念珠藻屬及其近緣類別her基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

念珠藻屬及其近緣類別her基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

慈海藻類是重要的綠藻和綠細(xì)菌之一。該屬物種是一類不分枝、具有異形胞且能進(jìn)行光合作用的絲狀固氮藍(lán)藻。由于其屬于古老且多樣化的原核生物群，同時(shí)能忍受多種極端環(huán)境，因此在全世界的各種生境中分布廣泛異形胞(heterocyst)是由一些絲狀藍(lán)藻的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞分化出來(lái)的一種特殊細(xì)胞。在固氮酶的催化下，異形胞可把大氣中的N物種在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮重要功能的蛋白質(zhì)可能會(huì)受到較強(qiáng)烈的選擇壓力。遺傳水平上適應(yīng)性進(jìn)化的剖析及關(guān)鍵功能位點(diǎn)和氨基酸結(jié)構(gòu)的識(shí)別，可為探索植物進(jìn)化的奧秘提供證據(jù)，還能更加深刻地了解基因結(jié)構(gòu)和功能的變異本研究以念珠藻屬植物及其近緣類群的hetR基因序列為對(duì)象，采用位點(diǎn)模型、分支模型和分支-位點(diǎn)模型對(duì)念珠藻屬hetR基因進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化分析，探討環(huán)境壓力下念珠藻屬植物HetR是否有正選擇發(fā)生，以期為深入開展念珠藻屬植物的分子進(jìn)化研究奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1基因序列的原位排列本研究共測(cè)定了31株念珠藻屬植物hetR基因的序列(表1)，將所測(cè)序列和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(/)中的基因序列進(jìn)行對(duì)位排列。采用MEGA6.06軟件1.2位點(diǎn)模型檢測(cè)hets基因的正選擇和負(fù)選擇位點(diǎn)以構(gòu)建的最大似然樹為本原數(shù)據(jù)，運(yùn)行PAML4.9軟件包分支模型中，主要使用單比率模型、自由比率模型和二比率模型進(jìn)行檢測(cè)。位點(diǎn)模型中，主要檢測(cè)hetR基因的正選擇和負(fù)選擇位點(diǎn)存在與否，如果ω>1，說(shuō)明存在正選擇位點(diǎn);如果ω<1，則不存在正選擇位點(diǎn)。采用的3對(duì)比較模型分別為:M1a和M2a、M0和M3、M7和M8。然后按照χ1.3維結(jié)構(gòu)建模從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(/)中選取代表物種普通念珠藻(Nostoccommune)。以其hetR基因序列(GenBank登錄號(hào):AP018326)為參比序列，翻譯成氨基酸序列后提交瑞士生物信息研究所網(wǎng)站(Europeanbioinformaticsinstitute,/)，利用在線軟件Swiss-model，基于同源建模原理來(lái)預(yù)測(cè)HetR蛋白的三維結(jié)構(gòu)。將用于建模的AP018326序列和鑒定出正選擇位點(diǎn)的HetR蛋白對(duì)應(yīng)的氨基酸序列放入BioEdit軟件2結(jié)果與分析2.1r基因序列構(gòu)建ml系統(tǒng)發(fā)育樹本研究用于hetR基因序列分析的藍(lán)藻共有51株，選擇集胞藻(Synechocystissp.PCC6803)為外類群。經(jīng)ModelTest軟件計(jì)算結(jié)果，采用念珠藻hetR基因序列構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹的最優(yōu)進(jìn)化模型為GTR+I+G。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示(圖1)，本研究測(cè)定序列的念珠藻和中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)(以下簡(jiǎn)稱:淡水藻種庫(kù))保存的2株念珠藻聚為4個(gè)大的分支A～D。其中，A分支包含25株本研究所測(cè)定的念珠藻(E、F、G3個(gè)小分支ω值均大于1);B分支包含1株與蘇鐵(Cycas)共生的念珠藻;C分支包含2株淡水藻種庫(kù)保存的念珠藻;D分支包含3株未能定種的念珠藻。因此，選擇含有本研究測(cè)定的和淡水藻種庫(kù)保存的念珠藻所在的分支，并以這6個(gè)分支進(jìn)一步進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化分析。2.2接枝型het基因的分化適應(yīng)性進(jìn)化分析中各模型選擇位點(diǎn)的鑒定結(jié)果見表2和表3。分支模型中，二比率模型指定A～D4個(gè)分支為前景支，其他是背景支。前景支C的ω估計(jì)值為16.49504，表明此分支可能存在正選擇位點(diǎn);前景支A、B、D的ω估計(jì)值均小于1，表明大多數(shù)分支均處于負(fù)選擇壓力下。自由比率模型中，檢測(cè)到大多數(shù)分支ω值遠(yuǎn)小于1，僅有3個(gè)小分支的ω值大于1(CHAB2802分支的ω值為1.3454,CHAB2815和CHAB2823分支的ω值為999.0000)，因此對(duì)這3個(gè)分支進(jìn)行了分支-位點(diǎn)模型檢測(cè)。對(duì)分支模型中二比率模型A～D以及自由比率模型H進(jìn)行LRT檢驗(yàn)(表2)，結(jié)果表明各分支后驗(yàn)概率均不具有可靠性。位點(diǎn)模型中，模型M3(離散)、M2a(選擇)和M8(β&ω)允許ω值>1，與其對(duì)應(yīng)的零假設(shè)模型為M1a(近中性)模型、M0(單一比值)模型和M7(β)模型。經(jīng)LRT檢驗(yàn)，M3模型顯著優(yōu)于M0零假設(shè)模型(P<0.01)，表明各位點(diǎn)間經(jīng)受的選擇壓力具有差異性。在位點(diǎn)模型中均沒有檢測(cè)出正選擇位點(diǎn)，表明hetR基因處于強(qiáng)烈負(fù)選擇壓力下。分支-位點(diǎn)模型中，指定7個(gè)分支為前景支，其中分支E的序列代號(hào)為CHAB2802，分支F為CHAB2815，分支G為CHAB2823。在分支A檢測(cè)出95K(后驗(yàn)概率為88.6%)、分支B檢測(cè)出43E(后驗(yàn)概率為55.7%)、分支C檢測(cè)出45Y(后驗(yàn)概率為64.9%)和81V(后驗(yàn)概率為74.1%)、分支D檢測(cè)出40V(后驗(yàn)概率為53.4%)、分支E檢測(cè)出126T(后驗(yàn)概率為99.7%)、分支F檢測(cè)出11E(后驗(yàn)概率為98.2%)、分支G檢測(cè)出71L(后驗(yàn)概率為98.4%)為正選擇位點(diǎn)。但經(jīng)似然比檢驗(yàn)，僅分支E的后驗(yàn)概率小于0.05，支持其檢測(cè)出正選擇位點(diǎn)的結(jié)論;其余分支不可靠，拒絕其存在正選擇位點(diǎn)。2.3維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)本研究基于同源建模原理，對(duì)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast搜索，發(fā)現(xiàn)普通念珠藻與Fischerella屬藻類(PDBID:4J00)HetR蛋白的結(jié)構(gòu)相似度高達(dá)92.36%，滿足同源建模的可靠性條件。基于此來(lái)預(yù)測(cè)HetR蛋白的三維結(jié)構(gòu)。經(jīng)對(duì)位排列(圖2)，確定被檢測(cè)出的正選擇位點(diǎn)的相對(duì)位置。在HetR蛋白三維預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)中標(biāo)示出正選擇位點(diǎn)(圖3)。3分工-位點(diǎn)模型檢測(cè)正選擇位點(diǎn)念珠藻屬是藍(lán)藻門中極其重要的類群，它可以分化出異形胞固定大氣中的氮?dú)狻etR基因是念珠藻異形胞分化和厚壁孢子形成中的關(guān)鍵基因。這提示HetR在念珠藻細(xì)胞分化過(guò)程中是重要的調(diào)控因子，而不僅局限于異形胞的分化過(guò)程。由于各模型中正選擇/負(fù)選擇位點(diǎn)判斷的統(tǒng)計(jì)方法的進(jìn)一步改進(jìn)，對(duì)基因序列正選擇作用重要位點(diǎn)的研究已成為熱點(diǎn)當(dāng)基因經(jīng)受正選擇時(shí)，表明該物種與環(huán)境中某關(guān)鍵因素的適應(yīng)性，提示在該進(jìn)化時(shí)間點(diǎn)可能產(chǎn)生一些蛋白新功能;而當(dāng)基因處于強(qiáng)烈負(fù)選擇時(shí)，則意味著該物種的蛋白質(zhì)保持原有的重要功能且趨于穩(wěn)定本研究分支-位點(diǎn)模型的檢驗(yàn)結(jié)果表明，分支A～G均檢測(cè)出正選擇位點(diǎn)，但經(jīng)似然比檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)僅有分支E(CHAB2802)的后驗(yàn)概率小于0.05，支持其檢測(cè)出正選擇位點(diǎn)的結(jié)論。其余分支不可靠，拒絕其存在正選擇位點(diǎn)。Zhang本研究采用分支模型、位點(diǎn)模型以及分支-位點(diǎn)模型對(duì)念珠藻屬hetR基因的選擇位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)藻株未發(fā)現(xiàn)正選擇位點(diǎn)，說(shuō)明