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文檔簡介
酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)一、基本原理
將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面,使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行,用洗滌的方法將固相上的抗原抗體復(fù)合物與液相中的游離成分分開。加入酶的底物后,通過酶對底物催化的顯色反應(yīng)程度,對標本中抗原或抗體進行定性或定量分析。二、ELISA的方法類型(六種)(一)雙抗體夾心法檢測抗原
將己知抗體包被固相載體,待檢標本中的相應(yīng)抗原與固相表面的抗體結(jié)合,洗滌去除未結(jié)合成分。然后再與抗原特異的酶標抗體結(jié)合,形成固相抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物,根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗原的含量。1.原理E固相抗體標本(含抗原)酶標抗體EE底物雙抗體夾心法檢測抗原(1)將特異性抗體包被于固相反應(yīng)板上,洗滌。(2)加待檢標本,溫育,洗滌。(3)加酶標抗體,洗滌。(4)加底物,根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行該抗原的定性或定量。2.技術(shù)要點(+)1、已知抗體包被載體3、加酶標抗體4、加酶作用的底物顯色2、加待檢抗原4、加酶作用的底物不顯色洗滌洗滌洗滌洗滌1、已知抗體包被載體2、加待檢物(無抗原)3、加酶標抗體(-)YYYYYYEYEYEYYYYYYYYYYEYEYEYYYYYYYEYEYEYYYY洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原
雙抗體夾心法中,應(yīng)注意類風濕因子(RF)的干擾。如果待檢標本中含有RF,可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果。使用抗體的F(ab’)2或Fab片段作為酶標抗體可消除RF的干擾。3.注意事項(二)雙位點一步法檢測抗原
即在雙抗體夾心法基礎(chǔ)上使用針對抗原分子上兩個不同表位的單克隆抗體,分別作為固相抗體和酶標抗體。測定時將待檢標本和酶標抗體同時加入進行反應(yīng),兩種抗體互不干擾,經(jīng)一次溫育和洗滌后,即可加入底物進行顯色測定。1.原理EEE底物固相抗體標本(含抗原)酶標抗體雙位點一步法檢測抗原3.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗原和酶標抗體洗滌1.已知抗體包被載體YYYYEYYEYYYEYYEYY(+)3.加酶作用的底物不顯色2.加待檢物(無抗原)和酶標抗體洗滌1.已知抗體包被載體YYYYEYYEYY(-)YYY洗滌洗滌雙位點一步法測抗原
如果待檢標本中抗原濃度過高,容易形成“鉤狀效應(yīng)(hookeffect)”。鉤狀效應(yīng)嚴重時,可出現(xiàn)假陰性結(jié)果,必要時可將待檢標本適當稀釋后重新測定。2.注意事項(三)間接法檢測抗體
將已知抗原吸附于固相載體上,待檢標本中相應(yīng)抗體與之結(jié)合,形成固相抗原-抗體復(fù)合物,再用酶標二抗與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合,形成固相抗原-抗體-酶標二抗復(fù)合物,根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。1.原理
固相抗原標本(含抗體)酶標二抗底物EEE間接法檢測抗體(1)將特異性抗原包被于固相反應(yīng)板上,洗滌。(2)加稀釋的受檢血清,洗滌。(3)加酶標二抗,洗滌。(4)加底物顯色,顏色深度代表標本中待檢抗體的量。
2.技術(shù)要點4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包被載體(+)YYY3.加酶標二抗洗滌YYYYEYEYEYYYYEYEYE4.加酶作用的底物不顯色2.加待檢物(無抗體)洗滌1.已知抗原包被載體(-)3.加酶標二抗洗滌YEYEYE洗滌洗滌間接法測抗體
由于此法易受血清中高濃度非特異性IgG的干擾,通常要將待測標本進行一定稀釋后才能測定。3.注意事項(四)競爭法
酶標抗原和待檢抗原對固相特異性抗體具有相同的結(jié)合力,二者競爭結(jié)合固相特異性抗體。免疫反應(yīng)后,結(jié)合于固相的酶標抗原量與標本中待檢抗原含量呈反比。待檢抗原量越多,酶標抗原與固相抗體結(jié)合越少,底物顯色反應(yīng)越淺;反之則顯色越深,即底物顯色與待檢標本中抗原含量呈反比。
1.競爭法檢測抗原原理酶標抗原EEEE固相抗體標本(含抗原)底物E競爭法檢測抗原(1)將特異性抗體包被于固相反應(yīng)板上,洗滌。(2)待測管中加待檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液,待檢標本中如果含有抗原,則與酶標抗原競爭固結(jié)合相抗體,使酶標抗原與固相載體的結(jié)合量減少。對照管中只加酶標抗原,溫育,洗滌。(3)加底物顯色。對照管中顏色深,待測管顏色越淡,表示標本中抗原含量越多。技術(shù)要點3.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗原和酶標抗原洗滌1.已知抗體包被載體YYYYYY(+)EYYYE3.加酶作用的底物顯色2.加待檢物(無抗原)和酶標抗原洗滌1.已知抗體包被于載體表面YYYYYY(-)EYYYEEEEEEE洗滌洗滌競爭法測抗原
抗體的測定一般不使用競爭法。當抗原雜質(zhì)難以去除,不易得到足夠的純化抗原或抗原的性質(zhì)不穩(wěn)定時,可采用這種方法測定抗體。如HBcAb和HBeAb的檢測,由于e抗原較核心抗原僅多29個氨基酸,e抗原很容易轉(zhuǎn)變?yōu)楹诵目乖?,因此HBcAb和HBeAb的測定均采用競爭法,但模式有所不同。2.競爭法檢測抗體(1)競爭法檢測HBcAb:①將HBcAg包被于固相反應(yīng)板上,洗滌。②加入待檢標本和酶標特異性抗體,溫育,洗滌。③加入底物,溫育,形成有色產(chǎn)物,用酶標比色儀測定結(jié)果。顯色深淺與待檢標本中相應(yīng)抗體含量成反比。技術(shù)要點固相抗原標本(含抗體)底物酶標抗體EEEEE競爭法檢測HBcAb3.加酶作用的底物顯色3.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體和酶標抗體洗滌1.已知HBcAg包被載體(+)YYYEYYYE2.加待檢物(無抗體)和酶標抗體洗滌1.已知HBcAg包被載體(-)YYYEYYYEEEEEYE洗滌洗滌競爭法檢測HBcAb(2)競爭法檢測HBeAb:①將HBeAb包被于固相反應(yīng)板上,洗滌。②加入待檢標本和HBeAg,溫育,洗滌。③加入酶標HBeAb,溫育,洗滌。④加入底物,溫育,形成有色產(chǎn)物,用酶標比色儀測定結(jié)果。顯色深淺與待檢標本中相應(yīng)抗體含量成反比。固相抗體標本(含抗體)抗原酶標抗體底物EEE競爭法檢測HBeAb(+)(-)4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體和HBeAg洗滌1.已知HBeAb包被載體YYYYYYYYYYYYY3.加酶標HBeAb洗滌YEYEYYYYYYE4.加酶作用的底物顯色2.加待檢物(無抗體)和HBeAg洗滌1.已知HBeAb包被載體YYYYYYYYY3.加酶標HBeAb洗滌YEYEYYYYEYEYEYE洗滌洗滌競爭法檢測HBeAb(五)捕獲法檢測IgM抗體
將抗人IgM抗體吸附于固相載體上,待檢標本中的IgM類抗體多被固相抗體捕獲。加入特異抗原與固相抗體捕獲的IgM類抗體結(jié)合,再加入抗原特異的酶標抗體,形成固相抗人IgM-IgM-抗原-酶標抗體復(fù)合物。最后根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢IgM抗體的含量。1.原理(1)將抗人IgMμ鏈抗體包被于固相反應(yīng)板上,洗滌。(2)加人待檢標本,溫育,洗滌。(3)加入特異性抗原,溫育,洗滌。(4)加入抗原特異的酶標抗體,溫育,洗滌。(5)加入底物,溫育一定時間,顯色,用酶標比色儀測定結(jié)果。2.技術(shù)要點固相抗人lgM抗體E標本(含抗體)抗原底物EE固相捕獲法檢測lgM抗體5.加酶作用的底物不顯色5.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體(IgM)洗滌1.已知抗人IgM抗體包被載體YYYYYYYYYYYY4.加酶標抗體洗滌EYE3.加入特異性抗原洗滌YYYYYYYYYYEYYYYYYEYY2.加待檢物(無特異性IgM)洗滌1.已知抗人IgM抗體包被載體YYYYYYYYYY4.加酶標抗體洗滌EYE3.加入特異性抗原洗滌YYYYYYYYYY(+)(-)洗滌洗滌捕獲法
采用固相捕獲法檢測IgM類抗體時要注意的是RF(IgM類)及其它非特異IgM的干擾。RF(IgM類)能與固相抗人μ鏈抗體結(jié)合,并可與隨后加入的酶標抗體(動物IgG)反應(yīng),從而導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。
3.注意事項
非特異IgM由于其在第一步溫育中,可與特異IgM競爭與固相抗體結(jié)合,所以會影響測定的靈敏度。因此,使用本法測IgM,必須對臨床樣本進行適當稀釋。(六)雙抗原夾心法檢測抗體
將已知抗原包被固相載體,待檢標本中的相應(yīng)抗體可分別與固相表面的抗原、酶標抗原結(jié)合,形成固相抗原-抗體-酶標抗原復(fù)合物,根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。同雙抗體夾心法。1.原理2.技術(shù)要點E固相抗體標本(含抗體)酶標抗原底物EE雙抗原夾心法檢測抗體4.加酶作用的底物不顯色(+)(-)4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包被載體3.加酶標抗原洗滌YEYYYYEYEYEYEYE2.加待檢物(無抗體)洗滌1.已知抗原包被載體3.加酶標抗原洗滌EEE洗滌洗滌雙抗原夾心法測抗體ELISA的技術(shù)要點包括三個方面:反應(yīng)所需各種試劑的制備、反應(yīng)條件的選擇和操作的標準化。三、ELISA的關(guān)鍵技術(shù)酶標記的抗原和抗體固相的抗原或抗體標記酶作用的底物(一)試劑的制備1.抗原和抗體天然抗原和人工抗原多克隆抗體和單克隆抗體2.酶標結(jié)合物的制備:戊二醛交聯(lián)法或改良過碘酸鈉法3.包被與封閉包被:Ph9.6的碳酸鹽緩沖液,4-8℃過夜或37℃2小時封閉:1%-5%牛血清白蛋白或10%小牛血清(二)最適工作濃度的選擇(1)用100ng/ml人IgG進行包被,洗滌。(2)將酶標抗人IgG用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中,溫育,洗滌。(3)加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后,讀取吸光度(A)值在1.0時的酶標抗體稀釋度,作為酶標抗體的工作濃度。1.酶標抗抗體工作濃度的選擇
在ELISA測定中應(yīng)對包被抗原或抗體的濃度和酶標抗原或抗體的濃度予以選擇以達到最佳的測定條件以間接法測抗體為例(1)用包被液將抗原作一系列稀釋后包被,洗滌。(2)將強陽性參考血清、弱陽性參考血清和陰性參考血清用稀釋液作1:100稀釋,加樣,溫育,洗滌。(3)加按工作濃度稀釋的酶標抗人IgG抗體,溫育,洗滌。2.棋盤滴定法選擇包被抗原工作濃度
(4)加底物顯色,加酸終止反應(yīng)后讀取A值。(5)選擇強陽性參考血清的A值為0.8左右,陰性參考血清的A值小于0.1的包被抗原的稀釋度作為工作濃度。參考血清各抗原稀釋度的吸光度值(A)1:501:1001:2001:4001:800強陽性1.201.040.840.680.42弱陽性0.640.410.300.220.19陰性0.230.130.080.660.05稀釋液0.090.020.020.020.04間接ELISA法包被抗原最適工作濃度的選擇1.加樣
應(yīng)力求準確,并注意不可濺出和產(chǎn)生氣泡。2.溫育
注意反應(yīng)的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定的要求,整塊反應(yīng)板的溫度應(yīng)一致,以防止“邊緣效應(yīng)”。3.洗滌
手工洗板是在每次溫育后,將反應(yīng)液吸出或甩干,然后用緩沖液洗滌2或3次,拍干。使用洗板機洗滌次數(shù)要適當增加。(三)測定方法的標準化4.顯色根據(jù)試劑盒說明操作即可。5.比色要注意波長的選擇。操作中應(yīng)注意避免出現(xiàn)濾光片錯用的問題。四、評價與應(yīng)用
應(yīng)用1.病原體及其抗體測定廣泛應(yīng)用于傳染病的診斷。2.激素測定
如T3、
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