細(xì)胞培養(yǎng)常見問題的原因及對(duì)策

細(xì)胞培養(yǎng)常見問題的原因及對(duì)策

細(xì)胞培育常見問題的緣由及對(duì)策細(xì)胞培育常見問題的緣由及對(duì)策細(xì)胞培育中的留意事項(xiàng)1冷凍管應(yīng)如何解凍取出冷凍管后,須馬上放入37水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部溶化,并留意水面不行超過冷凍管蓋沿,否則易發(fā)生污染情形。

另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí),必需留意平安,預(yù)防冷凍管之爆裂。

2細(xì)胞冷凍管解凍培育時(shí),是否應(yīng)立刻去除除少數(shù)特殊注明對(duì)敏感之細(xì)胞外,絕大部分細(xì)胞株包括懸浮性細(xì)胞,在解凍之后,應(yīng)直接放入含有10-15新奇培育基之培育角瓶中,待隔天再置換新奇培育基以去除即可,如此可避開大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問題。

3可否使用與原先培育條件不同之培育基不能。

每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培育基,若突然使用和原先供應(yīng)之培育條件不同之培育基,細(xì)胞大都無(wú)法馬上適應(yīng),造成細(xì)胞無(wú)法存活。

4可否使用與原先培育條件不同之血清種類不能。

血清是細(xì)胞培育上一個(gè)極為重要的養(yǎng)分來(lái)源,所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。

來(lái)自不同物種的血清,在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。

5何謂,,,和是相同的意思,兩者都是指胎牛血清,乃錯(cuò)誤的使用字眼,請(qǐng)不要再使用。

則是指小牛血清。

則是指馬血清。

6培育細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5%或10%2或根本沒有影響一般培育基中大都使用3-32-+作為的緩沖系統(tǒng),而培育基中3的含量將打算細(xì)胞培育時(shí)應(yīng)使用的2濃度。

當(dāng)培育基中3時(shí),細(xì)胞培育時(shí)應(yīng)使用10%;時(shí),則應(yīng)使用5%2培育細(xì)胞。

7何時(shí)須更換培育基視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定,或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間,按時(shí)更換培育基即可。

8培育基中是否須添加抗生素除于特別篩選系統(tǒng)中外,一般正常培育狀態(tài)下,培育基中不應(yīng)添加任何抗生素。

9附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之-濃度應(yīng)如何處理一般使用之-濃%-。

第一次開瓶后應(yīng)馬上少量分裝于無(wú)菌試管中,保存于–20,避開反復(fù)冷凍解凍造成之活性降低,并可削減污染之機(jī)會(huì)。

10懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理一般僅需持續(xù)加入新奇培育基于原培育角瓶中,稀釋細(xì)胞濃度即可,若培育液太多時(shí),可將培育角瓶口端略微抬高,直到無(wú)法容納為止。

分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培育液至另一新的培育角瓶,加入新奇培育基稀釋至適當(dāng)濃度,重復(fù)前述步驟即可。

細(xì)胞培育常見問題的緣由及對(duì)策11欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái),其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速欲回收動(dòng)物細(xì)胞,其離心速率一般為300約1,000,5-1分0鐘,過高之轉(zhuǎn)速,將造成細(xì)胞死亡。

12細(xì)胞之接種密度為何依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。

細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)之一重要緣由。

13細(xì)胞冷凍培育基之成份為何動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培育基是含5-10%和90-95原%來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新奇培育基勻稱混合之。

留意:由于稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能,故不行將直接加入細(xì)胞液中,必需使用前先行配制完成。

14之等級(jí)和無(wú)菌過濾之方式為何冷凍保存使用之等級(jí),必需為之如265,0其本身即為無(wú)菌狀況,第一次開瓶后應(yīng)馬上少量分裝于無(wú)菌試管中,保存于4,避開反復(fù)冷凍解凍造成之裂解而釋出有害物質(zhì),并可削減污染之機(jī)會(huì)。

若要過濾,則須使用耐之材質(zhì)濾膜。

15冷凍保存細(xì)胞之方法冷凍保存方法一:冷凍管置于430~6分0鐘→-203分0鐘→-8016~1小8時(shí)或隔夜→液氮槽長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

冷凍保存方法二:冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3至–80以下,再放入液氮槽長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

*-20不行超過1小時(shí),以防止冰晶過大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80冰箱中,惟存活率略微降低一些。

16細(xì)胞欲冷凍保存時(shí),細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1106,融合瘤細(xì)胞則以5106為宜。

17應(yīng)如何避開細(xì)胞污染細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。

主要的污染緣由為無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。

嚴(yán)格無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培育基配制是減低污染之最好方法。

18假如細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí),應(yīng)如何處理加入相應(yīng)抗生素,直接滅菌后丟棄之。

19支原體污染的細(xì)胞,是否能以肉眼觀看出異狀不能。

除極有閱歷之專家外,大多數(shù)患病支原體污染的細(xì)胞株,無(wú)法以其外觀辨別之。

20支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培育有何影響支原體污染幾乎可影響全部細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù),代謝及討論任一數(shù)據(jù)。

故進(jìn)行試驗(yàn)前,必需確認(rèn)細(xì)胞為-,試驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

21偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí),該如何處理直接滅菌后丟棄,以避開污染其它細(xì)胞株。

細(xì)胞培育常見問題的緣由及對(duì)策222培育箱之水盤如何保持清潔定期至少每?jī)芍芤淮我詿o(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。

23為何培育基保存于4冰箱中,顏色會(huì)偏暗紅色,且值會(huì)越來(lái)越偏堿性培育基保存于4冰箱中,培育基內(nèi)之2會(huì)漸漸溢出,造成培育基越來(lái)越偏堿性,而培育基中之酸堿指示劑通常為的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。

培育基偏堿之結(jié)果,將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。

若培育基偏堿時(shí),可以通入無(wú)菌過濾之2,以調(diào)整值。

24各種細(xì)胞培育用的,是否均相同不同廠牌的或,其所的不同,制造程序亦不同,雖對(duì)大部分細(xì)胞沒有太大之影響,惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之或而有顯著之生長(zhǎng)差異。

25購(gòu)買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后,為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形討論人員在冷凍細(xì)胞之培育時(shí)消失細(xì)胞數(shù)目太少,大都是由于離心過程操作上的失誤,造成細(xì)胞的物理性損傷,以及細(xì)胞流失。

建議細(xì)胞解凍后不要立即離心,應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培育基即可。

26購(gòu)買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能緣由討論人員在細(xì)胞培育時(shí)消失存活率不佳,常見緣由可歸納為:培育基使用錯(cuò)誤或培育基品質(zhì)不佳。

血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。

解凍過程錯(cuò)誤。

冷凍細(xì)胞解凍后,加以洗滌細(xì)胞和離心。

懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。

培育溫度使用錯(cuò)誤。

細(xì)胞置于–80太久。

27收到之冷凍管瓶身裂開,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落之緣由冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身裂開,可能是由于操夾取冷凍管時(shí)用力不當(dāng),造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗當(dāng)心夾取。

另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫,乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象,冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí),均應(yīng)立即將冷凍管再一次扭緊。

28如何選用特別細(xì)胞系培育基培育某一類型細(xì)胞沒有固定的培育條件。

在中培育的細(xì)胞,很可能在或199中同樣很簡(jiǎn)單生長(zhǎng)。

總之,首選做粘附細(xì)胞培育、-1640做懸浮細(xì)胞培育是一個(gè)好的開頭,各種目的無(wú)血清培育最好首選12023培育基。

29谷-氨酰***在細(xì)胞培育中重要嗎它在溶液中不穩(wěn)定嗎-谷氨酰***在細(xì)胞培育時(shí)是重要的。

脫掉氨基后,-谷氨酰***可作為培育細(xì)胞的能量來(lái)源、參加蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。

-谷氨酰***在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解,但是準(zhǔn)確的降解率始終沒有最終定論。

-谷氨酰***的降解導(dǎo)致氨的形成,而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。

30-是什么培育細(xì)胞如何利用-這個(gè)二肽有多穩(wěn)定-二肽是一個(gè)-谷氨酰***的衍生物,其不穩(wěn)定的氨-基用-丙氨酸來(lái)愛護(hù)。

一種肽酶漸漸裂解二肽,釋放-谷氨酰***供利用。

-二肽特別穩(wěn)定,即使在121磅滅菌20分鐘,-二肽溶液有最小的降解,假如在相同條件下,-谷氨酰***幾乎完全降解。

31什么培育基中可以省去加酚紅酚紅在培育基中被用來(lái)作為值的指示劑:中性時(shí)為紅色,酸性時(shí)為黃色,堿性時(shí)為紫色。

討論表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,特殊是雌激素。

為避開固醇類反應(yīng),培育細(xì)胞,尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí),用不加酚紅的培育基。

由于酚紅干擾檢測(cè),一些討論人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí),不使用加有酚紅的培育基。

細(xì)胞培育常見問題的緣由及對(duì)策32培育基中***酸鈉的作用是什么***酸鈉可以作為細(xì)胞培育中的替代碳源,盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,假如沒有葡萄糖的話,細(xì)胞也可以代謝***酸鈉。

33名目上說,’平衡鹽溶液要在空氣中使用,不需要2培育箱。

緣由是什么’平衡鹽溶液和’平衡鹽溶液有什么本質(zhì)的功能差別和的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在比在高。

碳酸氫鈉需用高水平的2平衡,以維持溶液的值。

液在空氣水平的2中,溶液會(huì)變堿,液在2培育箱中會(huì)變酸。

假如盼望在2培育箱中保存組織,需要用液,。

假如僅僅是清洗將要在細(xì)胞培育基中儲(chǔ)存的組織,用液就可以了。

34二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎使用胰蛋白酶時(shí)加入的目的是什么二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。

用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。

建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前,用清洗細(xì)胞,以消退來(lái)自培育基中全部的二價(jià)離子。

35當(dāng)在無(wú)血清培育基中添加抗生素時(shí),降低至少在有血清培育基中所使用濃度的50%。

血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。

在無(wú)血清培育條件下,抗生素不被滅活,可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。

36一旦您在新奇培育基中添加了血清和抗生素時(shí),您應(yīng)當(dāng)在兩到三周內(nèi)使用它。

由于一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開頭降解。

37大部分添加物和試劑最多可以凍融3次,假如次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起肯定水平的降解和沉淀,將會(huì)影響它的性能。

38在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。

胰蛋白酶在4℃就可能開頭降解,假如在室溫下放置超過30分鐘,就會(huì)變得不穩(wěn)定。

細(xì)胞培育常見問題的緣由及對(duì)策:1.培育液值變化太快:2張力不對(duì)。

培育瓶蓋擰得太緊。

3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足。

培育液中鹽濃度不正確。

細(xì)菌、酵母或真菌污染。

按培育液中3濃度增加或削減培育箱內(nèi)2濃度,濃度3對(duì)應(yīng)2濃度為5%到10%。

2改用不依靠2培育液。

松開瓶蓋14圈。

加緩沖液至10到25終濃度。

在2培育環(huán)境中改用基于’鹽配制的培育液,在大氣培育環(huán)境中培育改用’鹽配制的培育液。

丟棄培育物或用抗生素除菌。

2.培育液消失沉淀,但值不變:用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培育基成分沉淀下來(lái)。

冰凍保存培育液。

用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿,然后除菌。

將培育液加熱到37℃,搖動(dòng)使其溶解如沉淀仍舊存在,丟棄培育液。

細(xì)胞培育常見問題的緣由及對(duì)策3.培育液消失沉淀,同時(shí)發(fā)生變化:細(xì)菌或真菌污染。

丟棄培育物或用抗生素除菌。

4.培育細(xì)胞不貼壁:胰蛋白酶消化過度;支原體污染;培育液中無(wú)貼壁因子。

縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度。

分別培育物,檢測(cè)支原體。

清潔支架和培育箱。

如發(fā)覺支原體污染,丟棄培育物。

5.懸浮細(xì)胞成簇:培育液中含鈣、鎂離子。

支原體污染。

蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解釋放。

用無(wú)鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞,輕輕吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液。

分別培育物,檢測(cè)支原體。

如發(fā)覺支原體污染,丟棄培育物。

用處理細(xì)胞。

6.原代細(xì)胞培育物污染:原代培育組織在進(jìn)入培育前已污染培育前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織。

7.培育細(xì)胞死亡:培育箱內(nèi)無(wú)2。

培育箱內(nèi)溫度波動(dòng)太大。

細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷。

培育液滲透壓不正確。

培育液種有毒代謝產(chǎn)物積累。

檢測(cè)培育箱內(nèi)2檢查培育箱內(nèi)溫度取新的保存細(xì)胞種檢測(cè)培育液滲透壓。

留意:大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能耐受滲透壓為260–350。

加入額外試劑如或藥物都有可能影響培育液滲透壓。

換入新奇培育液8.培育細(xì)胞生長(zhǎng)減慢:由于更換不同培育液或血清。

培育液中一些細(xì)胞生長(zhǎng)必需成分如谷氨酰***或生長(zhǎng)因子耗盡或缺乏或已被破壞。

培育物中有少量細(xì)菌或真菌污染。

試劑保存不當(dāng)。

比較新培育液與原培育液成分,比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)。

增加起始培育細(xì)胞濃度。

讓細(xì)胞漸漸適應(yīng)新培育液。

換入新奇配制培育液。

補(bǔ)加谷氨酰***或生長(zhǎng)因子。

用無(wú)抗生素培育液培育,如發(fā)覺污染,丟棄培育物。

或用抗生素除菌。

血清需保存在-5℃到-20℃。

培育液需在2–8℃避光保存。

含血清完全培育液在2–8℃保存,并在2周內(nèi)用完。

接種細(xì)胞起始濃度太低,細(xì)胞已老化,支原體污染。

增加接種細(xì)胞起始濃度。

換用新的保種細(xì)胞。

分別培育物,檢測(cè)支原體。

清潔支架和培育箱。

如發(fā)覺支原體污染,丟棄培育物。

細(xì)胞培育常見問題的緣由及對(duì)策血清1.保存血清最好的方法建議血清應(yīng)保存在-5℃至-2℃。

然而,若存放于4℃時(shí),請(qǐng)勿超過一個(gè)月。

若您一次無(wú)法用完一瓶,建議您無(wú)菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi),再放回冷凍。

2.如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損建議您將血清從冷凍箱取出后,先置于2~8℃冰箱使之融解,然后在室溫下使之全融。

但必需留意的是,融解過程中必需規(guī)章地?fù)u擺勻稱。

3.血清解凍后發(fā)覺有絮狀沉淀物消失,該如何處理血清中沉淀物的消失有很多種緣由,但最普遍的緣由是由于血清中脂蛋白的變性所造成,而血纖維蛋白形成凝血的蛋白之一在血清解凍后,也會(huì)存在于血清中,亦是造成沉淀物的主要緣由之一。

但這些絮狀沉淀物,并不影響血清本身的質(zhì)量。

若欲去除這些絮狀沉淀物,可以將血清分裝至無(wú)菌離心管內(nèi),以400略微離心,上清液即可接著加入培育基內(nèi)一起過濾。

我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物,由于它可能會(huì)堵塞您的過濾膜。

4.為什么要熱滅活血清加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。

激活的補(bǔ)體參加溶解細(xì)胞大事,刺激平滑肌收縮,細(xì)胞和血小板釋放組***,激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。

在免疫學(xué)討論,培育細(xì)胞,昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí),推舉使用熱滅活血清。

5.有必要做熱滅活嗎試驗(yàn)顯示,經(jīng)過正確處理的熱滅活血清,對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。

經(jīng)此處理過的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn),或完全沒有任何作用,甚至通常由于高溫處理影響了血清的質(zhì)量,而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。

而經(jīng)過熱處理的血清,沉淀物的形成會(huì)顯著的增多,這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀看,像是“小黑點(diǎn)”,經(jīng)常會(huì)讓討論者誤以為是血清患病污染,而把血清放在37℃環(huán)境中,又會(huì)使此沉淀物更增多,使討論者誤認(rèn)為是微生物