冷凍電鏡技術知識分享課件

冷凍電鏡技術Cryo-EM學號201912708冷凍電鏡技術學號2019127081目錄CONTENTS1冷凍電鏡技術的概述什么是Cryo-EM、冷凍電鏡的分類2冷凍電鏡技術的發(fā)展1968—→Now3冷凍電鏡技術的原理樣品冷凍、冷凍成像、三維重構4冷凍電鏡技術的應用結構生物學、醫(yī)療、具體應用場景目CONTENTS1冷凍電鏡技術的概述什么是Cryo-EM、2PART1冷凍電鏡技術的概述PART1冷凍電鏡技術的概述31

冷凍電鏡技術的概述冷凍電鏡即冷凍電子顯微鏡(cryo-electronmicroscopy，cryo-EM)，是將生物大分子快速冷凍后，在低溫環(huán)境下利用透射電子顯微鏡對樣品進行成像，再經(jīng)圖像處理和重構計算獲得樣品的三維結構。什么是Cryo-EM1冷凍電鏡技術的概述冷凍電鏡即冷凍電子顯微鏡(cry41

冷凍電鏡技術的概述看清楚分子級別的結構必須用電子顯微鏡1冷凍電鏡技術的概述看清楚分子級別的結構必須用電子顯微鏡51

冷凍電鏡技術的概述理論上電子劑量越高，成像質(zhì)量越好然而生物分子太脆弱，無法承受法承受高劑量電子的沖擊1冷凍電鏡技術的概述理論上電子劑量越高，成像質(zhì)量越好61

冷凍電鏡技術的概述用低劑量的電子束配合疊加平均的辦法解析生物分子結構的方法成功拍照但要求分子在樣品中整齊排列，這個方法普適性比較有限1冷凍電鏡技術的概述用低劑量的電子束配合疊加平均的辦法解71

冷凍電鏡技術的概述通過給成千上萬個隨機朝向的同一種生物分子照相，得到不同角度的二維圖像后再運用計算機軟件進行三維重建，得到分子的完整三維結構1冷凍電鏡技術的概述通過給成千上萬個隨機朝向的同一種生物81

冷凍電鏡技術的概述使生物分子能夠快速冷凍在玻璃態(tài)的水中來減輕對分子的破壞電鏡底下觀察可以得到高分辨率的照片1冷凍電鏡技術的概述使生物分子能夠快速冷凍在玻璃態(tài)的水中9冷凍透射電子顯微鏡（Cryo-TEM）冷凍透射電鏡技術是在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍裝置，將樣品冷卻到液氮溫度(77K),用于觀測蛋白、生物切片等對溫度敏感樣品的一種技術。通過對樣品的冷凍，可以降低電子束對樣品的損傷，減小樣品的形變，從而得到更加真實的樣品形貌。冷凍掃描電子顯微鏡（Cryo-SEM）冷凍掃描電鏡技術一般是在普通掃描電鏡上加裝低溫冷凍傳輸系統(tǒng)和冷凍樣品臺裝置，它是在掃描電鏡的基礎上發(fā)展起來的一種技術，可以直接觀察液體、半液體的樣品，不需要對樣品進行干燥處理，最大程度地減少了常規(guī)的干燥過程對高度含水樣品的影響。冷凍蝕刻電子顯微鏡（Freeze-etching）冷凍蝕刻電鏡技術是一種將斷裂和復型相結合的制備透射電鏡樣品技術，可以顯示細胞、組織微細結構的立體構像。它具有使微細結構接近于活體狀態(tài)、能夠觀察到不同劈裂面的微細結構、能使樣品具有很強的立體感且能耐受電子束轟擊和長期保存等優(yōu)點。冷凍電鏡的分類1

冷凍電鏡技術的概述冷凍透射電子顯微鏡（Cryo-TEM）冷凍透射電鏡技術是在普10冷凍蝕刻電子顯微鏡原理是將樣品置于干冰或液氮中進行冰凍，用冷刀劈開后，在真空中將溫度回升到-100℃，使斷裂面的冰升華，暴露出斷面結構，最終得到可以觀察的復膜樣品通過冷凍，可使其微細結構接近于活體狀態(tài)樣品經(jīng)冷凍斷裂蝕刻后，能夠觀察到不同劈裂面的微細結構，進而可研究細胞內(nèi)的膜性結構及內(nèi)含物結構冷凍蝕刻的樣品，可以經(jīng)鉑、碳噴鍍而制備的復型膜，具有很強的立體感且能耐受電子束轟擊和長期保存1

冷凍電鏡技術的概述紅細胞冷凍電鏡蝕刻圖冷凍蝕刻電子顯微鏡1冷凍電鏡技術的概述紅細胞冷凍電鏡蝕刻11PART2冷凍電鏡技術的發(fā)展PART2冷凍電鏡技術的發(fā)展12197419681975AaronKlug開創(chuàng)了基于負染的噬菌體病毒的電鏡三維重構技術RobertGlaeser首次提出并進行了冷凍含水生物樣品的電鏡成像。RichardHenderson利用電子顯微三維重構技術首次獲得7埃分辨率的細菌視紫紅質(zhì)3D結構的歷史性突破冷凍電鏡技術的發(fā)展21981JoachimFrank完成了單顆粒三維重構算法及軟件Spider。1982JacquesDubochet開發(fā)出真正成熟可用的快速投入冷凍制樣技術制作的不形成冰晶體的玻璃態(tài)冰包埋樣品1990年RichardHenderson利用冷凍電鏡技術獲得了細菌視紫紅質(zhì)蛋白原子水平的三維結構模型，第一個用冷凍電鏡解析出來的膜蛋白結構。2013冷凍電鏡三維重構技術確定蛋白質(zhì)TRPV1結構，標志著冷凍電鏡跨入“原子分辨率”時代197419681975AaronKlug開創(chuàng)了基于負染的13冷凍電鏡技術的發(fā)展21975年，RichardHenderson（理查德·亨德森）利用電子顯微三維重構技術首次獲得7埃分辨率的細菌視紫紅質(zhì)3D結構的歷史性突破。這是人們首次觀測到膜蛋白的跨膜螺旋三維結構。亨德森將未脫離細胞膜的細菌視紫紅質(zhì)直接放置在電子顯微鏡下進行觀察，借助表面覆蓋的葡萄糖防止真空干涸，并采用強度更低的電子束流，得出細菌視紫紅質(zhì)在細胞膜上是規(guī)整排列且朝向一致。之后，在前述AronKlug等人提出的三維重構技術的基礎上，亨德森和同事獲得了細菌視紫紅質(zhì)較為粗糙的三維立體結構圖像。亨德森所發(fā)展出來的方法也具有其局限性，這是因為他所研究的蛋白本身的特性讓研究者能夠采用所謂“冷凍電子斷層成像術”來測定其結構。簡單來說，研究人員要轉(zhuǎn)動細胞膜，從不同角度對蛋白拍照，最終構建出蛋白的三維結構。這種方法只適用于排列有一定規(guī)律的蛋白——如果它們是雜亂無章的，這種方法就難以奏效了。細菌視紫紅質(zhì)3D結構冷凍電鏡技術的發(fā)展21975年，Richa14冷凍電鏡技術的發(fā)展21981年，JoachimFrank（約阿希姆·弗蘭克）完成了單顆粒三維重構算法及軟件Spider，利用計算機識別圖像把相同蛋白質(zhì)的不同影子收集起來，并且將輪廓相似的圖像進行分類對比，通過分析不同的重復模式將圖片擬合成更加清晰的2D圖像。在此基礎上，通過數(shù)學方法，在同一種蛋白質(zhì)的不同2D圖像之間建立聯(lián)系，以此為基礎擬合出3D結構圖像。單顆粒三維重構算法對于實現(xiàn)無需結晶的蛋白質(zhì)三維結構解析至關重要，弗蘭克的圖形擬合程序被認為是冷凍電鏡發(fā)展的基石。冷凍電鏡單顆粒三維重構算法冷凍電鏡技術的發(fā)展21981年，Joach15樣品冷凍技術在1980年代初，JacquesDubochet（雅克·迪波什）用液態(tài)乙烷代替液氮將含水生物樣品冷卻，成功將水玻璃態(tài)化，（玻璃態(tài)的水和冰不一樣，它無固定的形狀，不存在晶體結構，與固態(tài)相比，它更像一種極端黏滯、呈現(xiàn)固態(tài)的液體，體積不會像冰一樣膨脹。）在生物樣本周圍以液態(tài)形式固化，使生物分子即使在真空中也能維持天然形態(tài)。1982年，他領導的小組開發(fā)出真正成熟可用的快速投入冷凍制樣技術制作不形成冰晶體的玻璃態(tài)冰包埋樣品，隨著冷臺技術的開發(fā)，冷凍電鏡技術正式推廣開來。并于1984年用玻璃化方法得到了第一張被水包圍著的病毒圖像。時至今日，冷凍電鏡領域的研究者仍然應用該方法來制備樣品。冷凍電鏡技術的發(fā)展2迪波什1975亨德森用葡萄糖保護（不能普遍使用）1982迪波什對生物樣品進行玻璃化冷凍電鏡樣品制備問題的解決為冷凍電鏡技術的發(fā)展提供了先決條件樣品冷凍技術冷凍電鏡技術的發(fā)展2迪波什1916冷凍電鏡技術的發(fā)展2原子級分辨率的細菌視紫紅質(zhì)蛋白的三維結構模型1990年，亨德森發(fā)表了利用冷凍電鏡技術獲得了細菌視紫紅質(zhì)蛋白原子水平的三維結構模型，這是第一個用冷凍電鏡解析出來的膜蛋白結構。他的研究證實了用冷凍電鏡技術可以確定分子蛋白的近原子分辨率的三維結構，被視作冷凍電鏡發(fā)展史上的里程碑。冷凍電鏡技術的發(fā)展2原子級分辨率的細菌視紫17冷凍電鏡技術的發(fā)展2冷凍電鏡跨入“原子分辨率”時代2012－2013年間，電子直接探測相機(electrondirectdetectiondevice，DDD)的應用，使冷凍電鏡技術突破了技術瓶頸，如虎添翼。DDD相機可以直接探測到高能電子，使信噪比和空間分辨率有了飛躍性的提高。并在2013年，研究者們終于獲得了理想的原子級別成像，用以制作生物分子的三維結構圖像。冷凍電鏡技術的發(fā)展2冷凍電鏡跨入“原子分辨18冷凍電鏡技術的發(fā)展22013年加州大學舊金山分校（UCSF）程亦凡和DavidJulius的研究組首次得到膜蛋白TRPV1的3.4?近原子級別的高分辨率三維結構（Nature上）。TRPV1蛋白的三維結構一種控制晝夜節(jié)律的蛋白質(zhì)復合體（2017年諾貝爾生理及醫(yī)學獎）自2015年確診第一例以來，全球范圍內(nèi)超過150萬人被感染寨卡（Zika）病毒一種可感知耳中壓力變化、使人聽到聲音的蛋白質(zhì)冷凍電鏡的發(fā)展就像是一場猛烈的革命這項技術將生物化學帶入一個嶄新時代冷凍電鏡技術的發(fā)展22013年加州大學舊金19冷凍電鏡技術的發(fā)展2TheNobelPrizeinChemistry2017JacquesDubochetJoachimFrankRichardHenderson

"fordevelopingcryo-electronmicroscopyforthehigh-resolutionstructuredeterminationofbiomoleculesinsolution".冷凍電鏡技術的發(fā)展2TheNobelP20PART3冷凍電鏡技術的原理PART3冷凍電鏡技術的原理213

冷凍電鏡技術的原理

樣品冷凍

冷凍成像

三維重構3冷凍電鏡技術的原理22樣品冷凍的目標是在低溫下使液態(tài)樣品中的水不結晶而呈玻璃態(tài)，這樣既能將樣品在液相的狀態(tài)固定，又避免了水結晶引起樣品結構的破壞。因此，冷凍固定的關鍵是要阻止冰晶形成，冷凍固定是否成功，取決于冷凍過程迅速通過一個溫度范圍，即水開始結晶的溫度到開始重結晶的溫度區(qū)間，此區(qū)間受環(huán)境壓力、樣品濃度等因素的影響。常壓下的純水，從273K開始結晶，因考慮到過冷水的作用，所以從231K開始結晶，當溫度低于重結晶溫度165K（-108℃）時，結晶過程停止。要使水變?yōu)椴ＡB(tài)，必須急速冷卻到165K。樣品冷凍原理及操作過程3

冷凍電鏡技術的原理樣品冷凍的目標是在低溫下使液態(tài)樣品中的水不結晶而呈玻璃態(tài)，這23冷凍成像技術冷凍電鏡成像前冷凍的樣品要通過專門的設備——冷凍輸送器轉(zhuǎn)移到電鏡的樣品室。在成像照相之前，必須觀察樣品中的水是否處于玻璃態(tài)，如果不是則應重新制備樣品。冷凍電鏡基本的成像過程大致相同，從電子源發(fā)射的高度相干的電子束穿透被玻璃態(tài)水包裹的樣品，通過磁透鏡系統(tǒng)將樣品的三維電勢密度分布函數(shù)沿著電子束的傳播方向投影至與傳播方向垂直的二維平面上。由于生物樣品對高能電子的輻射敏感，照相時必須使用最小曝光技術(minimalexposuretechnic)。要得到高分辨率的電鏡圖像，照相時累積的電子劑量不能超過臨界劑量1000到2000e/nm-2;中等分辨率的電鏡圖像圖像不能超過臨界劑量10000e/nm-2。最小曝光技術要求首先在低放大倍數(shù)下尋找合適的區(qū)域;光學對位和聚焦應在鄰近照相的區(qū)域進行。一些因素如：輻射損傷、電子束誘導的樣品漂移和放電、電子束不均一等都能引起圖像質(zhì)量的下降。冷凍含水生物樣品由于沒有經(jīng)過化學固定、染色、金屬鍍膜，所獲得的圖像反差小。冷凍含水樣品電鏡圖像的反差取決于樣品本身的散射反差、冰的厚度和物鏡的欠焦量等因素。3

冷凍電鏡技術的原理冷凍成像技術冷凍電鏡成像前冷凍的樣品要通過專門的設備——冷凍243

冷凍電鏡技術的原理三維重構技術-基本原理該基本原理基于數(shù)學中的傅立葉變換(Fouriertransform，F(xiàn)T)相關的中央截面定理和傅立葉變換性質(zhì)。中央截面定理可表述為:一個三維函數(shù)的投影函數(shù)的傅立葉變換等于該三維函數(shù)傅立葉變換通過坐標原點，且垂直于投影方向的截面函數(shù)。傅立葉變換具有的一個性質(zhì):一個函數(shù)的傅立葉變換的逆傅立葉變換，等價于原來的函數(shù)。該原理所涉及的步驟在數(shù)學上是復雜的，將這個原理應用于電鏡圖像:一個三維物體的電鏡圖像的傅立葉變換等于該三維物體的傅立葉變換通過物體中心并垂直于攝像方向的截面。一個物體(如蛋白質(zhì)、病毒、細胞器、細胞)從不同方向所攝取的n個電鏡圖像做傅立葉變換，這些2D傅立葉變換圖像的集合構成傅立葉空間，即該物體三維結構的三維傅立葉變換，對此三維傅立葉變換作逆傅立葉變換就恢復原物體的三維結構。這個原理奠定了電鏡解析物體三維結構的基石，所有用電鏡解析物體三維結構的方法都是基于這個原理。由于這一奠基性貢獻，AaronKlug榮獲1982年諾貝爾化學獎。3冷凍電鏡技術的原理三維重構技術-基本原理該基本原理基于25利用電子顯微鏡對生物大分子在一維、二維以致三維空間形成的高度有序重復排列的結構（晶體）成像或者收集衍射圖樣，進而解析這些生物大分子的結構，這種方法稱為電子晶體學。但是該技術只有在平面形成一層高度有序排列的蛋白質(zhì)分子樣品(在電鏡領域稱為“二維晶體”two-dimensionalcrystal)才能應用到冷凍電鏡。隨著記錄電鏡圖像的電鏡硬件和圖像處理/三維重構的軟件的成熟，該技術在冷凍電鏡技術領域才會有更大的普適性。3

冷凍電鏡技術的原理三維重構技術-電子晶體學利用電子顯微鏡對生物大分子在一維、二維以致三維空間形成的高度26利用計算機識別圖像把相同蛋白質(zhì)的不同影子收集起來，并且將輪廓相似的圖像進行分類對比，通過分析不同的重復模式將圖片擬合成更加清晰的2D圖像。在此基礎上，通過數(shù)學方法，在同一種蛋白質(zhì)的不同2D圖像之間建立聯(lián)系，以此為基礎擬合出3D結構圖像。計算機可以根據(jù)細微的差異將圖像自動分類，把顆粒分成不同的集群，每個集群代表一個具有特定位置和結構的顆粒的二維投影。在同一集群里不同顆粒被假定為具有足夠的相似性，允許進入疊加和平均值的計算，使信噪比得以提高。3

冷凍電鏡技術的原理三維重構技術-單顆粒技術利用計算機識別圖像把相同蛋白質(zhì)的不同影子收集起來，并且將輪廓273

冷凍電鏡技術的原理roofdoorwindows653421顆粒挑選圖像對齊圖像分類確定方向三維重構結構分析三維重構技術-單顆粒技術簡單演示3冷凍電鏡技術的原理roofdoorwindows653283

冷凍電鏡技術的原理三維重構技術-電子斷層成像技術通過在顯微鏡內(nèi)傾轉(zhuǎn)樣品從而收集樣品多角度的電子顯微圖像并對這些電子顯微圖像根據(jù)傾轉(zhuǎn)幾何關系進行重構的方法稱為電子斷層掃描成像技術。該方法主要應用于細胞及亞細胞器，以及沒有固定結構的生物大分子復合物（分子量范圍為800kD），最高分辨率約20?。3冷凍電鏡技術的原理三維重構技術-電子斷層成像技術通過在293

冷凍電鏡技術的原理三維重構技術研究尺度研究對象研究方法生物大分子二維晶體纖維或管狀晶體電子晶體學（周期排列）生物大分子復合體單顆粒生物大分子及復合體、病毒等單顆粒技術（全同粒子）亞細胞水平超分子復合體、細胞器、亞細胞結構電子斷層成像技術（單一結構）3冷凍電鏡技術的原理三維重構技術研究尺度研究對象研究方法30PART4冷凍電鏡