流式細(xì)胞檢測課件1

王麗2015-07-07流式細(xì)胞技術(shù)FLOWCYTOMETRYWhatdoesitmean?CYTOCellMeasure(ment)MEASUREMENTOFACELLMETRYFLOWCYTOMETRY：在液流系統(tǒng)中，快速測定單個細(xì)胞或微粒的物理特性和生化特性的方法。FlowCytometer(FCM)–流式細(xì)胞儀FlowSorter–

流式細(xì)胞分選儀2精選pptBDFACSVantageBDCalibur流式細(xì)胞儀BD

流式細(xì)胞儀液流系統(tǒng)

BECKMAN

CytoFLEXMiltenyiMACSQuantGuava5HT微毛細(xì)管細(xì)胞分析儀3精選ppt

流式細(xì)胞儀的組成OpticsElectronicsSoftwareFluidicsWaste4精選ppt樣品規(guī)格：96孔板或1.5mL小管進(jìn)樣準(zhǔn)備5精選ppt工作流程樣本制備熒光染色上樣檢測數(shù)據(jù)分析FluorescenceDetectorHistogramSingleCellSuspensionCellSuspensionFluorescentlyLabelledAntibodyFluorescenceY+BlueLaser(488nm)6精選ppt

液流系統(tǒng)功能：傳送待測樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)。樣本：0.2-150微米的粒子，最快可在1秒種內(nèi)計(jì)測數(shù)萬個細(xì)胞。SheathFluid:~10mL/TestWaste：1L/hrrun10萬—100萬cells/TestNoSheathFluidWaste：<10ml/hrrun2千—1萬cells/Test精選pptVolume=200nlFlowRate=0.1-1ul/second0.1mm20mm50-100mm0.1mmProbeVolume=200plVolume=0.01Volume=0.02Volume=0.03微毛細(xì)管流動池8精選ppt460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50Longpass Shortpass BandpassBP500/50=475nm–525nmLP500=>500nmSP500=<500nm光學(xué)系統(tǒng)FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成。9精選ppteasyCyte5HTsystem激發(fā)光:75mWBlueLaser(488nm)檢測熒光通道：ForwardScatter–FSCSideScatter–SSCGreen–525/30nmYellow–583/26nmRed1–680/30nm10精選ppt功能:量化電壓脈沖將模型信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號熒光補(bǔ)償數(shù)據(jù)傳給電腦以便分析電子器件檢測器

、光電二極管、光電培增管11精選ppt軟件系統(tǒng)12精選pptInCyte開放模塊-Flexibility拖曳式設(shè)門，操作簡單易學(xué)整合多組數(shù)據(jù)多種Plot以供選擇R1R2WorkStationHeat-Map數(shù)據(jù)分析直觀化Min/Maxthreshold分析方式靈活13精選ppt測量參數(shù)光散射強(qiáng)度熒光強(qiáng)度樣本體積細(xì)胞數(shù)目精選ppt前向散射角側(cè)向散射角Incidentlaserlight前向散射角和側(cè)向散射角“大小”成正比例關(guān)系:

截面積大小折射率細(xì)胞形狀雖然也與細(xì)胞的形狀與大小有關(guān)，但是它對細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的，折射率更敏感。FSC:Forwardanglelightscatter區(qū)分細(xì)胞與細(xì)胞碎片SSC:Side-angle(90)lightscatter在細(xì)胞大小相同的情況下，區(qū)分不同的細(xì)胞種類。精選pptScatter–HowitworksSideScatterForwardScatter02004006008001000LaserLightSSCFSCLaserLightFSC粒細(xì)胞SSC淋巴細(xì)胞LaserLightSSCFSC單核細(xì)胞精選ppt熒光——熒光物質(zhì)吸收符合其波長范圍的光能量，內(nèi)部電子受激上升到高能級。然后受激電子迅速衰落回基態(tài)，釋放過剩能量成為光子。激發(fā)光譜——能夠激發(fā)熒光物質(zhì)的波長范圍。發(fā)射光譜——熒光物質(zhì)的發(fā)射波長范圍。因?yàn)楦嗟哪芰肯脑谖辙D(zhuǎn)換而不是熒光轉(zhuǎn)換中，所以發(fā)射光波長要高于激發(fā)光波長。FCM多采用氬離子激光器，因?yàn)?88nm的激光器能夠激發(fā)多種熒光。光源的譜線愈接近被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜的峰值，所產(chǎn)生的熒光信號愈強(qiáng)。熒光信號17精選ppt熒光信號~520nmemission488nmexcitationFITC-labeledantibodybindssurfaceantigen精選ppt熒光染料性能488nmexcitationwavelength(nm)excitation/emission519nmemissionStokesShift精選ppt線性放大——DNA、RNA、總蛋白質(zhì)含量等的檢測。對數(shù)放大——抗原檢測等。熒光信號的面積(FL2－A)——準(zhǔn)確反映DNA的含量。熒光信號的寬度(FL2－W)——常用來區(qū)分雙聯(lián)體細(xì)胞。熒光信號20精選ppt常見熒光素：FITC(異硫氰酸熒光素）：綠色530nmPE（藻紅蛋白）：橙黃色575nmPerCP(多甲藻黃素葉綠素蛋白）：深紅色 675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色620nm APC(別藻蘭蛋白）：紅色660nm抗體的選擇：首選直接標(biāo)記抗體熒光分子強(qiáng)度：APC>PE>PerCP>FITC

PE較強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原

FITC最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原21精選ppt常見熒光物質(zhì)的應(yīng)用PM1(Orange)AddnmPM2(Red)PM3(Green)FluorophoresConjugatedtoanAbPEPE-Cy5FITCDeadCellDyes(DNAstaining)PI7-AADLiveCellDye(DNAStaining)LDS751FluorescentProteinsGFPCellTrackingDyesCFSE精選ppt直方圖和點(diǎn)陣圖直方圖(HistogramPlot)——單參數(shù)分析.X-Axis:熒光信號強(qiáng)度.Y-Axis:細(xì)胞數(shù)目.點(diǎn)陣圖(DotPlot)——雙參數(shù)分析.XandYaxis：兩種熒光信號強(qiáng)度.每個點(diǎn)代表一個細(xì)胞.Log&

Lin:熒光強(qiáng)度的坐標(biāo)可以是線性的，也可以是對數(shù)的.精選ppt直方圖：可根據(jù)單一因素區(qū)分細(xì)胞亞群10e010e110e210e310e4CD20-FITC(GRN-HLog)705335180CountM2M110e010e110e210e310e4CD20-FITC(GRN-HLog)705335180Count70cellseachhaveagreenfluorescenceintensityofabout400Noticethesubpopulation?精選ppt血細(xì)胞分群

（紅細(xì)胞溶解后）點(diǎn)陣圖：根據(jù)多因素區(qū)分細(xì)胞亞群25精選ppt熒光補(bǔ)償光譜重疊的校正：目前使用的熒光染料都是寬波譜，兩兩之間的發(fā)射譜范圍有一定的重疊。為了克服這種誤差，可使用熒光補(bǔ)償電路，設(shè)置合理的熒光信號補(bǔ)償。精選ppt我需要準(zhǔn)備什么？1.Why：為什么進(jìn)行流式細(xì)胞檢測？

流式細(xì)胞技術(shù)是否是最佳的檢測方法？

檢測的原理是什么？

要檢測的物質(zhì)是什么？2.Where：熒光標(biāo)記的物質(zhì)在哪里？

是否需要對細(xì)胞進(jìn)行固定？打孔？3.Which：選擇什么熒光標(biāo)記物？4.How:樣品制備流程，多少個標(biāo)本？（空白對照、陰性對照……）5.When:預(yù)約（175874947群共享下載申請表）

Doit?。ê线m的細(xì)胞密度并避免細(xì)胞結(jié)團(tuán)）27精選ppt應(yīng)用范圍細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)和活力分析細(xì)胞增殖細(xì)胞周期細(xì)胞凋亡細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)抗原定量檢測線粒體膜電位檢測……28精選ppt實(shí)驗(yàn)對照的設(shè)計(jì)空白對照ALL

：采用不標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行平行測定，用于確定待測標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值或檢測染色方法是否成功。陰性對照：調(diào)節(jié)各熒光探測器合適的放大倍數(shù)，即確定待測標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值。常用同型對照（與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同亞型的免疫球蛋白），用于消除抗體與細(xì)胞非特異性結(jié)合產(chǎn)生的背景。陽性對照：用已知表達(dá)某種抗原的細(xì)胞（陽性細(xì)胞）進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，通常用于檢測抗體是否正?；虼_定實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。補(bǔ)償對照：多色分析時，將用于多色標(biāo)記的各種熒光抗體分別與樣本進(jìn)行單色標(biāo)記，以測定熒光信號的光譜重疊情況以進(jìn)行調(diào)節(jié)。單色分析：設(shè)同型抗體對照多色分析：同型對照，補(bǔ)償對照29精選ppt細(xì)胞周期：從一次分裂完成時開始，到下一次分裂完成時為止，為一個細(xì)胞周期。（細(xì)胞內(nèi)的DNA含量隨細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生周期性變化。）DNA含量：

G1（DNA合成前期，2C）、分裂間期S（DNA合成期，2C-4C）、G2（DNA合成后期，4C）分裂期——M期（DNA為4C）。利用核酸標(biāo)記的方法，通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞內(nèi)DNA的相對含量進(jìn)行測定，可分析細(xì)胞周期各時相的百分比。但是分裂期（M期）的前期、中期、后期、末期四個時期，普通流式無法進(jìn)行定量檢測。1.DNA細(xì)胞周期分析應(yīng)用實(shí)例30精選ppt1.DNA細(xì)胞周期分析31精選ppt實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)：1、細(xì)胞周期固定：加200ul細(xì)胞（貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞需要先用胰酶消化）到1.5ml離心管中→300×g轉(zhuǎn)速離心5min，并用1×PBS清洗一次→離心去上清→添加300ulPBS溶解沉淀細(xì)胞→緩慢加入－20℃預(yù)冷的100%乙醇700ul固定細(xì)胞（固定過程中需要邊滴加乙醇，邊震蕩，不要產(chǎn)生細(xì)胞聚團(tuán)，否則會嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果）→最后乙醇終濃度為70%→－20℃孵育至少3小時（建議4℃孵育過夜，效果會更好）。2、將固定好的細(xì)胞300×g轉(zhuǎn)速離心5min，并用1×PBS清洗一次。將細(xì)胞用200ul的Guava細(xì)胞周期試劑重新懸浮，室溫孵育30min，注意避光。3、用200目細(xì)胞篩過濾細(xì)胞（如果使用PI染色必須過濾），顯微鏡下細(xì)胞無結(jié)團(tuán)，Guava流式細(xì)胞儀檢測。1.DNA細(xì)胞周期分析32精選ppt2.早期細(xì)胞凋亡檢測33精選ppt2.早期細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果正常細(xì)胞：AnnexinV(-)/7-AAD(-)早期凋亡細(xì)胞：AnnexinV(+)/7-AAD(-)晚期凋亡細(xì)胞：AnnexinV(+)/7-AAD(+)CD95/FASL刺激誘導(dǎo)凋亡34精選ppt實(shí)驗(yàn)步驟

1.樣本準(zhǔn)備(貼壁細(xì)胞)：棄去培養(yǎng)細(xì)胞(對數(shù)生長期)中的舊培養(yǎng)液，加入胰酶消化細(xì)胞，。收集舊培養(yǎng)基，通過離心獲得凋亡或死亡細(xì)胞，與之后消化后的細(xì)胞混合，再檢測。2.細(xì)胞染色：在96-well微孔板相應(yīng)的孔中加入100ulGuavaNexin（貨號：4500-0450）和100ul準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液，室溫避光孵育20min；盡快用流式細(xì)胞儀獲取結(jié)果（1h內(nèi)）。流式細(xì)胞儀檢測獲取數(shù)據(jù)。注意：實(shí)驗(yàn)最好包括實(shí)驗(yàn)組、陰性對照和陽性對照（凋亡誘導(dǎo)組）。2.早期細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果35精選ppt細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡是動態(tài)事件，在不同時期展現(xiàn)不同的凋亡信號。早期——磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）暴露在細(xì)胞膜上，與PS結(jié)合的AnnexinV成為檢測凋亡早期的最常用指標(biāo)。除此之外，線粒體膜電位變化和細(xì)胞色素C的釋放