基因組與比較基因組學課件

11基因組與比較基因組學11.1高通量DNA序列分析技術11.2人類基因組計劃11.3其他基因組11.4比較基因組學及相關研究11基因組與比較基因組學11.1高通量DNA序列分析技術20世紀人類科技發(fā)展史上的三大創(chuàng)舉：1940年代第一顆原子彈爆炸；1960年代人類首次登上月球；1990年代提出并已基本完成的人類基因組計劃（HGP）。20世紀人類科技發(fā)展史上的三大創(chuàng)舉：基因組學是美國人T·H·Rodehck在1986年7月提出來的?；蚪M是生物體內遺傳信息的集合，是某個特定物種細胞內全部DNA分子的總和。原核生物基因組：原核生物DNA分布在整個細胞之中，有時相對集中在類核體上。類核體上的DNA是一條共價、閉合雙鏈分子，類核體通常也稱為染色體。這條染色體的DNA就是原核細胞的基因組。真核生物基因組：一個物種的單倍體的各條染色體中的全部DNA為該物種的基因組（genome）。例如，人有23對染色體，配子——單倍體是23條染色體，這23條染色體中的全部DNA就是人體基因組?；蚪M學是美國人T·H·Rodehck在1986年7月提出來11.1高通量DNA序列分析技術1.DNA序列測定的基本原理DNA自動測序儀可快速測定DNA序列，計算機處理能力的快速提高則使得大量DNA小片段很容易拼接成較大的片段甚至整個染色體。高效快捷的DNA測序方法是20世紀70年代中期發(fā)展起來的，主要有兩種：Sanger的雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert的化學修飾法。11.1高通量DNA序列分析技術1.DNA序列測定的基本Sanger的雙脫氧鏈終止法基本原理：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧堿基存在條件下復制或轉錄時，如果在四管反應系統(tǒng)中分別按比例引入四種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長。如此每管反應體系中便合成以共同引物為5’端，以雙脫氧堿基為3’端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止后，分四個泳道進行電泳，以分離長短不一的核酸片段（長度相鄰者僅差一個堿基），根據片段3’端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。Sanger的雙脫氧鏈終止法Maxam-Gilbert化學修飾法：

1）基本原理：用化學試劑處理具有末端放射性標記的DNA片段，造成堿基的特異性切割并產生一組具有不同長度的DNA鏈降解產物，經凝膠電泳分離和放射自顯影后，可直接讀出待測DNA片段的核苷酸序列。

2）基本步驟：（1）同位素標記DNA片段的5’端；（2）在特殊位置上通過化學反應隨機打斷DNA鏈G,A(someG),T(someC)，C；（3）形成大小不一的DNA鏈；（4）電泳分離DNA鏈；（5）根據同位素標記自顯影后讀出序列。

3）優(yōu)點：不存在因DNA序列或結構引起DNA合成問題，能測定用酶學方法不能正常測序的DNA序列。

4）缺點：需使用劇毒化學試劑。Maxam-Gilbert化學修飾法：

1）基本原理：用化學DNA測序自動化：

1）使用熒光標記的dNTP；2）毛細管電泳；3）激光檢測讀序。

PCR用于制備測序反應：1）測序反應實質就是DNA擴增，因而可以用PCR進行測序反應。

2）與典型PCR反應的不同：（1）只用一個引物；（2）需用測序級的DNA聚合酶；（3）DNA模板量高，一般0.5-1.0mg；（3）循環(huán)次數多，一般35-40個循環(huán)；（4）產物需純化干燥。

實際工作中如要進行DNA測序，需要準備什么？

1）克隆你的目的基因或其片段；

2）鑒定你所得到的含目的基因或片段的重組質粒；

3）將含重組質粒的細菌或質粒送測序公司；

4）等結果。DNA測序自動化：

1）使用熒光標記的dNTP；2）毛細管電2.基因組DNA大片段文庫的構建構建基因文庫是測序前必須的預備工作。酵母人工染色體技術（YAC）為創(chuàng)制基因組物理圖提供了極大的方便。ARS序列（Ori），CEN序列，TEL序列。2.基因組DNA大片段文庫的構建YAC的主要缺點：1）存在高比例的嵌合體，即一個YAC克隆含有兩個本來不相連的獨立片段；

2）部分克隆子不穩(wěn)定，在轉代培養(yǎng)中可能會發(fā)生缺失或重排；

3）難與酵母染色體區(qū)分開，因為YAC與酵母染色體具有相似的結構。

4）操作時容易發(fā)生染色體機械切割。YAC的主要缺點：用細菌的F質粒及其調控基因構建了細菌染色體克隆載體BAC，其克隆能力在125-150kb左右。質粒主要包括oriS，repE（控制F質粒復制）和parA、parB（控制拷貝數）等成分。以BAC為基礎的克隆載體轉化效率高，而且以環(huán)狀結構存在于細菌體內，易于分辨和分離純化。用細菌的F質粒及其調控基因構建了細菌染色體克隆載體BAC，其3.鳥槍法基因組序列分析技術DNA序列分析技術一次測序反應的長度不能超過1kb，不能直接用BAC等大片段作為序列分析的模板，采用全基因組鳥槍法測序技術——隨機挑選插入基因組DNA的質粒做測序反應，然后用計算機程序進行序列拼接。3.鳥槍法基因組序列分析技術采用全基因組鳥槍法測序的基本原理：對某基因組文庫全部克隆片段進行末端序列測定中未測到的堿基數，即缺口(gap)，與已測定的總堿基數相關。隨著已測定堿基數的增加，缺口的總堿基數目會按照泊松公式的一個推論（P=e-m）迅速減小。其中P為基因組中某個堿基未被測定的概率，m為所測定的堿基數與基因組大小相比的倍數。m越大P值越小。當m=5（即隨機測定的堿基數達到基因組5倍），基因組中未測定的堿基數為總堿基數的0.67%（e-5=0.0067）。對流感嗜血桿菌基因組（1.83Mb）來說，可能留有128個平均長為100bp的缺口。采用全基因組鳥槍法測序的基本原理：鳥槍法測序的缺點：隨著所測基因組總量增大，所需測序的片段大量增加，各個片段重疊成一個連續(xù)體的概率是2n2-2n。高等真核生物（如人類）基因組中有大量重復序列，導致判斷失誤。鳥槍法測序的缺點：對鳥槍法的改進：Clonecontig法。首先用稀有內切酶把待測基因組降解為數百kb以上的片段，再分別測序。靶標鳥槍法(diretedshotgun)。首先根據染色體上已知基因和標記的位置來確定部分DNA片段的相對位置，再逐步縮小各片段之間的缺口。對鳥槍法的改進：改進后的鳥槍測序法原理圖改進后的鳥槍測序法原理圖11.2人類基因組計劃2003年4月14日，國際人類基因組計劃宣布：人類基因組序列草圖提前繪制成功。人類基因組包括24條染色體，約30億對核苷酸，編碼約3萬個基因，人類基因組中攜帶了有關人類個體生長發(fā)育、生老病死的全部遺傳信息。從整體上看，不同人類個體的基因是相同的，因此，我們說“人類只有一個基因組”，人生來是平等的。當然，不同的人可能擁有不同的等位基因，這一點決定了人與人之間個體上的差異。11.2人類基因組計劃2003年4月14日，國際人類基因組1.人類基因組計劃的科學意義確定人類基因組中約3萬個編碼基因的序列及其在基因組中的物理位置，研究基因的產物及其功能。了解轉錄和剪接調控元件的結構與位置，從整個基因組結構的宏觀水平上理解基因轉錄與轉錄后調節(jié)。從整體上了解染色體結構，了解各種不同序列在形成染色體結構、DNA復制、基因轉錄及表達調控中的影響與作用。研究空間結構對基因調節(jié)的作用。發(fā)現與DNA復制、重組等有關的序列。研究DNA突變、重排和染色體斷裂等，了解疾病的分子機制，為疾病診斷、預防和治療提供理論依據。確定人類基因組中轉座子、逆轉座子和病毒殘余序列，研究其周圍序列的性質。研究人類個體之間的多態(tài)性（SNP）情況，用于基因診斷、個體識別、親子鑒定、組織配型、發(fā)育進化等許多醫(yī)療、司法和人類學的研究。1.人類基因組計劃的科學意義2.遺傳圖遺傳圖又稱連鎖圖（LinkageMap），是指基因或DNA標志在染色體上的相對位置與遺傳距離，通常以基因或DNA片段在染色體交換過程中的分離頻率厘摩（cM）來表示。cM值越大，兩者之間距離越遠。產生配子的減數分裂過程中，親代同“號”的父源或母源染色體既能相互配對也可能發(fā)生片段互換，而父母源染色體等位基因互換導致子代出現DNA“重組”的頻率與這兩個位點之間的距離呈正相關，所以，用兩個位點之間的交換或重組頻率來表示其“遺傳學距離”。連鎖分析是通過分析同一遺傳位點在不同個體中等位基因的不同（多態(tài)性）來研究同一染色體上兩位點之間的相互關系。2.遺傳圖遺傳距離圖的基本數據來自基因的重組。遺傳距離圖的基本數據來自基因的重組。由于不能對人類進行“選擇性”婚配，而且人類子代個體數量有限、世代壽命較長，呈共顯多態(tài)性的蛋白質數量不多，等位基因的數量不多。DNA技術的建立為人類提供了大量新的遺傳標記。遺傳標記有三代：第一代DNA遺傳標記是RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）。DNA序列上的微小變化，甚至1個核苷酸的變化，也能引起限制性內切酶切點的丟失或產生，導致酶切片段長度的變化。由于不能對人類進行“選擇性”婚配，而且人類子代個體數量有限、第二代DNA遺傳標記利用了存在于人類基因組中的大量重復序列：重復單位長度在15-65個核苷酸左右的小衛(wèi)星DNA；重復單位長度在2-6個核苷酸之間的微衛(wèi)星DNA，又稱為簡短串聯重復（STR、STRP或SSLP）。衛(wèi)星DNA分類特征衛(wèi)星DNA串聯重復的基本單位首尾相接，在基因組中呈不均勻分布，但主要集中于著絲粒、端粒等特定部位，高度或中等重復，分屬三個大家族。α衛(wèi)星DNA中等重復，基本單位長171bp。小衛(wèi)星DNA中等重復，基本單位長15-65bp。微衛(wèi)星DNA中等重復，基本單位長2-8bp第二代DNA遺傳標記利用了存在于人類基因組中的大量重復序列：占人類基因組約45%的重復序列來源于轉座子復制機制。序列分析表明，四類轉座子產生了這些重復序列，其中前三類轉座子以RNA為中間產物進行轉座，最后一類則直接以DNA的形式轉座。占人類基因組約45%的重復序列來源于轉座子復制機制。序列分析STRP的優(yōu)點是“多態(tài)性”與“高頻率”。由于(A)n，(CA)n，(CGG)n等短重復序列在進化上不受選擇，在同一位點上可重復單位數量變化很大，配對時又容易產生“錯配”，使這樣的位點遍布于整個基因組。已有5264個STRP為主體的遺傳標記“連鎖圖”，平均分辨率已達600kb，其中第17號染色體上平均每495kb有一個標記，第9號染色體上平均每767kb有一個標記，整個基因組中只有三處標記間距大于4Mb。STRP的優(yōu)點是“多態(tài)性”與“高頻率”。由于(A)n，(CA第三代DNA遺傳標記，可能也是最好的遺傳標記，是分散于基因組中的單個堿基的差異，即單核苷酸的多態(tài)性（SNP），包括單個堿基的缺失、插入和替換。SNP中大多數為轉換，即由一種嘧啶堿基替換另一種嘧啶堿基，或由一種嘌呤堿基替換另一種嘌呤堿基，顛換與轉換之比為1：2。SNP有可能在密度上達到人類基因組“多態(tài)”位點數目的極限。估計人類基因組中可能有300萬個SNP位點！SNP與RFLP和STRP標記的主要不同之處在于，它不再以DNA片段的長度變化作為檢測手段，而直接以序列變異作為標記。第三代DNA遺傳標記，可能也是最好的遺傳標記，是分散于基因組“遺傳圖”的建立為人類疾病相關基因的分離克隆奠定了基礎。擁有5000多個遺傳學位點，相當于把整個人類基因組劃分為5000多個小區(qū)，并分別設置了“標牌”。如果在家系中證實該基因與某個標記不連鎖（重組率為50%），表明該基因不在這一標記附近。如果發(fā)現該基因與某個標記有一定程度的“連鎖”（重組率小于50%但大于0），表明它可能位于這個標記附近。如果該基因與某標記間不發(fā)生重組（重組率等于0），我們就推測該標記與所研究的疾病基因可能非常接近?！斑z傳圖”的建立為人類疾病相關基因的分離克隆奠定了基礎。擁有3.物理圖物理圖是指以已知核苷酸序列的DNA片段（序列標簽位點，STS）為“路標”，以堿基對（bp，kb，Mb）作為基本測量單位（圖距）的基因組圖。STS是基因組中任何單拷貝的長度在100～500bp之間的DNA序列，與核酸內切酶識別序列相關聯。物理圖主要內容是建立相互重疊連接的“相連DNA片段群”。3.物理圖得到5套以上包含相關染色體或整個基因組的DNA片段是建立STS物理圖的先決條件。然后，可以通過拼接而得STS物理圖。兩個STS標簽在基因組上靠得近，它們就會一直同時出現在DNA大片段上幾率就會小得多。得到5套以上包含相關染色體或整個基因組的DNA片段是建立ST酵母第三號染色體遺傳圖（右）和物理圖（左）的比較酵母第三號染色體遺傳圖（右）和物理圖（左）的比較4.轉錄圖人類的基因轉錄圖（cDNA圖），或者基因的cDNA片段圖，即表達序列標簽圖（EST，expressedsequencetag）是人類基因組圖的雛型。在成年個體的每一特定組織中，一般只有10%-20%的結構基因（約1-2萬個不同類型的mRNA）表達。整個人類基因組中，有1%-5%的序列編碼了蛋白質，最多可能有（5-7）萬個蛋白質編碼基因。得到了一段cDNA或一個EST，就能被用于篩選全長的轉錄本，并將該基因準確地定位于基因組上。cDNA序列具有轉錄本的特異性，代表了不同基因的信息。可以將DNA序列和cDNA序列進行比對，找出對應于cDNA的基因。4.轉錄圖收集各種細胞或組織的基因表達譜進行兩兩或多重比較，能較全面地了解哪些基因是特異性表達的。在某一細胞或組織中特異性表達的基因可能與該組織或細胞類型的生理功能有關。獲得各類組織或細胞的基因表達譜，從而給出人體200余種基本組織或不同細胞組成的人體基因圖（bodymap）。轉錄圖（基因表達譜）所提供的信息，使人們有可能系統(tǒng)地全面地從mRNA水平了解特定細胞、組織或器官的基因表達模式并解釋其生理屬性，深入認識細胞生長、發(fā)育、分化、衰老和疾病發(fā)生的機制。收集各種細胞或組織的基因表達譜進行兩兩或多重比較，能較全面地5.全序列圖人類基因組的核苷酸序列圖是分子水平上最高層次、最詳盡的物理圖。測定總長約1米、由30億個核苷酸組成的全序列是人類基因組計劃的最終目標。人類所擁有的基因位點都是相同的，不同種族、不同個體的基因差異(人類基因組的多樣性)以及“正?！迸c“疾病”基因的差異，只是同一位點上的等位基因的差異。5.全序列圖11.3其它基因組隨著測序技術的逐步成熟和測序成本的逐漸降低，近年來基因組序列數據每年呈指數形式增長。據2007年1月數據，全球已啟動2296個基因組項目，其中607個已完成，481個已公開發(fā)表基因序列。11.3其它基因組隨著測序技術的逐步成熟和測序成本的逐11.4比較基因組學及相關研究與數據庫中已知序列比較，基因組的序列可分為3類：確知其生理功能的有相匹配的蛋白質序列，但并不知道其功能的在現有數據庫中找不到任何相匹配的蛋白質序列的新基因比較基因組學的威力——根據對一種生物相關基因的認識來理解、詮釋和克隆分離另一種生物的基因。11.4比較基因組學及相關研究與數據庫中已知序列比較，基因1.基因組數據的挖掘與分析到2001年為止已經基本完成DNA序列分析的各種真核生物基因組數據的比較發(fā)現，低等真核生物如酵母、