微生物檢驗授課講稿

微生物檢驗授課講稿1第1頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月無菌室的質(zhì)量管理菌種保存、復(fù)壯及管理藥品微生物限度檢查方法藥品微生物檢查法的驗證2第2頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月無菌室的管理陳設(shè)盡量簡單，僅放置必需用的儀器設(shè)備無菌室應(yīng)每周和每次操作前用0.1%新潔爾滅擦拭操作臺及可能污染的死角，室內(nèi)無菌空氣過濾器及紫外燈殺菌1小時。人員：肥皂洗手，0.1%新潔爾滅洗手，換無菌服、鞋，進入。操作必須符合無菌要求，穿好無菌服后，不能反復(fù)出入無菌間，手不能來回出入操作臺。在每次操作完畢，同樣用上述消毒溶液擦拭工作臺面，除去空氣濕氣，用紫外燈殺菌半小時。非無菌室工作人員不得進入，對外來維修人員要進行監(jiān)督。緩沖間不得放雜物、培養(yǎng)箱等。定期對門、窗、墻面等消毒。定期檢查潔凈度情況。3第3頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月通常，實驗室應(yīng)劃分成潔凈或無菌區(qū)域和活菌操作區(qū)域，同時應(yīng)根據(jù)試驗?zāi)康?，在時間或空間上有效分隔不相容的試驗活動，將交叉污染的風(fēng)險降低到最低。一般情況下，藥品微生物檢驗的實驗室應(yīng)有符合無菌檢查法和微生物限度檢查法要求的、用于具有開展無菌檢查、微生物限度檢查、無菌采樣等檢測活動的、獨立設(shè)置的潔凈室（區(qū)）或隔離系統(tǒng)，并為上述檢驗配備相應(yīng)的細(xì)菌（真菌）等實驗室、培養(yǎng)室、培養(yǎng)基及實驗用具準(zhǔn)備（包括滅菌）區(qū)、樣品接收和儲藏區(qū)、標(biāo)準(zhǔn)菌株儲藏區(qū)、污染物處理區(qū)和文檔處理區(qū)等輔助區(qū)域，同時，應(yīng)對上述區(qū)域明確標(biāo)識。實驗室應(yīng)對進出潔凈區(qū)域的人和物建立控制程序和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，應(yīng)按相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)建立潔凈室（區(qū)）和隔離系統(tǒng)的驗證、使用和清潔維護標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，對可能影響檢測結(jié)果的工作（如潔凈度驗證及監(jiān)測、消毒、清潔維護等）能夠有效地控制、監(jiān)測并記錄。4第4頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月潔凈度的要求

應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行。檢驗全過程必須無菌。工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進行潔凈度驗證。5第5頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月5個基本概念⑴抑菌：抑制體內(nèi)或體外細(xì)菌的生長繁殖。⑵防腐：防止或抑制體外細(xì)菌生長繁殖的方法。細(xì)菌一般不死亡。使用同一種化學(xué)藥品在低濃度時為防腐劑，在高濃度時為消毒劑。⑶消毒：殺滅物體上病原微生物的方法。并不一定殺死含芽孢的細(xì)菌或非病原微生物。用來消毒的藥品叫消毒劑。一般消毒劑在常用濃度下只對細(xì)菌的繁殖體有效，對其芽孢則需提高消毒劑的濃度和延長作用時間。⑷無菌：不存在活菌。⑸滅菌：殺滅物體上所有微生物的方法。比消毒要求高，它殺滅了包括細(xì)菌芽孢在內(nèi)的全部病原微生物和非病原微生物。6第6頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月滅菌和消毒的比較：共性：殺滅微生物以控制其污染和防止傳染。區(qū)別：1、殺滅微生物完全性的差異。滅菌要求完全殺滅微生物，滅菌后的藥品不應(yīng)含有活的微生物。而消毒不完全殺滅微生物，只能殺滅一部分微生物即病原微生物。這是相對的。因為強效消毒劑在適宜條件下可能達到滅菌效果；不適宜條件下滅菌，有不完全殺滅微生物的可能。2、方法上的差異：滅菌方法具有多樣性，消毒常借化學(xué)物質(zhì)。3、效果檢查的差異：滅菌效果用無菌檢查法檢測，而消毒效果以消毒劑的效價評定。7第7頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月常用的消毒劑潔凈室（區(qū)）常用的消毒劑甲醛薰蒸（作用機制：阻抑菌細(xì)胞核蛋白質(zhì)合成。甲醛是一種常用的殺細(xì)菌和殺真菌劑。市售的福爾馬林溶液就是37—40%的甲醛水溶液。常用于保存動物標(biāo)本，也可以作氣體熏蒸和液體消毒。甲醛有揮發(fā)性，對眼睛、皮膚有刺激性，引起皮膚硬化或皺褶，不宜做皮膚消毒用。）0.1%新潔爾滅溶液(作用機制：使蛋白質(zhì)變性，破壞細(xì)胞膜。)75%酒精溶液（常用于皮膚消毒。能迅速殺死細(xì)菌繁殖體，對一般病毒有一定的消毒作用。）5%來蘇水(甲酚皂)溶液（作用機制：損傷細(xì)胞膜）8第8頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月滅菌的方法1、熱力滅菌：主要是利用高溫的致死作用，使微生物的蛋白質(zhì)和核酸等重要生物高分子發(fā)生變性、破壞，而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。分為干熱滅菌與濕熱滅菌(1)干熱滅菌：灼燒與火焰滅菌、干烤滅菌

灼燒主要用于接種工具滅菌，如接種針、接種環(huán)、刀、剪等在火焰上燒灼即可達到徹底滅菌。

火焰滅菌是在無菌操作中，將試管口、玻璃瓶口、硅氟塑料塞等反復(fù)通過火焰數(shù)次，利用火焰對管口等進行滅菌，防止管口污染，作為無菌操作過程中的輔助滅菌手段。

干烤滅菌是利用熱輻射及干熱空氣進行滅菌。9第9頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月2)濕熱滅菌法：通過熱蒸汽或沸水使細(xì)菌蛋白質(zhì)變性而殺滅微生物的方法。包括：煮沸滅菌、流通蒸汽滅菌、高壓蒸汽滅菌煮沸滅菌：加熱使水至沸而殺滅細(xì)菌的方法。凡不適于高壓蒸汽滅菌的物品可常壓下在水中煮沸一段時間達到滅菌目的。流通蒸汽滅菌：常壓下，用蒸籠、蒸鍋等在100℃滅菌。僅可殺死細(xì)菌繁殖體，不能完全殺滅芽孢。高壓蒸汽滅菌：通過加壓提高蒸汽溫度，用高壓蒸汽滅菌，穿透力強、溫度高、滅菌效果最好。是最可靠最適用最廣泛的滅菌方法，凡耐高溫和潮濕的物品可應(yīng)用本法滅菌。注意事項：完全排出高壓滅菌器內(nèi)的冷空氣。（冷空氣存在時，同一表壓下所達到的溫度值偏低，不符合規(guī)定的要求，滅菌就不徹底。)10第10頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月2、氣體滅菌：利用化學(xué)消毒劑形成的氣體來殺滅微生物。臭氧殺菌消毒廣泛存在于自然界中，雷雨過后的空氣有一種清新的感覺，是因為空中放電產(chǎn)生臭氧，消滅了空氣中的微生物，凈化了空氣。臭氧具有強烈的殺菌消毒作用。其殺菌消毒原理是：臭氧在常溫、常壓下分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，很快自行分解成氧和單個氧分子，后者具有很強的活性，對細(xì)菌具有很強的氧化作用，臭氧氧化分解了細(xì)菌內(nèi)氧化葡萄糖所必需的酶，從而破壞其細(xì)胞膜，將它殺死。多余的氧原子則會自行重新結(jié)合成為普通氧分子，不存在任何有毒殘留物，故稱為無污染消毒劑。不但對各種細(xì)菌（包括肝炎病毒、大腸桿菌、綠膿桿菌及雜菌等）有極強的殺滅能力，且對殺死霉菌也很有效。

11第11頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月3、輻射滅菌（1）電離輻射:用引起電離的X射線、γ射線滅菌。電離輻射對微生物的致死作用，主要是細(xì)胞內(nèi)生物化學(xué)的變化所致。輻射的藥品、食品的安全問題：輻射滅菌用于藥品或食品都應(yīng)經(jīng)過安全試驗，完全有必要進行科學(xué)全面的評價，高劑量的輻射更應(yīng)慎重。Co60輻射滅菌后，被輻射物質(zhì)的溫度升高很少，一般僅約5℃，故Co60輻射滅菌又稱“冷滅菌”。（2）電磁波輻射（包括紫外線[波長190～350nm]、紅外線[波長0.77～1000μm]、微波[波長1～1000mm]）。12第12頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月紫外線滅菌1、紫外線輻射的穿透力很弱，因此主要用于無菌室、某些工作區(qū)的空氣滅菌、物體表面滅菌。2、實踐工作中在無菌室無菌柜凈化工作臺工作室及車間安裝紫外燈，一般僅起殺死空氣中部分微生物的作用，而不能起到完全滅菌的作用。3、紫外線消毒方法驗證中紫外燈需確認(rèn)的參數(shù)主要有紫外線的波長、紫外線強度、燈管的壽命。（254nm；90uw/㎡;1000小時）4、紫外燈消毒的效果與紫外線強度、照射時間、溫度與濕度等因素有關(guān)，還需通過驗證來確定。5、注意事項：紫外線直射對眼、皮膚有損害。紫外線照射過程中產(chǎn)生臭氧，臭氧過多對眼及鼻腔有刺激，產(chǎn)生頭暈、胸悶、血壓降低，所以無菌室及凈化工作臺紫外線照射停止后，請稍等片刻，讓臭氧消散，方可進行實驗操作。13第13頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月4、過濾滅菌：以物理的方法除去介質(zhì)中的微生物。常將空氣或液體中的微生物及雜質(zhì)用不同材料制成的薄膜濾器過濾得到無菌、無雜質(zhì)的空氣或液體。濾過病毒的濾膜孔徑為25～100nm；濾過細(xì)菌的濾膜孔徑為0.22～0.45μm。14第14頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗室在儀器設(shè)備完成相應(yīng)的檢定、校準(zhǔn)、驗證、確認(rèn)其性能，并形成相應(yīng)的操作、維護和保養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程后方可正式使用，使用要有記錄。為保證設(shè)備處于良好工作狀態(tài)，應(yīng)定期維護和期間核查，并保存相關(guān)記錄。微生物實驗室所用的儀器應(yīng)根據(jù)日常使用的情況進行定期的校準(zhǔn)，并記錄。校準(zhǔn)的周期和校驗的內(nèi)容將根據(jù)儀器的類型和設(shè)備在實驗室產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的重要性的不同而不同。重要的儀器設(shè)備，如培養(yǎng)箱、冰箱等，應(yīng)由專人負(fù)責(zé)，保證其運行狀態(tài)正常和受控，同時應(yīng)有相應(yīng)的備用設(shè)備以保證試驗菌株和微生物培養(yǎng)的連續(xù)性；對于培養(yǎng)箱、冰箱、高壓滅菌鍋等影響實驗準(zhǔn)確性的關(guān)鍵設(shè)備應(yīng)在其運行過程中對關(guān)鍵參數(shù)（如溫度、壓力）進行連續(xù)觀測和記錄，有條件的情況下盡量使用自動記錄裝置。如果發(fā)生偏差，應(yīng)評估對以前的檢測結(jié)果造成的影響并采取必要的糾正措施。對于一些容易污染微生物的儀器設(shè)備如水浴鍋、培養(yǎng)箱、冰箱和生物安全柜等應(yīng)定期進行清潔和消毒。對試驗需用的無菌器具應(yīng)實施正確的清洗、滅菌措施，并形成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，無菌器具應(yīng)有明確標(biāo)識并與非無菌器具加以區(qū)別。15第15頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月菌種保存、復(fù)壯及管理

保存原則

保存方法復(fù)壯管理16第16頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月菌種的保存原則挑選特征典型的純菌菌落確定保存的合適菌體形態(tài)，凡能產(chǎn)生孢子或芽孢的微生物都用孢子或芽孢保存選擇最適宜的保存方法進行保存定期對保存的菌種進行檢查17第17頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月菌種保存的常用方法瓊脂斜面低溫保存法甘油冷凍管保藏法半固體瓊脂斜面低溫保存法液體石蠟保存法超低溫保存法（菌種）砂土18第18頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月1.瓊脂斜面低溫保存法（1）方法：將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，按規(guī)定的溫度和時間培養(yǎng)，待充分生長后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙保好，為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長保藏時間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔2-3個月移種一次，繼續(xù)進行保藏。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，一般可保藏半年至一年。有的甚至更長時間。（2）適用范圍：細(xì)菌、酵母菌、霉菌保藏（3）特點：優(yōu)點是——簡便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養(yǎng)基；對大多數(shù)微生物都適用。缺點是——保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。19第19頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月4）注意事項：保藏的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。保藏時，破傷風(fēng)桿菌可用庖肉培養(yǎng)基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動或生霉，如有異常應(yīng)及時處理。每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號、名稱逐一核對，確證培養(yǎng)基特征和純度無誤后再繼續(xù)保藏。保藏菌種的培養(yǎng)基應(yīng)無糖，其他菌類含糖小于2%為宜，以免產(chǎn)酸過多，影響菌種存活。銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。20第20頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月2、液體石蠟保存法：

本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理生化水平，并可防止水分蒸發(fā)，從而延長菌種的保藏期。

（1）方法：將菌種接種于斜面或穿刺于0.3-0.5%瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好備用。取化學(xué)純的液體石蠟裝在試管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上紙，121℃高壓滅菌30min，取出置37℃溫箱或110~170℃烤箱中1~2h或干燥器內(nèi)除去液體石蠟中的水分將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好的菌種試管內(nèi)，液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端1㎝為宜，將試管直立，放入4℃冰箱中保藏。適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對細(xì)菌保藏效果較差。（3）特點：本方法簡便易行，是實驗室常用的一種保藏方法，該法主要使菌種與空氣隔絕。21第21頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）注意事項：①保藏時，用新鮮培養(yǎng)物接種，應(yīng)檢查純度和特征后，方可進行保藏。②保藏過程中，需經(jīng)常觀察斜面是否干燥，如干燥,需重新移種。③使用菌種時，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新鮮斜面上培養(yǎng)，待長出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上即可使用。④將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下燒灼時，液體石蠟四濺，引起污染。⑤液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基的高度要嚴(yán)格控制，如太多，會影響菌種交換氣體，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面1㎝為宜。

⑥制備無菌液體石蠟時，每管裝量不能太多，否則分裝到菌種培養(yǎng)基中易造成污染。22第22頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月3、半固體瓊脂培養(yǎng)基（0.5%）4、40%甘油保存法：

23第23頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月菌種的復(fù)壯分離純化：瓊脂平板分離、單細(xì)胞（菌體或孢子）的分離通過宿主復(fù)壯淘汰退化理化因素誘變24第24頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月

沙門菌——SS瓊脂平板大腸埃希菌——EMB瓊脂平板25第25頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月銅綠假單胞菌——

溴化十六烷三甲銨瓊脂培養(yǎng)基金黃色葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基26第26頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月菌種的管理專人管理，加鎖保存在冰箱內(nèi)，保存菌種的冰箱不得放置食品及易揮發(fā)性試劑及有機溶媒等。定期有專人按操作規(guī)程進行傳代接種。并做純度、特性等實驗室所需關(guān)鍵診斷指標(biāo)的確認(rèn)，并記錄；每支菌種都應(yīng)適當(dāng)標(biāo)注，注明其名稱、標(biāo)準(zhǔn)號、接種日期、所傳代數(shù)；菌種生長的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。菌種定期檢查，發(fā)現(xiàn)染菌及變異現(xiàn)象應(yīng)及時報告，研究處理。實驗菌種不得任意帶出。使用致病菌時應(yīng)及時通知保管人員，用后必須及時處理。27第27頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月菌種金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]大腸埃希菌(Escherichiacoli))[CMCC(B)44102]枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]乙型副傷寒沙門菌（SalmonellaparatyphiB）[CMCC(B)50094]28第28頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月菌液的制備（1）接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯中，30～35℃培養(yǎng)18-24小時，取此培養(yǎng)液1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5

～10-7，使細(xì)菌數(shù)約為10～100cfu/ml。29第29頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月菌液的制備（2）接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)18-24小時，取此培養(yǎng)物1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5-10-7，使細(xì)菌數(shù)約為50-100cfu/ml。30第30頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月菌液的制備（3）

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng)5～7天，加3-5ml0.9％無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液，取1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4-10-6，使細(xì)菌數(shù)約為50～100cfu/ml。

31第31頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月藥品微生物限度檢查方法微生物限度檢查法：檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。是判定藥品受到微生物污染程度的重要指標(biāo)，也是對生產(chǎn)企業(yè)的設(shè)備器具、工藝流程、生產(chǎn)環(huán)境和操作者的衛(wèi)生狀況進行衛(wèi)生學(xué)評價的綜合依據(jù)之一。藥品的生產(chǎn)、貯存、銷售過程中的檢驗，原料及輔料的檢驗，新藥標(biāo)準(zhǔn)制訂，進口藥品標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核，考察藥品質(zhì)量及仲裁等，除另有規(guī)定外，其微生物限度檢查均以本標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)。檢查項目：細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌的檢查。32第32頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗中的注意事項培養(yǎng)基配制的注意事項：采用干燥培養(yǎng)基，按說明配制，滅菌后對培養(yǎng)基pH值進行校驗。配制的培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀，如有沉淀，應(yīng)于溶化后趁熱過濾，滅菌后使用。培養(yǎng)基的分裝量一般不超過容器的1/3，以免滅菌時溢出。包裝時，塞子必須塞緊，以免松動或脫落造成染菌。培養(yǎng)基配制后在2h內(nèi)滅菌，避免細(xì)菌繁殖，影響滅菌效果。滅菌后的培養(yǎng)基在冷暗處保存?zhèn)溆?，放置時間不能過長，一般不超過1個月，倒好的碟子不過3～5天，以免水分散失及染菌。已熔化的培養(yǎng)基應(yīng)一次用完，不能反復(fù)使用。不用電爐直接熔化，以免局部過熱營養(yǎng)成份被破壞。應(yīng)用水浴或微波爐加熱。33第33頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月操作技術(shù)中的注意事項將物品一次準(zhǔn)備完全，避免來回出入操作臺、無菌室，全過程必須符合無菌技術(shù)要求。不溶于水的樣品，必須加乳化劑、助溶劑等溶解后操作。勿在乙醇燈焰正上方操作，以免燈焰將供試液中菌細(xì)胞殺滅。加完稀釋劑后，試管塞就立即塞上?？焖傥?、吹打，不能用嘴吹吸，吸管內(nèi)放棉花管尖不許接觸可能污染的任何容器或用具稀釋時每一級換管（原吸管不要吹洗），上一級吸管不能接觸下一級稀釋液34第34頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月取均勻供試液稀釋、注平皿（特別注意研細(xì)）上清液和沉淀物影響測定結(jié)果注平皿時，要求管內(nèi)不殘留溶液3.3制最準(zhǔn)確，即3級稀釋，3個平皿，但廠方也可根據(jù)自己品種選擇培養(yǎng)基嚴(yán)格控制在45±1℃，水浴。培養(yǎng)基搖合快速、均勻，不要濺到皿邊和皿蓋上。從稀釋到傾注培養(yǎng)基全部操作在1小時內(nèi)全部完成。35第35頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)果判斷的注意事項不要漏計細(xì)小的（可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間）、瓊脂內(nèi)和平皿邊緣生長的菌落。注意細(xì)菌、酵母菌及霉菌的區(qū)別，以及菌落與藥渣、培養(yǎng)基沉淀、藥物結(jié)晶的區(qū)別。平均菌落在15個以下時，二個平皿的菌落數(shù)不在0－4，1－7，2－9，3－10，4－12，5－14，6－15范圍內(nèi)；平均菌落在15個以上時，二個平皿菌落數(shù)超過1倍；三級菌落數(shù)不能顯示差別。不能計數(shù)需重新實驗。36第36頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月異常情況處理菌落蔓延1.加TTC（1000ml營養(yǎng)瓊脂加1％的TTC1ml）2.開蓋干燥（倒置斜放1～2h）3.換陶瓦蓋（干熱滅菌的）異常菌落數(shù)報告法

細(xì)菌平皿上長霉菌、霉菌平皿上長細(xì)菌，哪個多，以哪個計數(shù)，不能相加計數(shù)。37第37頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月藥品微生物檢查法的驗證

38第38頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月

●無菌產(chǎn)品無菌檢查方法的驗證●控制菌檢查方法的驗證●細(xì)菌、霉菌、酵母菌計數(shù)方法的驗證39第39頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月●驗證的目的:確認(rèn)所采用的方法適合于供試品的無菌檢查或微生物限度檢查。即確認(rèn)供試品在該檢驗量、該檢驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不計。

●驗證的意義：保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠及檢驗方法的完整性。40第40頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月藥品無菌檢查方法的驗證（1）驗證用菌株：金黃色葡萄球菌、銅綠色假單胞菌、枯草桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉。菌株選擇的原則:代表性,普遍性,易存活、低或非致病性,標(biāo)準(zhǔn)菌株(或該藥品中常見的污染菌)。菌種的要求：不得超過5代。采用適宜的方法保存。加菌量:＜100cfu。41第41頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月藥品無菌檢查方法的驗證（2）驗證方法：直接接種法、薄膜過濾法。結(jié)果判斷：如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，供試品照此檢查法和檢查條件進行供試品的無菌檢查法檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，可采用增加沖洗量，增加培養(yǎng)基的用量，使用中和劑或滅活劑；更換濾膜品種等方法，并重新進行方法驗證。42第42頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月微生物限度檢查的驗證內(nèi)容細(xì)菌、霉菌、酵母菌計數(shù)方法的驗證--準(zhǔn)確性(回收率)控制菌檢查法的驗證--專屬性43第43頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)菌、霉菌、酵母菌計數(shù)方法的驗證⑴驗證用菌株：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草桿菌。菌株選擇的原則:代表性,普遍性,低或非致病性,標(biāo)準(zhǔn)菌株(或該藥品中常見的污染菌)。菌種的要求：不得超過5代。采用適宜的方法保存。加菌量:50～100cfu。44第44頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月計數(shù)方法的驗證-驗證方法⑵驗證時，按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進行。對各試驗菌的回收率應(yīng)逐一進行驗證。驗證試驗至少應(yīng)進行3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。45第45頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月計數(shù)方法的驗證-驗證方法⑶試驗組菌液組稀釋劑對照組供試品對照組46第46頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月試驗組平皿法：取試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml和50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，應(yīng)在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。47第47頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月

稀釋劑對照組:若供試液制備需要分散、乳化，中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應(yīng)增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每1ml供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。菌液組：測定所加的試驗菌數(shù)。供試品對照組：取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。48第48頁，課件共5