大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化課件

實驗七大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化實驗七大腸桿菌感受態(tài)細胞的11、學(xué)習(xí)掌握CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的原理和方法2、學(xué)習(xí)和掌握熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌的原理和方法3、把實驗六連接反應(yīng)產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化實驗

實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)掌握CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的原理和方法實21）相關(guān)名詞概念

將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌或其它細胞內(nèi)的過程叫作轉(zhuǎn)化。與噬菌體不同，質(zhì)粒本身不具備感染細胞的能力。為了使細胞能吸收外來DNA，必須改變其細胞生理狀態(tài)，使之具有很高的接收外源DNA的能力，這種具有接收外源DNA能力的細胞叫感受態(tài)細胞。2）CaCl2-熱激法轉(zhuǎn)化原理

CaCl2能改變細胞膜的通透性，大腸桿菌經(jīng)低滲CaCl2溶液致敏處理，就變成高效的感受態(tài)細胞；感受態(tài)細胞與質(zhì)粒混勻于0℃時，混合物中的DNA形成抗DNase羥基-鈣磷酸復(fù)合物黏附于細胞表面，再經(jīng)42℃短時熱激時進入細胞內(nèi)實現(xiàn)轉(zhuǎn)化，利用質(zhì)粒上的遺傳選擇標(biāo)記在LB平板上進行初步篩選轉(zhuǎn)化菌落。實驗原理1）相關(guān)名詞概念實驗原理31、材料

菌株：E.coliTOP10質(zhì)粒：pBI121-chs(實驗六連接反應(yīng)產(chǎn)物)2、試劑

LB液體培養(yǎng)基、LB/Amp(100ug/mL)固體培養(yǎng)皿、滅菌0.1mol/LCaCl2、滅菌去離子水

試劑與器材1、材料試劑與器材4實驗步驟（一）CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞1）挑取純化的大腸桿菌TOP10單菌落接種于盛有5mLLB液體培養(yǎng)基的小三角瓶里，37℃，180rpm振蕩培養(yǎng)過夜；2）取1mL培養(yǎng)菌液接入100mL液體培養(yǎng)基中，37℃180rpm振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5-0.6，冰浴15min；3）將菌液分別移入1.5mL無菌EP管中，4℃，4000rpm離心5min，棄上清，沉淀用1mL預(yù)冷的0.1MCaCl2（過濾滅菌）懸浮，用槍頭輕輕混勻，冰浴15min；4）4℃，4000rpm離心10min，棄上清，沉淀再加200μL預(yù)冷的0.1MCaCl2，輕輕重懸，冰上放置0.5~5小時后，即可用于轉(zhuǎn)化；或每管加滅菌甘油至終濃度15%，混勻，液氮冷激后置于-70℃冰箱保存。實驗步驟（一）CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞5（二）熱激法轉(zhuǎn)化E.coliTOP10

1）將連接產(chǎn)物10μL轉(zhuǎn)移至裝有200μL感受態(tài)細胞的1.5mL離心管中，輕輕混勻（并設(shè)置1管負對照：200μL感受態(tài)細胞懸液+10μL無菌雙蒸水）；2）冰浴30min后，42℃熱激90sec,冰浴2min；3）加入800μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在37℃小于180rpm下振蕩培養(yǎng)0.5~1小時；4）復(fù)蘇后的菌液在4000rpm下常溫離心3min，吸取上清液900μL留約100μL菌液在離心管底部，并用移液槍輕輕吹打重懸；5）用移液槍將重懸菌液移入帶有相應(yīng)抗生素（Amp:100μg/mL,平板表面涂有20mg/mL的X-gal40μL和20mg/mL的IPTG40μL）的37℃保溫的LB固體培養(yǎng)基平板上，用滅菌的涂布器涂布均勻；6）將平板倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)12～18小時。（二）熱激法轉(zhuǎn)化E.coliTOP106實驗預(yù)期結(jié)果實驗預(yù)期結(jié)果7作業(yè)1、