是組分在柱中被吸附或溶解的時間。

t’R2023/7/1923第23頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月4.保留體積VR(retentionvolumn)-從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時，所需通過色譜柱的流動相體積。

5.死體積V0（deadvolumn）—不被固定相滯留的組分流經(jīng)色譜柱所消耗的流動相體積稱死體積，色譜柱中載氣所占的體積。

2023/7/1924第24頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月6.調(diào)整保留體積

(adjustedretention volume)：由保留體積扣除死體積后的體積7.相對保留值r(relativeretention)：兩組分的調(diào)整保留值之比注意：VR’是定值，tR’與FC成反比2023/7/1925第25頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月1.色譜峰的高度h(peakheight)-色譜峰最高點與基線之間的距離，可用mm,mV，mA表示。峰高低與組分濃度有關，峰越高越窄越好。

(三)定量參數(shù)2023/7/1926第26頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月

2.色譜峰面積A（peakarea）

——色譜峰與基線所圍的面積。對于對稱的色譜峰A=1.065hW1/2對于非對稱的色譜峰

A=1.065h(W0.15+W0.85)/2

2023/7/1927第27頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月峰寬W（peakwidth）—色譜峰兩側(cè)拐點所作切線在基線上的距離W

=4σ

半峰寬W1/2(peakwidthathalfheight)

—峰高一半處色譜峰的寬度W1/2

=2.354σW

=1.699W1/2標準偏差σ(standarddeviation)—峰高0.607倍處的色譜峰寬的一半。(四)區(qū)域?qū)挾?023/7/1928第28頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/1929第29頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月(五)分離度(resolution；R)：又稱分辨率。是相鄰兩色 譜峰保留時間之差與兩色譜峰峰寬均值之比。2023/7/1930第30頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月★定量分析時，要求R≥1.5分離度R分離程度分離情況0.889％未分離198％基本分離1.599.7％完全分離2023/7/1931第31頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/1932第32頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月三、分配平衡在一定溫度下，組分在流動相和固定相之間所達到的平衡叫分配平衡，組分在兩相中的分配行為常采用分配系數(shù)K和容量因子k來表示。

=cs/cm組分在固定相中的濃度組分在流動相中的濃度K=1、分配系數(shù)K(distributioncoefficient)2023/7/1933第33頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月影響分配系數(shù)的因素：★組分的性質(zhì)★固定相和流動相的性質(zhì)★溫度：T越大，K越小2023/7/1934第34頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月★

K越大，Cs越大，在柱中停留的時間越長，組分就后流出色譜柱；★

K越小，Cs越小，在柱中停留的時間越短，組分就先流出色譜柱。

★

K=0，組分不被固定相保留，最先流出。混合物中各組分的K相差越大，就越容易分離。2023/7/1935第35頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月2、容量因子k(capacityfactor)組分在固定相中的質(zhì)量組分在流動相中的質(zhì)量=ms/mm=Kvs/vm

k=k隨T、固定相、流動相的體積變化而變化k越大，組分在固定相中質(zhì)量越多，tR越長K、k越大，組分在固定相中tR就越長2023/7/1936第36頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月★

色譜法的分離原理主要是利用物質(zhì)在流動相和固定相中K的差異而分離?！喾蛛x的前提：K不等。要求組分間必須有差速遷移，即tR不等。2023/7/1937第37頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)色譜法的基本理論

一、塔板理論

在50年代，色譜技術(shù)發(fā)展的初期，Martin等人把色譜分離過程比作分餾過程，并把分餾中的半經(jīng)驗理論－塔板理論用于色譜分析法。2023/7/1938第38頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月分餾塔：在塔板上多次氣液平衡，按沸點不同而分離。色譜柱：組分在兩相間的多次分配平衡，按分配系數(shù)不同而分離。2023/7/1939第39頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月塔板理論假定：①在色譜柱內(nèi)每一“塔板”H內(nèi)，組分在兩相間瞬間達到分配平衡。②流動相間歇式進入色譜柱，每次進入一個塔板體積。③分配系數(shù)在各塔板內(nèi)是常數(shù)。④縱向擴散可以忽略。2023/7/1940第40頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）質(zhì)量分配和轉(zhuǎn)移1、單一組分B（kB=0.5）的分配和轉(zhuǎn)移

①設色譜柱的塔板數(shù)n=5，即r=0、1、2、3、4（或n-1）號。

②將單位質(zhì)量的B加到第0號塔板上。

③分配平衡后，0號塔板內(nèi)ms/mm＝ 0.333/0.667。

④進入一個塔板體積的流動相（一次轉(zhuǎn)移），2023/7/1941第41頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/1942第42頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月經(jīng)過N次轉(zhuǎn)移后，質(zhì)量分布符合二項式(ms+mm)N的展開式。如N=3，展開式為：(0.333+0.667)3=0.037+0.222+0.444+0.296 0123號在固定相和流動相中的質(zhì)量分布由k(K)決定2023/7/1943第43頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)移N次后，第r號塔板中的質(zhì)量Nmr：

2023/7/1944第44頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月例：轉(zhuǎn)移3次后，在第2號塔板內(nèi)的溶 質(zhì)分數(shù)2023/7/1945第45頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月組分B(kB=0.5)在n=5的色譜柱內(nèi)及出口的分布

Nr01234柱出口010000010.3330.667000020.1110.4440.44500030.0370.2220.4440.2960040.0120.0990.2690.3950.1980

50.0040.0410.1640.3290.3290.132

60.0010.0160.0820.2190.3290.219

700.0060.0380.1280.2560.219800.0020.0170.0680.1700.1709000.0070.0330.1020.11410000.0020.0160.0560.0682023/7/1946第46頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月注意：1、柱出口處的質(zhì)量分數(shù)的計算。2、質(zhì)量（濃度）最大點的N，即保留體積。2023/7/1947第47頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月2、兩組分的分離A(kA=1)和B(kB=0.5)兩組分2023/7/1948第48頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月組分A(kA=1)在n=5的色譜柱內(nèi)和出口的分布

Nr01234柱出口010000010.50.5000020.250.50.2500030.1250.3750.3750.1250040.0630.2500.3750.2500.0630

50.0320.1570.3130.3130.1570.03260.0160.0950.2350.3130.2350.07970.0080.0560.1650.2740.2740.118

80.0040.0320.1110.2200.2740.137

90.0020.0180.0720.1660.2470.137100.0010.0100.0450.0940.2070.1242023/7/1949第49頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)果：組分B:k=0.5,當N=6和7時，柱出口產(chǎn)生B的濃度最大點。組分A：k=1，N=8和9時，柱出口處達到濃度最大點。兩組分開始分離，k小的組分B在柱后先出現(xiàn)濃度極大值,即先出柱。2023/7/1950第50頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月一根色譜柱n=103以上，組分有微小的分配系數(shù)(容量因子)差別即可實現(xiàn)完全分離。 分配系數(shù)(容量因子)不等是分離的前提。2023/7/1951第51頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月

(二)流出曲線方程

1、二項式分布曲線 以組分A在柱出口處的質(zhì)量分數(shù)對N作圖。2023/7/1952第52頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月N柱出口0010203040

5

0.03260.07970.118

80.13790.137100.124

k=1的組分從n=5色譜柱中的流出曲線圖2023/7/1953第53頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月2、色譜流出曲線當塔板數(shù)很大時，流出曲線趨于正態(tài)分布曲線。2023/7/1954第54頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/1955第55頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月3、色譜流出曲線方程（正態(tài)分布方程） 描述組分流出色譜柱的濃度變化：為標準差，tR為保留時間，C為任意時間t時的濃度，C0為峰面積A，即相當于某組分的總量。2023/7/1956第56頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月t=tR時，C有極大值：Cmax即流出曲線的峰高h。σ一定時，峰高h取決于C0。C0一定時，峰高h取決于σ。2023/7/1957第57頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月流出曲線方程的常用形式：不論t＞tR或t＜tR時，濃度C恒小于Cmax。C隨時間t向峰兩側(cè)對稱下降。σ越小，峰越銳。σ是柱效的標志。2023/7/1958第58頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月色譜峰面積以A代替C0，h代替Cmax，且W1/2=2.355σ，峰面積:A=h

σ(2

π)1/2A=1.065×W1/2×h

色譜定量的參數(shù)2023/7/1959第59頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)理論塔板高度和理論塔板數(shù)

(heightequivalenttoatheoretical plate或plateheight,H) (platenumber,n)

是色譜柱效參數(shù)。2023/7/1960第60頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月理論塔板數(shù)與標準差（峰寬或半峰寬）和保留時間的關系：2023/7/1961第61頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月理論塔板高度

H=L/n

注意：1、計算n時使標準差（峰寬或半峰寬）和保留時間單位一致

2、n的單位2023/7/1962第62頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月有效理論塔板數(shù)和有效理論塔板高度Hef=L/nef2023/7/1963第63頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月注意：★用nef和Hef作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質(zhì)?！锂攦山M分的K相同時，無論該色譜柱的n多大，都無法分離。2023/7/1964第64頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月存在問題:★做出的四個假設與實際不符，忽略了組分在兩相中傳質(zhì)和擴散的動力學過程?！镏荒芏ㄐ越o出塔板高度的概念，無法解釋板高的影響因素。★排除了一個重要參數(shù)——流動相的線速度u，因而無法解釋柱效與流速關系。2023/7/1965第65頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月二、速率理論——動力學觀點VanDeemteer方程式：渦流擴散項縱向擴散項傳質(zhì)阻力項載氣線流速(cm·s-1)u＝柱長L(cm)/死時間t0(s)理論塔板高度

(cm)u一定，A、B、C小，H小，柱效n高，峰尖銳2023/7/1966第66頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）渦流擴散項A當組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進中形成紊亂的類似“渦流”的流動（路徑不同）→不能同時流出色譜柱（色譜峰擴張），故稱渦流擴散。2023/7/1967第67頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月通常選粒度為60~100目的填充顆粒，并盡量填充均勻。但dp不能太小，否則不易填充均勻（λ大），且阻力（柱壓）也大。填充不規(guī)則因子填充物顆粒的平均直徑渦流擴散系數(shù)2023/7/1968第68頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月待測組分是以“塞子”的形式被流動相帶入色譜柱的，在“塞子”前后存在濃度梯度，由濃→稀方向擴散，產(chǎn)生了縱向擴散，使色譜峰展寬。（2）分子擴散項B/u（縱向擴散項）

2023/7/1969第69頁，課件共76頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）分子擴散項B/u（縱向擴散項）

氣體擴散路徑彎曲因子