利用GFPRFP雙熒光指示載體鑒定特異性啟動子功能

cjb@ChinJBiotech2008,December25;24(12):2106-2110 ChineseJournalofBiotechnologyISSN1000-3061?2008InstituteofMicrobiology,CAS&CSM,Allrightsreserved技術(shù)與方法技術(shù)與方法利用GFP/RFP雙熒光指示載體鑒定特異性啟動子功能1浙江大學(xué)園藝系,杭州3100292浙江林學(xué)院,杭州3113003北京市蔬菜研究中心,北京1000894SidneyKimmelComprehensiveCancerCenteratJohnsHopkins,USA摘要:在基因表達(dá)定位或啟動子調(diào)控模式的研究中,多以gusA作為報告基因。但由于部分組織中高內(nèi)源GUS背景活性或轉(zhuǎn)化手段的限制,使判斷基因表達(dá)定位或調(diào)控時存在很大誤差。為了解決上述問題,本實(shí)驗(yàn)將報告基因綠色熒光蛋白(GFP)和紅色熒光蛋白(RFP)融合構(gòu)建雙熒光標(biāo)記瞬時表達(dá)載體pBI221-RFP/GFP。該載體以CaMV35S啟動子驅(qū)動GFP確定轉(zhuǎn)化效率,通過鑒定陽性個體的紅色熒光活性分析目的基因或啟動子的表達(dá)模式。并通過番茄E8和西瓜AGPL1果實(shí)特異啟動子驗(yàn)證了該載體在啟動子調(diào)控模式研究中的應(yīng)用可行性。結(jié)果表明pBI221-RFP/GFP是一個可以在基因和啟動子功能驗(yàn)證中應(yīng)用的高效瞬時表達(dá)載體。關(guān)鍵詞:綠色熒光蛋白,紅色熒光蛋白,瞬時表達(dá)載體,特異性啟動子HarboringGFP/RFPDoublTaoYin1,QiaopingQin2,ShanglongZhang1,JingmeiLiu3,andDamingChen41DepartmentofHorticulture,ZhejiangUniversity,Hangzhou310029,China2ZhejiangForestyUniversity,Hangzhou311300,China3BeijingVegetableResearchCenter,Beijing100089,China4SidneyKimmelComprehensiveCancerCenteratJohnsHopkins,USAAbstract:Moststudiesrelatedtodeterminingtheexpressionprofileofgenesandspecificpromotersusedhistochemicallocalizatofthereportergene,gusA.WhilethehistochemicalmethodforvisualizinggusAdeterminationofgeneexpressionansientexpessionvectorpBIrusedCaMV35SpromotertodriveGFPanddandpromoterthroughtheRFPactivitiesofthetranformedtissues.ThroughthespecificpromoterAGPL1fromwpromoterfromtomato,itisresistibletousethisvectortostudytheexpressionpatternpBI221-RFP/GFPisaveryefficienttransientexpressionvectorthatcanbeverifythefunctionsofthegenesandpromoters.Keywords:greenfluorescentproteins,redfluorescentproteins,transientexpessionvectors,specificpromoterReceived:May20,2008;Accepted:AugSupportedby:theNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30671430).Correspondingauthor:ShanglongZhang.Tel:+86-571-86971009;FaxE-mail:shlzhang@國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30671430)資助。尹濤等:利用GFP/RFP雙熒光指示載體鑒定特異性啟動子功能2107對啟動子表達(dá)調(diào)控模式的研究中,多數(shù)以gusA作為報告基因來確定其在植物中的表達(dá)或定位[1?4]。gusA基因表達(dá)的組織化學(xué)檢測具有方便觀察等優(yōu)點(diǎn),但同時也存在很多局限性。如:酶本身或反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)散到周圍非表達(dá)細(xì)胞和組織中,引起GUS活性定位的誤差[5,6]。GUS定位過程中的染色由于染料滲入到細(xì)胞中而引起細(xì)胞死亡,使得對基因表達(dá)或調(diào)控的適時檢測難以控制,這些弊端降低了以gusA作為報告基因的研究可靠性。熒光蛋白基因可以在未受任何損壞的活體細(xì)胞中檢測其表達(dá)。對部分GUS背景活性很高的組織如葉片、花粉等進(jìn)行研究時,可以克服內(nèi)源GUS活性對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的誤差。在本實(shí)驗(yàn)中,我們構(gòu)建了RFP/GFP串聯(lián)的雙熒光指示瞬時表達(dá)載體,以GFP作為瞬時轉(zhuǎn)化的內(nèi)參確立陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織,通過對具GFP熒光活性細(xì)胞進(jìn)行RFP的熒光觀察,以此對啟動子的功能進(jìn)行評價,減小了實(shí)驗(yàn)過程中存在于轉(zhuǎn)化方式、轉(zhuǎn)化效率等方面的誤差,同時也克服了染色觀察檢測步驟繁瑣等諸多不利因素。并通過番茄E8啟動子和西瓜AGPL1啟動子的果實(shí)特異性調(diào)控功能,對此表達(dá)載體成功地進(jìn)行了驗(yàn)證。1.1.1質(zhì)粒載體與菌株pBI221-mGFP6和pBI221-mRFP2作為表達(dá)載體構(gòu)建的初始載體。含該質(zhì)粒的DH5α甘油菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.1.2試劑與修飾酶限制性內(nèi)切酶,T4DNA聚合酶和T4DNA連接酶購自NEB公司。1.2.1pBI221-RFP/GFPpBI221-mGFP6載體內(nèi)部XbaI和SacI酶切位點(diǎn)除去時,首先對質(zhì)粒進(jìn)行酶切,并對線性化質(zhì)粒用T4DNApolymerase進(jìn)行補(bǔ)平,然后由T4DNAligase進(jìn)行連接,最終得到內(nèi)部無XbaI和SacI酶切位點(diǎn)的載體。對包含RFP和GFP基因的載體進(jìn)行融合構(gòu)建pBI221-RFP/GFP,具體操作步驟如圖1所示。1.2.2瞬時表達(dá)載體的功能驗(yàn)證PEG分級沉淀法提取質(zhì)粒DNA《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版),微粒子彈的制備和基因槍轟擊操作按Bio-Rad公司說明書進(jìn)行?；驑屴Z擊在Bio-Rad公司PDS-1000/He上進(jìn)行。轟擊距離7cm,轟擊壓力為1300psi。洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞作為受體材料,瞬時轉(zhuǎn)化后的材料于24oC培養(yǎng)。1.2.3熒光顯微成像光源為HBO100W汞燈,綠色熒光在激發(fā)波長450nm~490nm,檢測波長505nm,500nm濾光片下觀察,紅色熒光在激發(fā)波長510nm~560nm,檢測波長575nm,590濾光片下觀察,紫外熒光在激發(fā)波長380nm~420nm,檢測波長430nm,450濾光片下觀察。圖象采集由NikonEclipseE400顯微成像系統(tǒng)1.2.4應(yīng)用pBI221-RFP/GFP載體驗(yàn)證西瓜AGPL1果實(shí)特異啟動子西瓜AGPL1果實(shí)特異啟動子(?1140~+433)由HindIII和XbaI雙酶切獲得啟動子基因片段,替換pBI221-RFP/GFP中RFP上游CaMV35S啟動子,形成AGPL1啟動子-RFP-Noster-CaMV35S-GFP-Noster的串聯(lián)結(jié)構(gòu),命名為pRG-AGPL1。番茄果實(shí)特異啟動子E8(?1532~+24)替換pBI221-RFP/GFP中RFP上游CaMV35S啟動子,作為啟動子功能驗(yàn)證中的陽性對照,命名為pRG-E8。2.1pBI221-RFP/GFP雙熒光瞬時表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定圖1為pBI221-RFP/GFP雙熒光瞬時表達(dá)載體的構(gòu)建流程。去除pBI221-mGFP6中XbaI和SacI兩個酶切位點(diǎn)之后,進(jìn)行PstI單酶切后再補(bǔ)平形成具兩平端的線性化DNA;然后進(jìn)行HindIII單酶切,形成HindIII位點(diǎn)粘性末端,PstI位點(diǎn)平滑末端的不對稱線性DNA分子。對質(zhì)粒DNApBI221-mRFP2進(jìn)行EcoRI單酶切后再補(bǔ)平形成具兩平端的線性化DNA,然后進(jìn)行HindIII單酶切,形成HindIII位點(diǎn)粘性末端,EcoRI位點(diǎn)平滑末端的不對稱線性DNA分子片段和載體。對含RFP的分子片段與GFP載體進(jìn)行連接,形成“HindIII-CaMV35S-XbaI-RFP-SacI-Noster-CaMV35S-GFP-Noster-EcoRI”串聯(lián)結(jié)構(gòu),J 2108ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechDecember25,2008Vol.24No.12圖1pBI221-RFP/GFP雙熒光指示瞬時表達(dá)載體的構(gòu)建流程圖Fig.1ConstructionoftransientexpressionvectorspBI221-RFP/GFPharboringdoublefluorescentgenes其中GFP和RFP均由CaMV35S啟動子驅(qū)動。驅(qū)動RFP的35S啟動子5′端含有HindIII、SphI、PstI位點(diǎn),3′端含有XbaI位點(diǎn),便于進(jìn)行其他啟動子功能驗(yàn)證時克隆的操作。圖2為對RFP/GFP瞬時表達(dá)載體的酶切檢測。HindIII+SacI雙酶切檢測35S啟動子和RFP約1.6kb;HindIII+XbaI雙酶切檢測驅(qū)動GFP上游的35S啟動子780bp;SacI+EcoRI雙酶切檢測Nos終止子+CaMV35S啟動子+GFP+Nos終止子共約2.1kb;由圖所示兩個不同克隆的酶切檢測均符合預(yù)計(jì)大小,判斷為正確克隆。2.2pBI221-RFP/GFP雙熒光指示載體的功能檢測圖3為瞬時轉(zhuǎn)化pBI221-GFP/RFP載體后熒光顯微成像。轉(zhuǎn)化后的表皮細(xì)胞在綠色熒光檢測波長下有較強(qiáng)綠色熒光出現(xiàn),表明CaMV35S啟動子驅(qū)動GFP標(biāo)記基因表達(dá)。該細(xì)胞或細(xì)胞群為瞬時轉(zhuǎn)化的J陽性細(xì)胞,同一明場下的細(xì)胞在紅色熒光檢測波長下也具有較強(qiáng)的紅色熒光出現(xiàn),說明由CaMV35S作為假定啟動子進(jìn)行調(diào)控模式研究時也得到了表達(dá),兩標(biāo)記基因在相同細(xì)胞內(nèi)得到表達(dá),且基因表達(dá)的定位與強(qiáng)度相同(圖A1、A2;放大40×,標(biāo)尺所示為200μm)。由此說明,在雙指示標(biāo)記的瞬時表達(dá)載體可以更有針對性地對目的細(xì)胞進(jìn)行分析,縮小了研2.3利用pBI221-RFP/GFP瞬時表達(dá)載體鑒定啟動子特異性的研究將西瓜果實(shí)特異啟動子AGPL1取代pBI221-RFP/GFP瞬時表達(dá)載體中驅(qū)動RFP基因的CaMV35S啟動子,形成pRG-AGPL1載體,并轉(zhuǎn)化莖表皮細(xì)胞。pRG-E8載體中番茄果實(shí)特異啟動子E8驅(qū)動RFP基因,作為陰性對照。由于啟動子果實(shí)特異性的存在,報告基因RFP將在除果實(shí)外的其他組織中檢測不到熒光活性[7]。如圖4A所示,在檢測到綠色尹濤等:利用GFP/RFP雙熒光指示載體鑒定特異性啟動子功能2109熒光活性的細(xì)胞中,由于GFP基因由CaMV35S啟動子驅(qū)動有較強(qiáng)的表達(dá);而在陽性細(xì)胞中RFP基因受果實(shí)特異啟動子E8的驅(qū)動,在表皮細(xì)胞中檢測不到紅色熒光出現(xiàn)。這與pBI221-RFP/GFP中綠色和紅色熒光蛋白基因同等強(qiáng)度的表達(dá)模式完全不同。圖2pBI221-RFP/GFP雙熒光瞬時表達(dá)載體的酶切檢測Fig.2RestrictionenzymedigestionanalysisoftransientexpressionvectorsharboringRFPandGFP1,2:HindIII+SacI;3,4:HindIII+XbaI;5,6:EcoRI+SacI;M:DL2000marker;CK:pBI221-RFP/GFPascontrol圖3pBI221-RFP/GFP雙熒光指示瞬時表達(dá)載體功能檢測Fig.3CaMV35Spromoter-drivenGFPandRFPtransientexpressioninepidermalcellsA:lightimagesunder40×microscopes;A1:greenfluorescentimagesofA;A2:redfluorescentimagesofA1;B1:greenfluorescentimages;B2:redfluorescentimagesofB1;B3:fluorescentimagesofB1當(dāng)以西瓜APGL1啟動子驅(qū)動RFP對表皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化時發(fā)現(xiàn),在綠色細(xì)胞中同樣檢測不到紅色熒光活性(圖4B)。由此說明西瓜AGPL1啟動子與番茄E8果實(shí)特異啟動子一樣,由其驅(qū)動的紅色熒光蛋白基因在表皮細(xì)胞中并不表達(dá);而該啟動子與報告基因融合轉(zhuǎn)化西瓜果實(shí)時則表現(xiàn)出很強(qiáng)的驅(qū)動活性,說明該啟動子在果實(shí)中具備活性而莖表皮細(xì)胞中不存在驅(qū)動活性,與AGPL1啟動子驅(qū)動基因在莖表皮細(xì)胞中的表達(dá)模式綜合分析,認(rèn)為該啟動子具備了果實(shí)特異性的調(diào)控特征,從而說明該載體可以應(yīng)用于鑒定啟動子驅(qū)動模式的研究。圖4pBI221-RFP/GFP介導(dǎo)啟動子特異性表達(dá)模式研究Fig.4SpecificexpressionassaysofpromotersmediatedbypBI221-RFP/GFPvectorA:transformedepidemalcellsofpRG-E8;B:transformedepidermalcellsofpRG-AGPL1;A1,B1:lightimages;A2,B2:greenfluorescentimages;A3,B3:redfluorescentimagesGFP(Greenfluorescentprotein)從水母(Aequoreavictoria)中得到,并首先在動物基因表達(dá)的研究中應(yīng)用[8,9]。RFP(Redfluorescentprotein)來源于?？?Discosomasp.),其一級結(jié)構(gòu)與GFP僅有23%的同源性[10];靈敏度與信噪比均比GFP高,熒光強(qiáng)度不受pH影響而發(fā)生熒光淬滅,為基于GFP的體內(nèi)研究提供了一個很好的互補(bǔ)工具[11?13]。gusA作為報告基因在啟動子表達(dá)模式研究或組織化學(xué)定位中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用,但在高GUS背景活性的組織中進(jìn)行研究時卻存在很大誤差[1,14]。目前瞬時表達(dá)研究體系多以基因槍為主,轉(zhuǎn)化過程受許多因素的影響(如受體材料等),容易把低轉(zhuǎn)化率的表達(dá)量誤判為啟動子功能喪失。雖然操作者試圖通過各種途徑減少其影響,如設(shè)置陽性對照質(zhì)粒與目的質(zhì)粒DNA協(xié)同轉(zhuǎn)化等,但這些策略都不能完全避免操作上的誤差。因此我們構(gòu)建以GFP為內(nèi)參,以RFP為報告基因的瞬時表達(dá)載體對啟動子的特異性模式進(jìn)行研究,可以定向地只在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中進(jìn)行目的啟動子的研究,增加了研究的針對性并減少工作量。在利用pBI221-GFP/RFP瞬時表達(dá)載體進(jìn)行啟動子功能調(diào)控模式的研究時,將待測啟動子替代驅(qū)動RFP基因的CaMV35S啟動子,與CaMV35S驅(qū)動的GFP串聯(lián)轉(zhuǎn)化入受體細(xì)胞或組織。首先在綠色熒光下對轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織進(jìn)行精確定位,再對同一J 2110ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechDecember25,2008Vol.24No.12部位細(xì)胞進(jìn)行紅色熒光觀察,這樣使待研究的靶向細(xì)胞具有專一的針對性,避免了系統(tǒng)和操作帶來的誤差。在特異性啟動子表達(dá)模式的研究中,假定的果實(shí)特異性啟動子將只在果實(shí)中表達(dá),而在其他組織中則檢測不到標(biāo)記基因的活性。以西瓜AGPL1啟動子為例進(jìn)行驗(yàn)證,并以番茄果實(shí)特異啟動子E8為對照,確定該類型啟動子在表皮細(xì)胞中無驅(qū)動活性,而在果實(shí)中高驅(qū)動活性的果實(shí)特異性驅(qū)動模式。因此判斷,pBI221-RFP/GFP瞬時表達(dá)載體在啟動子驅(qū)動模式的檢驗(yàn)中可以廣泛應(yīng)用。另外,將pBI221-RFP/GFP載體中的RFP報告基因與目的基因串聯(lián)形成融合蛋白,還可以對基因表達(dá)的亞細(xì)胞定位進(jìn)行研究。而且在啟動子活性的檢測中,還可以由RFP/GFP的熒光強(qiáng)度比值來精確定量啟動子的驅(qū)動活性。因此,pBI221-RFP/GFP瞬時表達(dá)載體可應(yīng)用于啟動子分析、轉(zhuǎn)基因、蛋白質(zhì)和細(xì)胞定位、藥物篩選、細(xì)胞、整個器官的雙標(biāo)記,以及利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)研究蛋白與蛋白的相互作用。因此,RFP與GFP相結(jié)合,為分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了一個新的、快捷的檢測手段。致謝清華大學(xué)生物系黃健博士對本實(shí)驗(yàn)提供了技術(shù)支持,特此表示感謝。REFERENCES[1]JeffersonRA,KavanaghTA,BevanMW.GUSfusions:β-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ,1987,6:3901?3907.[2]BenfeyPN,ChuaNH.Thecauliflowermosaicvirus35Spromoter:combinatorialregulationoftranscriptioninplants.Science,1990,250:959?966.[3]BattrawMJ,HallTC.HistochemicalanalysisofCaMV35Spromoter-β-glucuronidasegeneexpressionintransgenicriceplants.PlantMolBiol,1990,15:527?538.[4]TeradaR,ShimamotoK.ExpressionofCaMV35S-GUSgeneintransgenicriceplants.MolGenetGenomics,1990,[5]YangNS,ChristouP.CelltypespecificexpressionofaCaMV35S-GUSgeneintransgenicsoybeanplants.Dev[6]MascarenhasJP,HamiltonDA.ArtifactsinthelocalizationofGUSactivityinanthersofpetuniatransformedwithaCaMV35S-GUSconstruct.PlantJ,[7]WuHY,LiuJM,YangXT,etal.Primarytargetingoffunctionalregionsinvolvedintranscriptionalregulationonwatermelonfruit-specificpromoterWSP.ChinJBiotech,2003,19(2):227?230.吳韓英,劉敬梅,楊信廷,等.西瓜果實(shí)特異啟動子WSP功能調(diào)控區(qū)域的初步定位.生物工程學(xué)報,2003,[8]ChalfieM,TuY,EuskirchenG,etal.Greenfluorescentproteinasamarkerforgeneexpression.Science,1994,[9]WangS,HazelriggT.Imp