海洋細(xì)菌抗菌篩選及深海獨(dú)島枝芽胞桿菌分離鑒定

海洋細(xì)菌抗菌篩選及深海獨(dú)島枝芽胞桿菌分離鑒定

在過(guò)去的幾十年里，人們從海洋微生物中分離了許多生物活性物質(zhì)，并極大地?cái)U(kuò)展了新活性物質(zhì)的來(lái)源。Hotta等相對(duì)于陸地微生物,海洋微生物生活在非常特殊的環(huán)境中,其代謝產(chǎn)物的多樣性和代謝途徑的獨(dú)特性決定了海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物具有新穎的結(jié)構(gòu)和特異的生物活性。生活環(huán)境特殊、種類復(fù)雜等特點(diǎn)賦予海洋微生物更好的抗菌活性和產(chǎn)生更多新型抗菌活性物質(zhì)的能力作者在此從海洋微生物中篩選得到具有抗植物病原菌作用的菌株———深海獨(dú)島枝芽胞桿菌A493(VirgibacillusdokdonensisA493),對(duì)其進(jìn)行抗菌活性物質(zhì)的分離鑒定研究。1實(shí)驗(yàn)1.1微生物菌種(1)拮抗細(xì)菌指示菌:水稻黃單胞菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)、青枯假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestrispv.campestris)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovorasubsp.CarotovoraBergeyetal.)、埃希氏桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、惡臭假單胞菌KT2440(PseudomonasputidaKT2440)、熒光假單胞菌SBW25(PseudomonasfluorescensSBW25)、熒光假單胞菌Pf0-1(PseudomonasfluorescensPf0-1)、丁香假單胞菌DC3000(Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000)、黃色海假單胞菌(Pseudomonasxanthomarina)、淺黃色假單胞菌(Pseudomonasflavescens)、鹽單胞菌(Halomonassp.),其中惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌由美國(guó)農(nóng)業(yè)部根病生物防治實(shí)驗(yàn)室Weller教授提供;丁香假單胞菌DC3000由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)郭堅(jiān)華教授提供;其余菌株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心(CCAM)提供。(2)農(nóng)作物病原真菌指示菌:意大利青霉(PenicilliumitalicumWehmer)、稻梨孢菌(PyriculariaoryzaeCav.)、立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniHuhn.)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.Vasinfectum)、核盤(pán)菌[Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary]、奇異長(zhǎng)喙殼菌[Ceratocystisparadoxa(Dade)Mereau]、玉蜀黍赤霉[Gibberellazeae(Schw.)]、灰葡萄孢菌(BotrytiscinereaPers.)、玉蜀黍平臍蠕孢菌[Bipolarismaydis(NisikadoetMiyake)Shoeml]、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae),以上菌株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心(CCAM)提供。(3)海洋菌株共計(jì)411株,由中國(guó)海洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC)提供。國(guó)家海洋局第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定并提供深海獨(dú)島枝芽胞桿菌(Virgibacillusdokdonensis)A493(MC-CC1A00493)。該菌分離自東太平洋多金屬結(jié)核區(qū),采集深度4754m,站點(diǎn):ES0304。1.2材料的ndf-lpda(1)海洋細(xì)菌培養(yǎng)基(2216e):蛋白胨10g,酵母粉5g,牛肉浸粉1g,乙酸鈉1g,硝酸銨0.2g,檸檬酸鈉0.5g,檸檬酸鐵0.1g,人工海水定容至1L,pH值7.6±0.2。人工海水配方:氯化鈉19.45g,氯化鎂0.75g,硫酸鎂0.75g,氯化鈣1g,氯化鉀0.55g,碳酸氫鈉0.16g,溴化鉀0.08g,氯化鍶34mg,硼酸22mg,硅酸鈉4mg,氟化鈉2.4mg,磷酸氫二鈉8mg,氯化錳0.5mg,硫酸銅0.5mg,硫酸鋅10mg,純水定容至1L。(2)植物病原菌培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200g,蔗糖20g,蒸餾水1L。(3)細(xì)菌培養(yǎng)基(LB):胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl5g,蒸餾水1L。(4)水稻黃單胞菌培養(yǎng)基(協(xié)本氏培養(yǎng)基):馬鈴薯300g,蔗糖15g,十二水合磷酸氫二鈉2g,四水合硝酸鈣0.5g,蛋白胨5.0g,蒸餾水1L。以上均為液體培養(yǎng)基,加1.5%瓊脂粉配制相應(yīng)固體培養(yǎng)基。1.3方法1.3.1海洋抗細(xì)菌篩選1.3.1.植物病原菌保鮮以水稻黃單胞菌、意大利青霉、稻梨孢菌、灰葡萄孢菌、玉蜀黍平臍蠕孢菌、大麗輪枝菌和胡蘿卜軟腐歐文氏菌等7種植物病原菌為指示菌。水稻黃單胞菌采用協(xié)本氏液體培養(yǎng)基制作菌懸液,其它病原菌采用接瓊脂菌塊法接入帶有玻璃珠的PDA液體培養(yǎng)基中制作菌懸液。1.3.1.培養(yǎng)條件及溫度采用2216e標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基,250mL錐形瓶中裝液量為50mL,培養(yǎng)時(shí)間為48h,培養(yǎng)溫度為28℃(個(gè)別嗜熱細(xì)菌采用60℃)。1.3.1.海洋細(xì)菌抑制效果測(cè)定采用打孔平板對(duì)峙法。吸取100μL水稻黃單胞菌等懸液,均勻涂布相應(yīng)固體瓊脂培養(yǎng)基平板,然后在培養(yǎng)基上用5mm直徑打孔器均勻打孔6個(gè),挑出瓊脂塊備用。精確吸取不同海洋細(xì)菌發(fā)酵液50μL,分別加入到瓊脂平板已經(jīng)制備好的孔中,觀察抑制效果。病原細(xì)菌培養(yǎng)24h、病原真菌培養(yǎng)48h,每株菌液3組重復(fù)。1.3.1.4-抗感菌復(fù)篩選將初篩得到的潛在拮抗菌株的發(fā)酵液于4℃、8000r·min1.3.1.水稻黃單胞菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)對(duì)復(fù)篩得到的菌株進(jìn)行抗菌譜測(cè)試,抗菌測(cè)試針對(duì)數(shù)十種植物病原細(xì)菌和真菌進(jìn)行,以期發(fā)現(xiàn)具有特異抗菌譜的活性物質(zhì)。具體測(cè)試采用牛津杯法:吸取100μL水稻黃單胞菌等懸液,均勻涂布相應(yīng)固體瓊脂培養(yǎng)基平板,待涂抹均勻晾干后取2個(gè)滅菌牛津杯對(duì)稱放入平皿中,一個(gè)加入100μL無(wú)菌水作為對(duì)照,另外一個(gè)加入100μL溫度處理后的無(wú)菌發(fā)酵上清液。每組重復(fù)3次。1.3.2a493溫室的生活試驗(yàn)1.3.2.種子的處理水稻種子先用75%乙醇浸泡30s,然后用1%升汞處理15min,最后用無(wú)菌水清洗3次。在滅菌的玻璃平皿中鋪上一層滅菌濾紙,將處理好的水稻種子整齊地放置在上面,28℃保持濕潤(rùn)。待水稻種子發(fā)芽后轉(zhuǎn)入直徑20cm的裝有4000g滅菌土的盆中,每盆栽種6株。1.3.2.離心除菌準(zhǔn)備將水稻黃單胞菌采用協(xié)本氏液體培養(yǎng)基活化后,離心取菌體沉淀,無(wú)菌水稀釋至終濃度為10A493在優(yōu)化條件下,發(fā)酵成熟后,離心除菌取上清液,即得A493樣品,備用。1.3.2.保鮮劑接種病原菌采用剪葉片法接種病原菌。待水稻生長(zhǎng)到第5片葉片時(shí)用蘸有菌液的滅菌剪刀剪去第5片葉尖1cm長(zhǎng)度來(lái)接種水稻黃單胞菌。接種病原菌后第2d噴灑A493樣品1次(每盆噴灑15mL),20d后觀察實(shí)驗(yàn)情況。實(shí)驗(yàn)分為3組:(1)不接水稻黃單胞菌噴灑清水處理;(2)接水稻黃單胞菌噴灑清水處理;(3)接水稻黃單胞菌噴灑A493樣品處理。每組3盆重復(fù),共9盆,每盆6株水稻。通過(guò)比較病斑面積(L)和葉片總面積(W)來(lái)評(píng)價(jià)防治效果1.3.3重要物質(zhì)amba93的分離、精制和鑒定1.3.3.菌株活化、培養(yǎng)將保存于甘油管的A493劃線平板活化,挑取單菌落接種于裝有50mL2216e培養(yǎng)液的250mL三角瓶中,28℃、180r·min1.3.3.2.提取活性物質(zhì)取1L發(fā)酵液8000r·min1.3.3.deea-65型弱堿性陰離子交換填料第一步:采用CM-52型弱酸性陽(yáng)離子交換纖維素分離。CM-52陽(yáng)離子交換填料用pH值8.0的0.2mol·L第二步:采用DEAE-52型弱堿性陰離子交換纖維素分離。DEAE-52陰離子交換填料用pH值6.0的0.2mol·L1.3.3.活性條帶的制備第一次分離:展開(kāi)液采用甲醇∶氯仿∶濃氨水=4∶2.2∶3.2,加入層析缸后預(yù)飽和30min。點(diǎn)樣位置距離硅膠板下層1cm處,展開(kāi)劑展開(kāi)3h,通過(guò)0.3%水合茚三酮(0.3g茚三酮,97mL正丁醇,3mL乙酸)顯色得到分離的各個(gè)條帶。經(jīng)過(guò)大量點(diǎn)板收集條帶,分別切膠后用甲醇溶解回收,然后用氮?dú)獯蹈杉状?用水溶解,測(cè)試活性。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。第二次分離:將第一次分離得到的活性條帶濃縮制樣。展開(kāi)液采用正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶1,加入層析缸后預(yù)飽和30min。點(diǎn)樣位置距離硅膠板下層1cm處,展開(kāi)劑展開(kāi)7h,通過(guò)0.3%水合茚三酮顯色得到分離的各個(gè)條帶。經(jīng)過(guò)大量點(diǎn)板收集條帶,分別切膠后用甲醇溶解回收,然后用氮?dú)獯蹈杉状?用水溶解,測(cè)試活性。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.3.3.5.苯磺酸固相萃取、柱凈化將SupelcleanLC-SAX型固相萃取小柱先后用5mL甲醇和5mL水清洗,然后用20mL0.03mol·L1.3.3.不同ph值的正丁醇和6%對(duì)甲基苯磺酸縮合物的制備采用Doskochilova溶劑系統(tǒng):(1)用水飽和的正丁醇;(2)用水飽和的正丁醇,內(nèi)含2%對(duì)甲基苯磺酸;(3)正丁醇∶醋酸∶水=2∶1∶1;(4)用水飽和的正丁醇,內(nèi)含2%六氫吡啶;(5)pH值7.0的0.5mol·L(6)用正丁醇飽和的水,內(nèi)含2%對(duì)甲基苯磺酸;(7)苯∶甲醇=4∶1,濾紙用pH值7.0的0.5mol·L(8)75%甲醇,25%水(內(nèi)含3%NaCl),濾紙用5%硫酸鈉處理。取樣品10μL點(diǎn)至距濾紙條(1cm×20cm)下端1cm處,在密閉的層析缸(35cm×15cm×20cm)中上行擴(kuò)展,溶劑擴(kuò)展18cm后停止層析。溶劑10mL,濾紙使用前先用展開(kāi)劑飽和30min。采用生物顯影法測(cè)試抑菌位置1.3.3.準(zhǔn)分子離子檢測(cè)通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器吸入10μL樣品,然后用C檢測(cè)方法:用雙蒸水溶解精制樣品,導(dǎo)入ESI離子源,先用一級(jí)全掃描質(zhì)譜方式獲得樣品的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]2結(jié)果與討論2.1選拔結(jié)果2.1.1海洋細(xì)菌對(duì)發(fā)酵液中的抗性菌株的篩選通過(guò)以水稻黃單胞菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌、大麗輪枝菌、意大利青霉、稻梨孢菌、灰葡萄孢菌、玉蜀黍平臍蠕孢菌等7種植物病原菌為指示菌進(jìn)行初篩,獲得發(fā)酵液具有抗性的海洋菌株共81株,占篩選的海洋細(xì)菌總數(shù)的19.7%。對(duì)各病原菌的抗性菌株數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知,411株海洋細(xì)菌中對(duì)玉蜀黍平臍蠕孢菌具有抗性的菌株較多,篩得率為12.2%;而對(duì)意大利青霉具有抗性的菌株較少,篩得率為6.2%;其它菌的抗性菌株篩得率在8.3%~9.9%之間。2.1.2海洋細(xì)菌感染情況復(fù)篩結(jié)果顯示,只有7株海洋細(xì)菌的無(wú)菌發(fā)酵上清液還表現(xiàn)出抑菌活性,占篩選總數(shù)的1.7%,這說(shuō)明大部分抗性菌株可能是通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、活性物質(zhì)含量過(guò)低、持續(xù)性分泌不穩(wěn)定活性物質(zhì)等方法來(lái)達(dá)到抗菌目的;且411株海洋細(xì)菌無(wú)菌發(fā)酵上清液對(duì)大麗輪枝菌、意大利青霉、灰葡萄孢菌均無(wú)活性。7株海洋細(xì)菌中:A018是海洋死谷芽孢桿菌(Bacillusvallismortis)、A019、A142、A206是海洋枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、A178是海洋Lysinibacillus屬細(xì)菌(Lysinibacillussp.)、A397是海洋莫哈韋芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)、A493是海洋獨(dú)島枝芽胞桿菌(Virgibacillusdokdonensis)。它們的抑菌效果見(jiàn)表2。2.1.3對(duì)病原細(xì)菌和真菌的抗性抗菌譜測(cè)定實(shí)驗(yàn)從7株復(fù)篩菌中發(fā)現(xiàn)了一株抗菌譜特異的菌株A493(MCCC1A00493)。菌株A493無(wú)菌發(fā)酵上清液的抑菌效果見(jiàn)圖1。由圖1可知,菌株A493對(duì)陸地來(lái)源水稻黃單胞菌抑制效果最好,對(duì)海洋來(lái)源淺黃色假單胞菌和鹽單胞菌也具有一定的抗性。測(cè)定A493對(duì)病原細(xì)菌和病原真菌的抗菌譜,見(jiàn)表3。由表3可知,A493產(chǎn)活性抗菌物質(zhì)對(duì)陸地來(lái)源水稻黃單胞菌和野油菜黃單胞菌的抗性較強(qiáng),對(duì)海洋來(lái)源黃色海假單胞菌、淺黃色假單胞菌和鹽單胞菌具有一定的抗性;對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌、埃希氏桿菌、金黃色葡萄球菌、熒光假單胞菌、丁香假單胞菌和惡臭假單胞菌無(wú)抗性。由表3還可知,A493產(chǎn)活性抗菌物質(zhì)對(duì)所測(cè)試的真菌均無(wú)抗性。表明A493是一種窄譜的拮抗菌,其抗菌譜具有特異性。2.2對(duì)水稻白葉枯病害的防治作用菌株A493對(duì)水稻白葉枯病害的生防效果見(jiàn)表4。由表4可知,水稻生長(zhǎng)20d后A493無(wú)菌發(fā)酵上清液對(duì)水稻白葉枯病害防治效果達(dá)到了66.7%;接病原菌對(duì)照100%發(fā)病;不接病原菌對(duì)照生長(zhǎng)良好。2.3重要物質(zhì)amba93的分離、精制和鑒定2.3.1不同濃度紫外分光光度對(duì)黃單胞菌抑制活性的影響經(jīng)過(guò)前處理的樣品先通過(guò)纖維素型陽(yáng)離子交換填料CM-52提純,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可看出,220nm紫外檢測(cè)波長(zhǎng)下共有5個(gè)峰出現(xiàn),分別收集,真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后測(cè)試其對(duì)水稻黃單胞菌的抑制活性。結(jié)果顯示只有最早出現(xiàn)的A峰物質(zhì)具有抑菌效果。2.3.2不同真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮對(duì)黃單胞菌的抑制活性由圖3可知,220nm紫外檢測(cè)波長(zhǎng)下共有2個(gè)峰出現(xiàn),分別收集,真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后測(cè)試其對(duì)水稻黃單胞菌的抑制活性。結(jié)果顯示只有B峰物質(zhì)具有抑菌效果。2.3.3薄層層析方法將離子交換法分離收集的活性樣品旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥,用一定量甲醇溶液溶解,按1.3.3.4方法進(jìn)行薄層層析。第一次分離結(jié)果顯示,有4條主要條帶(圖4A),測(cè)試抑菌活性發(fā)現(xiàn),只有條帶d具有活性,R再將有活性的條帶d濃縮制樣進(jìn)行第二次分離。結(jié)果顯示有4條主要條帶(圖4B),測(cè)試抑菌活性發(fā)現(xiàn),只有條帶I具有活性,R2.3.4測(cè)活性測(cè)試分別將各洗脫溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用水溶解,測(cè)試活性。結(jié)果顯示,用30mLpH值7.0的純水就可以將活性物質(zhì)完全洗脫,進(jìn)一步去除了雜質(zhì)。2.3.5活性物質(zhì)的初步篩選按照Doskochilova系統(tǒng)方法進(jìn)行紙層析,通過(guò)生物顯影法,測(cè)定抗菌活性物質(zhì)在8種溶劑系統(tǒng)中的展開(kāi)距離,計(jì)算R由圖5可看出,A493產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)與鏈霉素的紙層析圖譜(圖5A中圈中部分)最為相似,結(jié)合其強(qiáng)極性且可以被水合茚三酮染色顯淡黃色的性質(zhì),初步推斷為氨基糖苷類抗生素。2.3.5電噴霧質(zhì)量分析圖6由圖6可看出,在一級(jí)全掃描的情況下,獲得了樣品的[M+H]2.4水稻黃單胞菌的抗菌譜和抗菌材料的制備以多種植物病原菌為指示菌,對(duì)411株海洋菌株進(jìn)行了抗菌篩選。通過(guò)對(duì)水稻黃單胞菌等植物病原菌進(jìn)行篩選,初篩獲得具有抗性的海洋菌株共81株,占篩選的海洋細(xì)菌總數(shù)的19.7%;復(fù)篩獲得具有抗性的海洋菌株只有7株,占篩選總數(shù)的1.7%。造成這種結(jié)果的原因可能是由于菌株的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、持續(xù)性分泌不穩(wěn)定抗菌活性物質(zhì)、活性物質(zhì)含量過(guò)低等因素導(dǎo)致的。通過(guò)高通量篩選獲得一株分離自東太平洋深海多金屬結(jié)核區(qū)的深海獨(dú)島枝芽胞桿菌(V.dokdonensis)A493。無(wú)菌發(fā)酵上清液抗菌譜測(cè)定顯示其對(duì)陸地來(lái)源水稻黃單胞菌、野油菜黃單胞菌以及一些海洋來(lái)源黃色海假單胞菌、淺黃色假單胞菌、鹽單胞菌具有抗性;對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌、埃希氏桿菌、金黃色葡萄球菌、熒光假單胞菌、丁香假單胞菌和惡臭假單胞菌以及測(cè)試的真菌均無(wú)抗性。表明其具有特異的抗菌譜。通過(guò)陰、陽(yáng)離子交換色譜法粗提取、2次薄層層析硅膠板回收分離,得到純化活性物質(zhì),經(jīng)過(guò)ESI-MS本研究通過(guò)Doskochilova系統(tǒng)紙層析分析,結(jié)果顯示活性物質(zhì)為氨基糖苷類物質(zhì),一般的氨基糖苷類抗生素,例如慶大霉素、卡那霉素、核糖霉素、新霉素、巴龍霉素