運(yùn)用高效液相色譜測定葡萄酒中的添加劑

精品文檔-下載后可編輯運(yùn)用高效液相色譜測定葡萄酒中的添加劑在科學(xué)技術(shù)快速發(fā)展的背景下，許多新的檢測技術(shù)和檢測方法被廣泛應(yīng)用在食品安全檢測中，有利于從技術(shù)層面保障食品的健康。當(dāng)前有不同類型的檢測方法可以分別測定葡萄酒中的甜味劑、色素、防腐劑等，但是這些方法需要花費(fèi)較長的檢測時(shí)間，檢測程序相對繁雜，不能同時(shí)快速測定葡萄酒中不同類型的添加劑。高效液相色譜作為一種全新的檢測方法，將其應(yīng)用于葡萄酒的測定中，可以很好地檢測出酒中的添加劑，達(dá)到良好的測定效果。

高效液相色譜法概述

對于高效液相色譜法而言，其也稱之為近代柱色譜、高分離度液相色譜、高速液相色譜、高壓液相色譜等，可分為親和色譜、離子色譜、吸附色譜、體積排阻色譜、分配色譜等類型，指的是在分析化學(xué)和生化中經(jīng)常采用的柱層析儀。作為色譜法中的重要內(nèi)容，高效液相色譜是以液體為流動相，借助高壓輸液系統(tǒng)，在裝有固定相的色譜柱中泵入不同比例的緩沖液、混合溶劑或不同極性的單一溶劑，當(dāng)柱內(nèi)的成分進(jìn)行分離后加以檢測，有效分析試樣。該方法可以及時(shí)準(zhǔn)確解決不同學(xué)科領(lǐng)域中的數(shù)據(jù)問題，如法檢、商檢、工業(yè)、化學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等，逐漸成為重要的分離分析技術(shù)。

材料與方法

儀器設(shè)備和材料、試劑。本實(shí)驗(yàn)中采用的儀器設(shè)備主要是沃特世高效液相色譜儀ACQUITYUPLCH-ClassBio、二極管陣列檢測器、自動進(jìn)樣器。而實(shí)驗(yàn)中使用的10份葡萄酒樣品規(guī)格為750mL，試劑為0.5mg/mL的赤蘚紅、胭脂紅、檸檬黃、莧菜紅、日落黃與1.00mg/mL的誘惑紅，純度為99.5%的對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸甲酯、苯甲酸，純度為99.9%的糖精鈉、對羥基苯甲酸乙酯，純度為91%的靛藍(lán)與純度為99%的山梨酸和安賽蜜，純度為92%的新紅。

儀器條件和樣品處理。

（1）儀器條件。首先是色譜條件。本實(shí)驗(yàn)選用的色譜柱為ACQUITYUPLC1.7μm，柱匚30℃，流速是1.0mL/min，而進(jìn)樣量為10μL，流動相為20mmol/L乙酸銨-甲醇，檢測波長涉及630nm的亮藍(lán)、425nm的檸檬黃、515nm的誘惑紅、日落黃、胭脂紅、莧菜紅等，下表1表示的是洗脫梯度。其次是質(zhì)譜條件。對源溫度進(jìn)行加熱，使其達(dá)到300℃，毛細(xì)管的溫度達(dá)到350℃，噴霧電壓處于負(fù)離子的模式，電壓為3000V，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1000，一級質(zhì)譜全掃描分辨率35000，C-trap的最大等待時(shí)間和最大容量（AGC）分別是200ms和3×106。

（2）樣品處理。在實(shí)驗(yàn)過程中，將5mL的樣品吸入到10mL的比色管中，利用蒸餾水進(jìn)行定容，使其達(dá)到規(guī)定的刻度，在基礎(chǔ)上進(jìn)行混合搖勻，然后經(jīng)過0.45μm的無機(jī)濾膜，上機(jī)進(jìn)樣10μL進(jìn)行色譜分析。

（3）方法。以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰掃光譜純度和保留時(shí)間為依據(jù)，按照兩種方式來準(zhǔn)確定性樣品峰，借助外標(biāo)法的方式定量計(jì)算峰面積，然后依次分析不同濃度的10種添加劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，如誘惑紅、胭脂紅、檸檬黃、糖精鈉、山梨酸、日落黃、安賽蜜、莧菜紅、苯甲酸等。值得注意的是，在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的過程中，縱坐標(biāo)表示的是峰面積，橫坐標(biāo)表示的是質(zhì)量濃度（mg/L）。

結(jié)果分析

高效液相色譜條件的優(yōu)化。誘惑紅、胭脂紅、檸檬黃、糖精鈉、山梨酸、日落黃、安賽蜜、莧菜紅、苯甲酸等10種添加劑在極性方面存在很大的差異，如果僅僅只使用一種色譜體系，則不能達(dá)到理想的分離結(jié)果。在本次實(shí)驗(yàn)中采用高效液相色譜法，流動相為20mmol/L的乙酸銨-甲醇，借助梯度洗脫的方法來促進(jìn)分離結(jié)果的提高。通常在開始測試時(shí)，流動相中的20mmol/L的乙酸銨以及甲醇的比例為95：5，然后在0～15min內(nèi)調(diào)整兩者的比例，使其變?yōu)?5：65，在15～25min內(nèi)將兩者的比例調(diào)整為2：98，而在25～35min內(nèi)將兩者的比例調(diào)整為95：5.通過這樣的步驟，能夠很好地分離出葡萄酒中的10種添加劑。

利用紫外光譜儀器掃描葡萄酒中的胭脂紅、糖精鈉、誘惑紅、日落黃等10中添加劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后確定檢測波長，可以得出如下結(jié)果：亮藍(lán)630nm；檸檬黃425nm；誘惑紅、胭脂紅、莧菜紅、日落黃515nm；山梨酸、安賽蜜、糖精鈉、苯甲酸230nm。按照上述優(yōu)化后的色譜條件來檢測葡萄酒中10種添加劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，可以完全分離這些添加劑，形成良好的峰形。

方法檢測限和曲線線性范圍。分別進(jìn)樣10μL的逐級稀釋的標(biāo)準(zhǔn)工作液，對線性回歸的結(jié)果進(jìn)行測定，其中線性范圍為0.5～20mg/L，下表2為檢測限和回歸方程[x為濃度，（mg/L）；y為峰面積，Counts]相關(guān)系數(shù)。

精密度與回收率。該實(shí)驗(yàn)中對已知含量的6份同一樣品進(jìn)行稱取，以供試品制備的方法為依據(jù)進(jìn)行處理，然后通過測定得出結(jié)果?？芍簶悠分械钠骄鄬?biāo)準(zhǔn)偏差為0.48%～4.33%（n=6），加標(biāo)回收率90.0%～108.5%。

方法運(yùn)用。采用高效液相色譜的方法來測定葡萄酒中的10種添加劑，結(jié)合添加劑的光譜圖與保留時(shí)間進(jìn)行定性定量分析，其中3個(gè)樣品中可以檢測出山梨酸，如下表3所示。

在上述實(shí)驗(yàn)過程中，構(gòu)建葡萄酒中日落黃、檸檬黃、山梨酸、安賽蜜、誘惑紅、胭脂紅、糖精鈉、莧菜紅、苯甲酸等10種添加劑的檢測方法，即高效液相色譜法，分別對梯度洗脫條件和流動相進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以便獲得10種添加劑的有效分離。這種方法可以簡單預(yù)處理樣品，具備較高