瑞替普酶在乳酸乳球菌中的表達(dá)及溶栓活性

瑞替普酶在乳酸乳球菌中的表達(dá)及溶栓活性

r-73？這是一個(gè)短的突變體。這是一個(gè)帶緩沖液和非糖基化的蛋白質(zhì)。這是tpa的兩個(gè)區(qū)域和s區(qū)域，這些區(qū)域可以激活纖維酶原的生物活性。rpa屬于第三代溶菌酶，具有長體內(nèi)半衰期、高溶菌酶活性和低副作用等優(yōu)點(diǎn)。目前,科研工作者已經(jīng)在多種表達(dá)系統(tǒng)中對(duì)rPA的重組表達(dá)進(jìn)行研究,但其效果均不甚理想:大腸桿菌細(xì)胞壁脂多糖是藥品內(nèi)毒素的主要來源,rPA單劑用量通常又是其他重組蛋白如rhGCSF、INFa2b的30倍以上,因而對(duì)rPA大腸桿菌重組產(chǎn)品的純度及內(nèi)毒素控制要求非常高.這造成生產(chǎn)后期純化工藝復(fù)雜,藥物成本增加乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB)是公認(rèn)對(duì)人體安全的(generallyregardassafe,GRAS)食品級(jí)微生物.利用乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)蛋白質(zhì)多肽類藥物可以有效提高產(chǎn)品的安全性,并可以一定程度上簡化后期純化工藝.為建立rPA的乳酸菌表達(dá)系統(tǒng),本研究將rpa基因亞克隆至乳酸菌表達(dá)質(zhì)粒pCYT.同時(shí),為了提高rPA在乳酸菌NZ9000中的穩(wěn)定性,將rPA與葡萄球菌(Staphylococcal)耐熱核酸酶(nuclease,Nuc)進(jìn)行了融合表達(dá),為rPA的基因工程生產(chǎn)提供了新的思路與研究基礎(chǔ).1材料和方法1.1蘑菇和顆粒EscherichiacoliDH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存,質(zhì)粒pET22b-rpa為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建1.2培養(yǎng)基的制備LB液體培養(yǎng)基:稱取胰蛋白胨10,g、酵母提取物5,g、NaCl10,g,加入800,mL去離子水溶解,調(diào)pH至7.4,定容至1,L.121,℃高壓蒸汽滅菌20,min.GM17液體培養(yǎng)基:稱取M17培養(yǎng)基42.3,g、葡萄糖5,g,加入800,mL去離子水溶解,調(diào)pH至7.4,定容至1,L.115,℃高壓蒸汽滅菌20,min.恢復(fù)培養(yǎng)基:稱取M17培養(yǎng)基42.3,g、葡萄糖5,g、MgCl24.07,g、CaCl20.22,g,加入800,mL去離子水溶解,調(diào)pH至7.4,定容至1,L.115,℃高壓蒸汽滅菌20,min.EscherichiacoliDH5α,用LB液體培養(yǎng)基,37,℃、200,r/min振蕩培養(yǎng);LactococcuslactisNZ9000用GM17液體培養(yǎng)基,30,℃靜置培養(yǎng).氯霉素的使用質(zhì)量濃度為10,μg/mL.1.3試劑與標(biāo)準(zhǔn)品限制性內(nèi)切酶NsiⅠ、HindⅢ、SalⅠ、T4,DNA連接酶、RNase-FreeDNaseI,Fermentas公司;PfuDNA聚合酶、DNA回收試劑盒,康為試劑公司;EasyTaqDNA聚合酶,全式金生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒,索來寶公司;Nisin,Sigma公司;M17培養(yǎng)基,青島海博公司;RNA提取試劑盒,Invitrogen公司;RNA酶抑制劑,上海生工生物工程有限公司;tPA抗體,abcam公司;rPA標(biāo)準(zhǔn)品,中國食品藥品檢定研究院;實(shí)驗(yàn)所用其他試劑為市售國產(chǎn)分析純?cè)噭?紫外可見光分光光度計(jì),Thermo公司;電擊轉(zhuǎn)化儀、蛋白質(zhì)電泳裝置,BioRad公司.1.4pcr擴(kuò)增表達(dá)以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET22b-rpa為模板,根據(jù)rpa基因序列和pCYT上多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,引物信息見表1.以質(zhì)粒p22b-rpa為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增rpa基因.其中pCYT-rpa的構(gòu)建以P1、P2(下劃線分別為:NsiⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn))為引物,PCR反應(yīng)條件為:94,℃預(yù)變性5,min,94,℃變性45,s,60,℃退火45,s,72,℃延伸2,min,共循環(huán)30次,72,℃延伸10,min.將PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pCYT分別用限制性內(nèi)切酶NsiⅠ和HindⅢ雙酶切后(pCYT上原有的nuc標(biāo)簽將被切除),通過瓊脂糖膠電泳純化,經(jīng)T4連接酶16,℃連接.pCYT-nuc-rpa的構(gòu)建以P3、P4(下劃線分別為:HindⅢ和SalⅠ酶切位點(diǎn))為引物,PCR反應(yīng)條件與上述條件相同,擴(kuò)增獲得目的基因rpa.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,涂布于含10,μg/mL氯霉素的LB平板,37,℃培養(yǎng)12,h.次日挑取單菌落增菌,提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后電泳鑒定,送至Invitrogen公司測序.1.5菌株的誘導(dǎo)誘導(dǎo)誘導(dǎo)誘導(dǎo)表達(dá)將測序正確的重組質(zhì)粒pCYT-rpa和pCYT-nuc-rpa(圖1)電轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株乳酸乳球菌NZ9000的感受態(tài)細(xì)胞,電轉(zhuǎn)化條件為:電壓2,000,V、電容25,μF、電阻200,?,電擊后迅速加入1,mL恢復(fù)培養(yǎng)基,30,℃恢復(fù)培養(yǎng)2,h,涂布于含10,μg/mL氯霉素的GM17固體平板,30,℃厭氧培養(yǎng)48,h.挑取單菌落,進(jìn)行PCR驗(yàn)證.將含有目的基因的重組菌30,℃厭氧過夜培養(yǎng),第2天以4%的接種量轉(zhuǎn)接于10,mLGM17液體培養(yǎng)基中,30,℃靜置培養(yǎng)至A1.6r-pcr分析rpa基因的發(fā)現(xiàn)1.6.1逆轉(zhuǎn)錄pcr檢測rna離心收集3,mL誘導(dǎo)后的菌體,用滅過菌的TE緩沖液洗滌3次,最后用200,μLTE緩沖液吹懸菌體,加入終質(zhì)量濃度為20,mg/mL的溶菌酶,37,℃水浴30,min.每管加入0.5,mLTrizol,室溫放置10,min,使其充分裂解,然后輕輕吹勻.每管加入100,μL冰冷的氯仿,手動(dòng)顛倒2,min,室溫放置5,min.4,℃、13,000,r/min離心15,min.吸取上層水相至另一個(gè)EP管中.每管加入250,μL冰冷的異丙醇,上下晃動(dòng)2,min,冰上放置10,min,-20,℃放置1,h,沉淀RNA.4,℃、13,000,r/min離心10,min.RNA沉于EP管底部,輕輕棄去上清液.加入500,μL體積分?jǐn)?shù)為75%的冰冷乙醇,劇烈振蕩EP管以懸浮沉淀,4,℃、13,000,r/min離心10,min.輕輕棄去上清液,打開EP管,室溫放置10,min,使殘余的乙醇揮發(fā).每管加入20,μLDEPC處理過的水溶解RNA樣品,60,℃放置10,min.將提取的RNA經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)測定濃度后,加入RNase-FreeDNaseⅠ于37,℃消化30,min后,利用隨機(jī)六聚體引物,經(jīng)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA.1.6.2rt-pcr檢測乳酸菌nz2005依據(jù)rpa基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物rpa-RTF和rpa-RTR;以L.lactisNZ9000的16SrRNA作為RT-PCR反應(yīng)的內(nèi)參基因,上游和下游引物分別為16SF和16SR(表1).RT-PCR反應(yīng)體系為:EasyTaqbuffer(10×)2.5,μL,dNTP1.0,μL,上游和下游引物(10,μmol/L)各0.25,μL,cDNA模板1.0,μL,EasyTaqDNA聚合酶(5,U/μL)0.25,μL,Nuclease-Freewater19.25,μL,總計(jì)25.0,μL.優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件為:94,℃預(yù)變性5,min,94,℃變性45,s,56,℃退火45,s,72,℃延伸20,s,30個(gè)循環(huán),72,℃延伸10,min.所有待測樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù),并用Nuclease-Freewater代替模板作為陰性對(duì)照,以乳酸菌NZ9000的16SrRNA作為RT-PCR的內(nèi)參基因.1.7蛋白凝膠的轉(zhuǎn)發(fā)離心收集5,mL誘導(dǎo)后的菌體,用PBS洗滌3次,最后用1,mLPBS重懸菌體,然后進(jìn)行超聲破碎.取等量超聲破碎液進(jìn)行SDS分析.SDS結(jié)束后,將凝膠中的蛋白經(jīng)半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印至NC膜上;轉(zhuǎn)印結(jié)束后將NC膜浸于質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂乳溶液中進(jìn)行封閉,室溫靜置封閉1,h;TBST洗去脫脂乳,用tPA兔源單克隆抗體作為第一抗體進(jìn)行封閉(一抗稀釋比例為1∶800),4,℃過夜放置;TBST洗3次,每次10,min;辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為第二抗體(二抗稀釋比例為1∶5,000),避光封閉1,h,TBST洗3次,每次10,min.利用Odyssey1.8單次給藥后rpa及去蛋白活性的檢測將菌體破碎液離心后取沉淀,經(jīng)洗滌液(3,mol/L尿素,體積分?jǐn)?shù)0.6%的TritonX-100,50,mmol/LTris-HCl,2,mmol/LEDTA,pH8.0)于搖床4,℃洗滌1,h,10,000,r/min離心20,min,取沉淀.然后用變性液(8,mol/L尿素,100,mmol/LGSH,50,mmol/LTris-HCl,pH8.0)吹懸,于100,r/min搖床,25,℃變性2,h,10,000,r/min離心20,min取上清液.向上清液中加入等體積的50,mmol/LTris-HCl將尿素濃度稀釋至4,mol/L,然后加到透析袋中,于復(fù)性液(50,mmol/LTris-HCl,20,mmol/L咪唑,300,mmol/LNaCl,2,mol/L尿素,3,mmol/LGSH,0.6,mmol/LGSSG,pH8.0)中4,℃過夜進(jìn)行透析復(fù)性.最后,采用目前使用最廣泛的纖溶活性篩選方法——纖維蛋白平板法對(duì)樣品的溶栓活性進(jìn)行分析.取100,μL復(fù)性后的rPA及Nuc-rPA蛋白樣品,分別點(diǎn)加于纖維蛋白板上,37,℃放置12,h進(jìn)行溶栓活性分析2結(jié)果2.1重組基因rpa表達(dá)載體的確定pCYT-rpa和pCYT-nuc-rpa陽性克隆子經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)、提取質(zhì)粒后,用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,酶切結(jié)果均可看到大小約1,100,bp的片段(圖2和圖3),與預(yù)期片段大小一致,進(jìn)一步通過序列測定,確認(rèn)了目的基因rpa正確克隆到pCYT表達(dá)載體中,并具有正確的讀碼框.2.2rpa在重組l.lactisnz9000中的轉(zhuǎn)錄水平分析將提取的乳酸菌RNA逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA進(jìn)行RT-PCR,結(jié)果如圖4所示.由圖4可知:與L.lactisNZ9000/pCYT相比,rpa重組菌L.lactisNZ9000/pCYT-rpa和L.lactisNZ9000/pCYT-nuc-rpa中可檢測到rpamRNA,表明外源基因rpa在兩種重組菌中能夠有效被轉(zhuǎn)錄.2.3小鼠造林后目的蛋白表達(dá)量的比較將提取的乳酸菌菌體蛋白進(jìn)行Westernblot及Quantityone半定量分析,結(jié)果如圖5所示.由圖5可知:目的蛋白rPA和Nuc-rPA在兩種重組乳酸乳球菌中均得到了有效的表達(dá),相對(duì)分子質(zhì)量分別為3.9×104和5.3×104,與預(yù)測的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量一致.對(duì)比兩種菌株在誘導(dǎo)1,h和誘導(dǎo)2,h時(shí)的蛋白表達(dá)量可知:在L.lactisNZ9000/pCYT-rpa菌株中,目的蛋白rPA在誘導(dǎo)2,h時(shí)比誘導(dǎo)1,h時(shí)表達(dá)量減少;而融合了Nuc的菌株L.lactisNZ9000/pCYT-nuc-rpa,誘導(dǎo)2,h時(shí)的目的蛋白Nuc-rPA與1,h的相比表達(dá)量增加,說明融合表達(dá)Nuc可降低胞內(nèi)酶對(duì)rPA的降解,提高了rPA的穩(wěn)定性.2.4rpa及rpa/pa溶栓活性測定將復(fù)性后的rPA和Nuc-rPA點(diǎn)加于纖維蛋白