大腸菌群及大腸桿菌檢測方法

出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法Methodforexaminationofcoliform，fecalcoliformandescherichiacoliinfoodforexportSN0169—92ZBX0900286設備和材料吸管：1mL，具O.ImL刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。2 2水浴箱：44.5±.5C。2.3 培育箱：36±1C,44.5±.5C。2.4冰箱：0?5C和-15?-20Co均質(zhì)器。乳缽和研棒。平皿：直徑90mmo0.1go顯微鏡。稀釋瓶：100mL、200mL500mL三角燒瓶及廣口瓶。玻璃珠：直徑約5mmo菌落計數(shù)器。培育基及試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白 〔LST〕肉湯?；途G乳糖膽鹽〔BGLB〕肉湯。EC肉湯。伊紅美藍瓊脂〔EMB〕o養(yǎng)分瓊脂斜面。色氨酸肉湯。MR-VP培育基。Korser氏枸椽酸鹽肉湯。結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂〔VRBA〕oButterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液。生理鹽水。革蘭氏染色液。Kovacs氏靛基質(zhì)試劑。甲基紅指示劑。Vogesproskauer〔VP〕試劑。樣品制備以無菌操作取有代表性的樣品。如有包裝則用 75%乙醇在開口處擦拭后取樣。假設不能準時檢驗，應將冷凍樣品置于-15C保存；非冷凍而易腐的食品， 于4C冰箱保存。檢驗前冷凍樣品可于以下15min內(nèi)解凍。不同食品樣品勻液的制備液體食品以滅菌吸管取樣25mL放入裝有225mL稀釋劑的滅菌玻璃瓶〔瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的玻璃珠25次〔或以機械振蕩器振搖〕1:10的樣品勻液。固體和半固體食品

2—5C18h45C〕30cm7s25g225mL稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，于

8000r/min1?2min1:10樣品勻液〔也可用滅菌乳缽研磨的方法代替〕。稀釋樣品勻液依據(jù)對樣品污染狀況的估量，用稀釋劑將樣品勻液制成一系列十倍遞增的樣品稀釋液，

10-2、10-3、10-4. 。從制備樣品勻液至稀釋完畢，全過程不得超過大腸菌群的測定MPN值的測定

15min。對每個樣品，選擇適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白1mL。將接種管置于36±1C48±2h。觀看試管的產(chǎn)氣狀況：檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生， 記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。如全部LST

〔LST〕肉湯管均未產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性；如有產(chǎn)氣者，則進一步作證明試驗。大腸菌群的證明試驗將全部產(chǎn)氣管用直徑為3mm的接種環(huán)移種到煌綠乳糖膽鹽〔BGLB〕肉湯管中。置BGLB36±1C48±2h。記錄全部BGLB肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù)。結(jié)果報告：按BGLB肉湯產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表〔B〔補充件〕〕報告每克〔毫升〕樣品中大腸菌群的MPN值。糞大腸菌群測定3mm48±2hLSTEC肉湯管中。EC30min44.5±5C24±2h。水浴箱的水平面應高于肉湯培育基液面。應以為44.5C產(chǎn)氣陽性的大腸桿菌和 44.5C不產(chǎn)氣的產(chǎn)氣腸桿菌或其他大腸菌群細菌作陽性和陰性比照。EC肉湯管的產(chǎn)氣狀況。產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗陽性；不產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗陰性。結(jié)果報告：按產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表報告每克〔毫升〕樣品中糞大腸菌群的MPN值。大腸桿菌測定6.3EC肉湯管連續(xù)培育24h，取其產(chǎn)氣管的培育物劃線接種于伊紅美藍24±2h。檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。

〔EMB〕平板，36±1C培育如有典型菌落，則從每個平板上至少挑取2個典型菌落；如無典型菌落，則從每個平板上至少挑取 2個可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到養(yǎng)分瓊脂斜面上，將斜面培育物移種到以下培育基中進展生化試驗。

36±1C18?24h。色氨酸肉湯：在36±1C培育24±2h后，力口Kovacs氏試劑0.2?0.3mL，上層消滅紅色為靛基質(zhì)陽性反響。MRVP36±1C48±2h1mL13mrtK100mm試管中，力口5%a萘酚0.6mL，40%氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結(jié)晶，振搖試管后靜置2h，如消滅伊紅色，為VP試驗陽性。將MR—VP培育物的剩余局部再培育 48h滴加5滴甲基紅溶液。如培育物變紅色，為甲基紅試驗陽性，假設變黃色則為陰性反響。Koser氏枸椽酸鹽肉湯：于36±1C96h記錄有無生長。LST30±1C48±2h，觀看試管中是否產(chǎn)氣。18h養(yǎng)分瓊脂斜面培育物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下：靛基質(zhì) MR+ + -

VP 枸椽酸鹽 鑒定〔型別〕-典型大腸桿菌-+--+-+--++-+--+-++ 典型中間型+ 非典型中間型+ 典型產(chǎn)氣腸桿菌+ 非典型產(chǎn)氣腸桿菌如消滅上表以外的生化反響類型，說明培育物可能不純，應重劃線分別，必要時做重復試驗。IMViC++--或-+--LST肉湯陽性管數(shù)查MPN表，報告每克〔毫升〕樣品中大腸桿菌MPN值。大腸菌群固體培育基測定法樣品制備同第4章。計數(shù)1mLlmL作空白比照。82245±0.5C〔VRBA〕10?15mL勻。待瓊脂凝固后，再加3?4mLVRBA掩蓋平板表層。36±C18?24h。30?1500.5mm或更大。證明VRBA10BGLB肉湯管內(nèi)，36±1C24h48h,觀看產(chǎn)氣狀況。將消滅產(chǎn)氣的肉湯管判為大腸菌群陽性。對形成菌膜的陽性管，應進展革蘭氏染色，以便排解革蘭氏陽性桿菌。結(jié)果報告經(jīng)最終證明為陽性〔8.2.5〔毫升〕樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4lmLVRBA100個典型和可疑菌落，挑取其中有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100^6/10X104/g〔mL〕=6.0M05/g〔mL〕A培育基和試劑〔補充件〕A1月桂基硫酸鹽胰蛋白 〔LST〕肉湯胰蛋白或胰酪胨〔Trypticase〕

10BGLB肉湯管，證明20g20g氯化鈉乳糖5.0g5.0g(K2HPO4)磷酸二氫鉀(KH2P04)2.75g2.75g月桂基硫酸鈉蒸餾水

0.1g1000.0mL 20mrX150mm試管中，每管10mL。121C高壓滅菌15min將各成分溶解于蒸餾水中。分裝到有倒立發(fā)酵管的pH6.8±0.2。A2(BGAB)肉湯10.0g10.0g牛膽粉(oxgall或oxbile)溶液200.0mL0.1％煌綠水溶液蒸餾水

13.3mL將蛋白胨乳糖溶于約500mL蒸餾水中，參加牛膽粉溶液200mL(將20.0g脫水牛膽粉溶于200mL蒸餾水中，pH7.0?7.5)，用蒸餾水稀釋到975mL,調(diào)pH7.40.113.3mL,用蒸餾水補足到1000mL，用棉花過濾后，分裝到20mrW150mm試管(管內(nèi)有倒立的小發(fā)酵管)10mL。121C15min。最終pH7.2±0.1。A3EC肉湯20.0g3號膽鹽或混合膽鹽乳糖 5.0g磷酸氫二鉀(KH2P04)磷酸二氫鉀(KH2P04)

1.5g4.0g1.5g氯化鈉蒸餾水

5.0g1000.0mL將以上成分溶解于蒸餾水中，分裝 16mrW150mm試管(管內(nèi)有倒立的小發(fā)酵管)，每管8mL。121C高壓滅菌15min，最終pH6.9±)。1。A4(EMB)乳糖

10.0g10.0g磷酸氫二鉀(KH2P04)瓊脂 15.0g

2.0g伊紅Y水溶性) 0.4g或2%水溶液20mL美藍0.065g或0.5%水溶液蒸餾水 1000.0mL

13mL1000mL100mL200mL，高壓滅15minpH7.1±0.2100mL5mL20%乳糖水溶液、2mL2Y水溶液和1.3mL0.5%的美藍水溶液，搖勻，冷至45?50C傾注平皿。A5養(yǎng)分瓊脂斜面瓊脂蒸餾水

3.0g5.0g15.0g1000.0mL將各成分加于蒸餾水中，煮沸溶解。分裝適宜的試管。備用。A6色氨酸肉湯胰胨或胰酪胨10.0g蒸餾水1000.0mL加熱攪拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸餾水中。分裝試管，每管A7MR-VP培育基

121C15minpH7.3±0.1。滅菌后擺成斜面5mLo121C15minpH6.9±0.2。胨7.0g葡萄糖 5.0g磷酸氫二鉀(K2HPO4)5.0g蒸餾水 1000.0mL將各成分溶于蒸餾水中，分裝試管，

121C15minpH6.9±0.2。A8Koser氏枸椽酸鹽肉湯磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4?4H2O)1.5g磷酸氫二鉀(K2HPO4)硫酸鎂(MgSO4?7H2O)(2H2O)蒸餾水 1000.0mL

1.0g0.2g3.0g將各成分溶解于蒸餾水中，分裝試管，每管A9(VRBA)

15minpH6.7±0.2。乳糖10.0g

7.0g3.0g氯化鈉 5.0g31.5g中性瓊脂

0.03g0.002g15?18g1000.0mL將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分攪拌，調(diào)至pH7.4±0.1。煮沸2min，將培育基冷45?50C傾注平板。臨用時制備，不得超過 3h。A1OButterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液貯存液磷酸二氫鉀(K2HPO4)蒸餾水 500mL

34.0glmol/L175mLpH7.21000mL貯存于冰箱。稀1.25mL，用蒸餾水稀釋至1000mL,分裝于適宜容器后，121C15min。A11生理鹽水氯化鈉蒸餾水

8.5g1000.0mL將氯化鈉溶于蒸餾水中，A12革蘭氏染色液結(jié)晶紫染色液：

121C15min。結(jié)晶紫95％乙醇

1.0g20.0mL1％草酸銨水溶液 80.OmL將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。革蘭氏碘液：碘

1.0g2.0g300.0mL沙黃0.25g

300mL。95％乙醇 10.0mL蒸餾水90.0mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。染色法將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗。滴加革蘭氏碘液，作用lmin，水洗。滴加95%乙醇脫色約15 30s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。d滴加復染液，復染lmin，水洗、待干、鏡檢。結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。A13Kovacs氏靛基質(zhì)試劑對二甲氨基苯甲醛 5.0g戊醇75.0mL鹽酸(濃) 25.0mL將對二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后漸漸參加濃鹽酸即可。A14甲基紅指示劑0.1g95%乙醇 300mL將甲基紅溶解于300mL乙醇中，加水稀釋至500mL。A15VogesProskauer(VP)試劑甲液a-萘酚 5.0g無水乙醇 100.0mL乙液氫氧化鉀 40.0g用蒸餾水加 100.OmLB使用三管法，接種量分別為0.1，0.01和0.00lg。陽性管數(shù) MPN 使用三管法，接種量分別為0.1，0.01和0.00lg。陽性管數(shù) MPN 陽性管數(shù) MPN0.10.010.0010.10.010.00100000001<320030019.11420000123069322220123026150001111236.19.2122221111232027340206.2220210219.32212803319233531003.6300231121531212011319313160123243232901301633024013224332110013329333>110000002233323121622350000223332312162235019.413222223332342012936021624411001110111237.21101157.31133333003901112301649543751112220111152033322201229315021013120331460②表內(nèi)所列檢樣