血型檢測技術 白細胞抗原系統(tǒng)檢測技術

臨床輸血檢驗技術白細胞抗原系統(tǒng)檢測技術學習目標1.什么是HLA？HLA等位基因的命名應遵循哪些原則？HLA-Ⅰ類、Ⅱ類及Ⅲ類基因的結構怎樣？2.掌握PCR-SSP檢測方法的基本原理、特點及其適應范圍；掌握HLA分型在移植醫(yī)學、輸血醫(yī)這和法醫(yī)學中的應用3.

熟悉HLA血清學分型試驗及淋細胞毒交叉配合試驗的原理及質量控制HLA復合體HLA復合體的遺傳特點單體型遺傳

多態(tài)性遺傳共顯性遺傳復等位基因連鎖不平衡（linkagedisequilibrium）基因頻率連鎖不平衡現(xiàn)象的可能原因HLA復合體HLA-I類基因位于6號染色頂端經(jīng)典HLA-I類基因：包括A、B、C三個基因座位，編碼三組高免疫性、高度多態(tài)性的HLA-A、HLA-B、HLA-C糖蛋白分子。非經(jīng)典HLA-I類基因：免疫功能關基因，包括E、F、G、H、J基因座位，編碼免疫性和多態(tài)性均較低的分子HLA復合體HLA-II類基因位于6號染色著絲點經(jīng)典HLA-II類基因（DP、DQ、DR）編碼HLA-II類分子；非經(jīng)典的HLA-II類基因（LMP、TAP、DM）為與抗原加工和遞呈有關的基因。HLA復合體HLA-III類基因位于II類和I類基因中段經(jīng)典HLA-III類基因編碼產(chǎn)生C4、C2、B因子等HLA復合體HLA等位基因命名HLA-A*02：101：01：02N連字符基因座位分隔符基因組字段分隔符特異性HLA蛋白編碼區(qū)DNA同義突變非編碼區(qū)DNA差異指示表達發(fā)生變化HLA復合體按基因位點的產(chǎn)物分別命名抗原特異性用基因位點后的數(shù)字表示由細胞學技術及淋巴細胞試驗確定的特異性的表示HLA抗原裂解后寬特異性的表示抗原特異性及基因位點之間的表示HLA分子組織分布HLA分子HLA分子分布HLA-Ⅰ類分子廣泛分布在所有有核細胞表面HLA-Ⅱ類分子主要表達在如樹突狀細胞、巨噬細胞、B淋巴細胞等細胞表面HLA分子也分布在血、尿、唾液及精液中檢出HLA分子淋細胞毒交叉配合試驗HLA血清學分型試驗+補體臺盼藍染液抗原與抗體結合當特異性抗體與待檢淋巴細胞表面HLA分子結合后，激活補體，使細胞膜通透性增加或細胞死亡，加入染料后在顯微鏡下可見結合補體的細胞被活性染料著色。分離淋巴細胞HLA血清學分型試驗待檢淋巴細胞懸液靜置30-40分鐘兔補體靜置60-70分鐘5%伊紅死細胞體積大，著黑色，無折光性；活細胞大小正常，未著色，折光性強，較透亮；微量淋巴細胞毒試驗HLA血清學分型試驗質量控制HLA抗原抗體最好選用單克隆抗血清抗體效價適宜存在劑量效應淋巴細胞要求活性和純度高濃度為2～4×106/mL病理狀態(tài)下HLA可能會表達異常孵育溫度和時間嚴格掌握孵育時間最適溫度為20-25℃其他補體染液應進行預試驗；用甲醛固定設置陽性和陰性對照HLA血清學分型試驗原理PCR—序列特異引物法編碼HLA的基因具有高度的多態(tài)性，每一個基因座位上有眾多的復等位基因，而每一個等位基因都有其各自的DNA序列，因此可用相應的序列特異性引物（sequencespecificprimers，SSP）進行擴增。通過控制PCR反應條件，特異性引物僅擴增與其相應的等位基因，而不擴增其他的等位基因。檢測材料PCR—序列特異引物法——以B27檢測為例

1、血樣：0.2mlEDTA抗凝血

2、紅細胞裂解液

3、白細胞裂解液

4、PCR混合液PCRbufferHLA-B27SSPTaqdNTPinternalpositivereferenceprimersetc操作流程一、DNA的提取1、取1ml紅細胞裂解液入血樣管中混勻，裂解紅細胞;2、離心4000rpm2min;3、重復步驟1-2兩次，最后用棉簽吸干管壁液體；4、取50ul白細胞裂解液入上述白細胞管中混勻；5、將白細胞管于60℃水浴消化20min；6、取出白細胞管再于100℃，3-5min，滅活蛋白酶K；7、離心10000rpm2min。上清即為富含DNA的PCR模板。PCR—序列特異引物法——以B27檢測為例操作流程PCR擴增1、吸2ul模板DNA入裝有PCR混合液的小管中；2、將小管置于PCR儀內(nèi)進行擴增。（需80min）

×12×2394oC2min

94oC12sec

65oC1min94oC12sec61oC50sec72oC30sec

37oC10sec

HLA-B27擴增程序PCR—序列特異引物法——以B27檢測為例擴增產(chǎn)物電泳PCR—序列特異引物法——以B27檢測為例擴增產(chǎn)物電泳制膠使用電泳緩沖液在制膠器上配制1.0%的瓊脂糖凝膠?；鞓?μL載樣緩沖液、2μL核酸熒光染料，10μLPCR產(chǎn)物混勻。點樣將上步混好的樣10μL加到凝膠孔中。電泳90V電壓下電泳10~20min。PCR—序列特異引物法——以B27檢測為例結果觀察HLA-B27(+)標本電泳結果觀察

PCR—序列特異引物法——以B27檢測為例試劑操作：提取DNA最后一步，乙醇要揮發(fā)干凈防止PCR污染質量控制PCR—序列特異引物法——以B27檢測為例方法學評價方法評價PCR-SSP該方法操作簡單、快速，耗時較短，結果判斷簡便，但可能出現(xiàn)漏孔或假性條帶現(xiàn)象，為實驗室最常用方法之一。PCR-SSOP操作較復雜，耗時較長，結果較準確，部分探針易出現(xiàn)干擾。目前被Luminex檢測技術所替代。Luminex檢測技術靈敏度高，操作簡便，快速，結果較準確，是目前實驗室中最常用的方法之一。PCR-SBT能夠直接檢測基因的核苷酸序列，屬于高分辨方法，結果準確性最高，但需要特殊的儀器設備，耗時較長，成本較高。基因芯片技術具有超高速、高通量、低成本和高效益等優(yōu)點，但分型可能存在一定的偏差。PCR—序列特異引物法——以B27檢測為例白細胞抗原系統(tǒng)檢測的臨床應用在移植醫(yī)學中的應用造血干細胞移植HLA相合同胞（ＭＲＤ）ＨＬＡ相合非血緣（MUD）單倍體臍體器官移植HLA－AHLA-BHLA-DR白細胞抗原系統(tǒng)檢測的臨床應用在輸血醫(yī)學中的應用HLA與非溶血性輸血反應

(1)臨床輸血中發(fā)熱性非溶血性輸血反應多數(shù)是由于HLA抗體破壞白細胞后釋放出熱源物質引起；

(2)表現(xiàn)為頭暈、面紅、惡心、寒戰(zhàn)，體溫可高達39℃以上，嚴重者可并發(fā)肺部綜合征，呼吸困難；

(3)采用白細胞濾器過濾后的血液輸注，非溶血性輸血反應明顯減少。白細胞抗原系統(tǒng)檢測的臨床應用在輸血醫(yī)學中的應用HLA與血小板輸注

(1)30％的HLA抗體陽性者對隨機獻血者的血小板輸注無效；

(2)在血小板輸注中HLA抗體的產(chǎn)生很少由血小板引起，多數(shù)由血小板血液中的白細胞引起；

(3)輸血小板進行治療時，最好測定HLA-A、B抗原，防止由于患者產(chǎn)生針對血小板膜HLA抗原的抗體。白細胞抗原系統(tǒng)檢測的臨床應用在法醫(yī)學中的應用HLA與親子鑒定

(1)由于HLA復合體的高度多態(tài)性，在無關個體間HLA表型全相同的機率極低，故HLA復合體被看作是