基因工程抗體

基因工程抗體第1頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月單克隆抗體用于治療存在的問題

1、單克隆抗體的特異性由于腫瘤特異性抗原較少，缺乏對腫瘤有嚴(yán)格特異性的單抗，對正常組織有交叉反應(yīng)；

2、異種抗體反應(yīng)鼠源性單抗用于人體，導(dǎo)致異源性超敏反應(yīng)第2頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月理想的抗體藥物的性質(zhì)高特異性和高親和力（Kd=108~1010L/M）對人沒有免疫原性，不誘導(dǎo)機(jī)體對抗體的排斥反應(yīng)游離抗體不激活補(bǔ)體一旦結(jié)合到靶抗原上，能誘導(dǎo)效應(yīng)功能細(xì)胞系穩(wěn)定，適合在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)抗體符合生物制品標(biāo)準(zhǔn)第3頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

問題異源蛋白導(dǎo)致產(chǎn)生抗抗體，影響靶向性和效果靶部位攝取的量太低效應(yīng)功能弱在體內(nèi)被清除速度快

對策抗體人源化改變抗體分子大小連接毒素、放射性同位素、藥物抗體人源化抗體治療存在的問題及對策第4頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月抗體藥物改造的方向抗體人源化和人源抗體制備改變抗體分子大小增強(qiáng)抗體親和力增強(qiáng)抗體效應(yīng)功能第5頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月單克隆抗體人源化的改進(jìn)鼠抗體人源化（人-鼠嵌合、改型抗體）小分子抗體（Fab、單鏈、單域、超變區(qū)多肽）基因工程抗體（雙特異、免疫黏連素、催化抗體）人源抗體（噬菌體抗體庫、轉(zhuǎn)基因小鼠）人-人抗體第6頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、抗體人源化鼠單克隆抗體人源化：嵌合抗體、改型抗體小分子抗體：單價(jià)(Fab、ScFv、單域抗體、超變區(qū)多肽)、多價(jià)（Di-,Tri-,Minibody）特殊類型抗體(雙特異性抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體、抗原化抗體、免疫脂質(zhì)體)抗體融合蛋白（免疫粘連素、免疫毒素、催化抗體）

第7頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月VH和VL是抗原決定簇結(jié)合位點(diǎn)高變區(qū)HVR決定簇互補(bǔ)區(qū)CDR

骨架區(qū)FRCH1和CL：Ig同種異型的遺傳標(biāo)志CH2：補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)CH3：某些細(xì)胞Fc受體結(jié)合部位

第8頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

第一代的抗體人源化—嵌合抗體

從雜交瘤細(xì)胞分離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)（決定免疫原性）基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體。嵌合抗體由于這兩部分在空間結(jié)構(gòu)上相對獨(dú)立，其獨(dú)特的抗體親和力保持得很好，但因鼠單抗可變區(qū)的存在，應(yīng)用時(shí)仍有較強(qiáng)的免疫排斥反應(yīng)。

特點(diǎn)：減少了鼠源性抗體的免疫原性，同時(shí)保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。第9頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈嵌合載體L鏈嵌合載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞啟動(dòng)子人-鼠嵌合抗體基因工程改造策略第10頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月鼠VH鼠VL人CL人CH抗體分泌細(xì)胞人-鼠嵌合基因工程抗體第11頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二代的抗體人源化——改型抗體

在嵌合抗體的基礎(chǔ)上進(jìn)一步將鼠MAb可變區(qū)中相對保守的FR(frameworkregion)替換成人的FR，保留與抗原結(jié)合部位決定簇互補(bǔ)區(qū)（complementdeterminantregion)部位(即CDR移植)

早期的改型抗體：簡單的CDR移植，通過點(diǎn)突變進(jìn)行微調(diào)即更換某個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸。第12頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月第二代改型抗體：①應(yīng)用了人抗體基因庫；②引進(jìn)計(jì)算機(jī)技術(shù)模擬抗體分子的立體結(jié)構(gòu)(分子模擬法)；③使用了鼠人嵌合FR。其目的是獲得具有高親和力的治療性抗體

第13頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體鼠單克隆V區(qū)人源化（CDR移植）第14頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

小分子抗體

人源化抗體屬完全的抗體分子。通過基因重組技術(shù)，可以在保持原有抗原結(jié)合活性的基礎(chǔ)上，把完整的抗體分子改造成較小的分子，稱為小分子抗體。根據(jù)其價(jià)數(shù)的不同可分為單價(jià)小分子抗體及多價(jià)小分子抗體兩種。第15頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月單價(jià)小分子抗體一、Fab抗體

Fab段由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與整個(gè)輕鏈以二硫鍵形式連接而成，主要發(fā)揮抗體的抗原結(jié)合功能。Fab抗體只有完整IgG的1/3。第16頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月二、單鏈抗體(ScFv)

定義：用基因工程方法，將抗體VH和VL（重鏈和輕鏈可變區(qū)）通過一個(gè)連接肽連接而成的小分子抗體，功能：具有較好的抗原結(jié)合能力，且分子量小、穿透力強(qiáng)、免疫原性低等特性?？膳c其他效應(yīng)分子構(gòu)建成多種具有新功能的抗體分子，是構(gòu)建免疫毒素和雙特異抗體等的理想而基本的元件。Ag第17頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

ScFv應(yīng)用：用于腫瘤的導(dǎo)向治療腫瘤的影像分布基因治療研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第18頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月三、單域抗體

抗體與抗原的結(jié)合主要由Ig的V區(qū)決定，因此只含V區(qū)基因片段的小分子抗體，即只有VH或VL一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，也能保持原單克隆抗體的特異性。這種小分子的抗體片段就稱為單域或單區(qū)抗體，其分子量僅為整個(gè)Ig分子的1／12，故也稱之為小抗體。第19頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月四.超變區(qū)多肽(hypervariableregionpolypeptides)

抗體抗原結(jié)合是經(jīng)過補(bǔ)體決定區(qū)（CDR）來實(shí)現(xiàn)。因此，CDR是構(gòu)成抗原抗體結(jié)合的最小結(jié)構(gòu)單位。根據(jù)這一特點(diǎn)，可以設(shè)計(jì)出那些在抗原識別及親和力方面有重要意義的CDR多肽，直接用于診斷或治療，可望獲得理想的結(jié)果。這種只含有一個(gè)CDR多肽的抗體，稱為超變區(qū)多肽，亦稱為最小識別單位(minimalrecognitionunit,MRU)。第20頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

多價(jià)小分子抗體在ScFv的基礎(chǔ)上，可以把兩個(gè)或兩個(gè)以上的ScFv重組在一起，由此可制備成多價(jià)小分子抗體即微型抗體（簡稱多價(jià)微抗）。其中包括雙鏈抗體(diabody)，微型抗體（minibody），三鏈抗體(triabody)及四鏈抗體(tetrabody)等。

第21頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月AgAg一、雙鏈抗體(diabody)

制備方法化學(xué)交聯(lián)法粘性蛋白結(jié)構(gòu)域融合法接頭長度控制法。第22頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月二、三鏈抗體(triabody)

在制備單鏈抗體時(shí)，當(dāng)接頭的長度為2個(gè)或2個(gè)的以下氨基酸殘基時(shí)，或者直接把VH結(jié)構(gòu)域的N末端與VL結(jié)構(gòu)域的C末端相連，通過非共價(jià)鍵而形成的三聚體，稱為三鏈抗體。接頭長度在3～12個(gè)氨基酸殘基時(shí)，則形成雙鏈抗體。第23頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月三、微型抗體(minibody)

通過基因工程手段采用不同的接頭把單鏈抗體(VL-VH)的VH結(jié)構(gòu)域與IgG的CH3結(jié)構(gòu)域融合，形成VL-VH-CH3的結(jié)構(gòu)，稱之為微型抗體（minibody）。此種抗體合成后通過CH3結(jié)構(gòu)域形成穩(wěn)定二聚體式，發(fā)揮其雙價(jià)微抗作用。第24頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月四、雙特異性抗體（BfAb）天然Ig是由兩個(gè)完全相同的VL和VH區(qū)域構(gòu)成，該區(qū)域是特異性識別并結(jié)合抗原的關(guān)鍵部位。而經(jīng)人工設(shè)計(jì)構(gòu)建的雙特異性抗體（BsAb）則由兩個(gè)不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)組成，可同時(shí)與兩種不同的抗原決定簇結(jié)合，并可將其偶連的藥物、酶或放射性核素等導(dǎo)向到靶部位，這種具有雙價(jià)雙特異性的抗體又稱為雙功能抗體（bifunctionalantibody,BfAb）第25頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月雙特異性抗體的特點(diǎn)將免疫細(xì)胞錨著于腫瘤部位，提高腫瘤部位的效靶比。不受MHC的限制，直接激活免疫細(xì)胞的殺瘤機(jī)制。第26頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月123第27頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月提高抗體效應(yīng)功能抗體融合蛋白雙特異性抗體偶連細(xì)胞毒物質(zhì)細(xì)胞內(nèi)抗體提高抗體效應(yīng)功能第28頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月抗體融合蛋白：抗體的一部分被非抗體序列替代，所形成的具有新的特性融合蛋白。根據(jù)構(gòu)建方式的不同，主要分為兩種形式：Fc融合蛋白（Fcfusionprotein,FcFP）由抗體的Fc段與某些具有特定功能的蛋白結(jié)構(gòu)域融合而成。如CD4免疫粘附素，就是由抗體的Fc段與2個(gè)CD4分子的Ig同源區(qū)重組而成抗原結(jié)合融合蛋白（antigen-Bindingfusionprotein,ABFP）由具有抗原結(jié)合功能的抗體結(jié)構(gòu)與其他功能性蛋白融合構(gòu)成。如免疫毒素，抗體部分主要包括嵌合抗體、單鏈抗體形式。第29頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

免疫粘附素(immunoadhension)：將人抗體恒定區(qū)(主要是Fc段)N-端連接于人細(xì)胞表面的受體分子或細(xì)胞粘附分子上，在真核細(xì)胞中表達(dá)出正確折疊的融合抗體蛋白分子，這種分子可同時(shí)發(fā)揮抗體的效應(yīng)功能及其它相應(yīng)的效應(yīng)功能，這種分子又被稱為新效能抗體。

免疫毒素：又稱生物導(dǎo)彈，是由導(dǎo)向性的載體分子與具有毒性的彈頭蛋白交聯(lián)而制成，屬于導(dǎo)向藥物的一種。第30頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月偶連細(xì)胞毒物質(zhì)連接放射性同位素(131I、99mTc）連接植物或細(xì)菌毒素（ricin、PE40）連接細(xì)胞毒性藥物（C1027、柔紅霉素）第31頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicinARicinA（α-FcγRI-RicinA）RicinA:蓖麻毒素A,對腫瘤細(xì)胞具有毒性作用第32頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2

免疫細(xì)胞因子(Immunocytokine)第33頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月

五、細(xì)胞內(nèi)抗體

細(xì)胞內(nèi)抗體主要是指在細(xì)胞內(nèi)合成并作用于細(xì)胞內(nèi)組分的抗體，亦稱內(nèi)抗體（intrabody）。目前的研究主要集中在單鏈抗體上，在ScFv的C端或N端插入其它靶向信號（targetingsignals），如分泌信號、核定位信號、線粒體定位信號和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號等，從而進(jìn)行檢測、識別、發(fā)揮特定功能。第34頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞內(nèi)抗體的應(yīng)用：由于細(xì)胞內(nèi)抗體具有高親和力及選擇結(jié)合特性，因而可通過多種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞的生理過程及代謝。作用機(jī)理表現(xiàn)為：阻斷靶蛋白的活性部位阻斷細(xì)胞內(nèi)蛋白－蛋白相互作用干擾細(xì)胞內(nèi)靶蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)促使靶蛋白降解第35頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月六、抗原化抗體（antigenizedantibody,AbAg）

AbAg是應(yīng)用基因工程技術(shù)，把編碼蛋白質(zhì)抗原表位的核苷酸片段插入重鏈CDR3序列中進(jìn)行表達(dá)，從而產(chǎn)生具有天然抗原表位構(gòu)象和免疫原性的新型抗體。第36頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月今后抗體藥物發(fā)展的方向?qū)ふ倚碌陌锌乖诳乖Ⅲw結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)抗體基于抗原-抗體相互作用設(shè)計(jì)小分子抗體模擬物第37頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月最理想的單克隆抗體100%人源人類免疫系統(tǒng)自然產(chǎn)生第38頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月25年來的全人抗體的嘗試鼠骨髓瘤不適合與人B細(xì)胞融合穩(wěn)定性差抗體產(chǎn)量低非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒(EBV)保存抗體分泌細(xì)胞細(xì)胞株不穩(wěn)定抗體的產(chǎn)量低不能特異性地保存抗體分泌細(xì)胞很難獲得人類骨髓瘤細(xì)胞株第39頁，課件共41頁，創(chuàng)作于2023年2月成功建立人骨髓瘤細(xì)胞系，人源抗體進(jìn)入新的里程用途：能穩(wěn)定的保持人B細(xì)