色瑞替尼對(duì)精子制動(dòng)作用和機(jī)制的初步研究

色瑞替尼對(duì)精子制動(dòng)作用和機(jī)制的初步研究

精神障礙的調(diào)節(jié)已成為影響妊娠和不育以及安全防止生殖健康的重要課題。隨著社會(huì)工業(yè)化程度的提高和環(huán)境污染的加重,不孕不育率顯著增加。我國(guó)不孕不育率已高達(dá)15%~20%,其中與男性因素相關(guān)的約占50%。男性不育的主要原因是精子數(shù)量的減少和質(zhì)量的下降。另一方面,如何安全避孕也是全球性的問(wèn)題。目前,主要是女性負(fù)擔(dān)了避孕的重任,而男性?xún)H可采用性交中斷(體外排精)、避孕套(陰莖套)和輸精管絕育術(shù)。調(diào)查顯示,男性可以也愿意承擔(dān)更多的責(zé)任。不論男性還是女性,對(duì)男性避孕藥的態(tài)度都相當(dāng)積極我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)翻譯后修飾如乙?；?、磷酸化等對(duì)精子功能調(diào)控有重要作用,在此基礎(chǔ)上針對(duì)性地從化合物庫(kù)中篩選出一系列乙酰化、磷酸化相關(guān)的抑制劑且具有顯著的調(diào)控精子功能活性的非激素類(lèi)作為候選化合物。其中色瑞替尼(ceritinib)對(duì)人精子運(yùn)動(dòng)抑制效應(yīng)非常明顯,表現(xiàn)為20s內(nèi)使所有精子失去運(yùn)動(dòng)活性所需的藥物最小濃度(minmaleffectiveconcentration,MEC)比經(jīng)典的殺精藥物壬苯醇醚(nonoxynol-9,N-9)還要低3倍左右。色瑞替尼是治療間變性淋巴瘤激酶-陽(yáng)性轉(zhuǎn)移且對(duì)克唑替尼進(jìn)展或不能耐受的非小細(xì)胞肺癌患者的二線(xiàn)藥物,2014年獲美國(guó)FDA加速審批程序批準(zhǔn)上市。FDA的研究報(bào)告了色瑞替尼導(dǎo)致孕鼠少量胚胎發(fā)育異常,但推薦劑量下用猴、大鼠進(jìn)行的毒理學(xué)研究未發(fā)現(xiàn)其對(duì)雄性和雌性生殖器官有不良效應(yīng)材料和方法主要試劑及儀器色瑞替尼(美國(guó)Selleck公司)溶解在DMSO(美國(guó)Sigma公司)中制備成10mmol/L儲(chǔ)液;N-9(西安瑞聯(lián)生物技術(shù)有限公司)溶解在超純水中制備成40mg/mL儲(chǔ)液;精子細(xì)胞BWW培養(yǎng)液(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為BWW培養(yǎng)液)按WHO第5版配方配制,所需試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;LIVE/DEAD精子存活測(cè)定試劑盒(L-7011,美國(guó)Invitrogen公司);細(xì)胞增殖分析試劑盒(CCK-8,上海同仁藥業(yè)股份有限公司);角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);計(jì)算機(jī)輔助精液分析(computerassistantspermanalysis,CASA,HTM-TOXIVOS版本12.3A)系統(tǒng)為瑞士漢密爾頓有限公司產(chǎn)品;掃描電子顯微鏡(Quanta250FEG,荷蘭FEI公司);高級(jí)濺射鍍膜儀(LeicaEMSCD050,上海電子光學(xué)技術(shù)研究所);透射電子顯微鏡CM120(荷蘭Philips公司)。流式細(xì)胞儀(AccuriC6,美國(guó)BD公司);酶標(biāo)儀(ELx800,美國(guó)BioTek公司);倒置相差顯微鏡(DMi1,德國(guó)Leica公司);激光共聚焦顯微鏡(A1R,日本Nikon公司)。細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)基VK2/E6E7陰道上皮細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù);End1/E6E7宮頸細(xì)胞系、Ect1/E6E7宮頸陰道細(xì)胞系均獲贈(zèng)于南京大學(xué)。所有細(xì)胞株均采用角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng),37℃、5%CO實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)C57小鼠購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,飼養(yǎng)至8~10周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。精子制動(dòng)實(shí)驗(yàn)精液標(biāo)本的采集選取2016年3~9月就診于上海計(jì)生所醫(yī)院門(mén)診部的男性患者,年齡25~35歲,平均年齡(30.0±5.0)歲,禁欲3~8天,手淫法收集精液,選取的精液樣本應(yīng)在0.5h內(nèi)液化,精子密度≥15×10高活力精子的獲取采用精子上游法獲得高活力精子小鼠的高活力精子獲取:將小鼠以頸椎脫臼法處死,取出小鼠附睪尾部并剪開(kāi)一道小口,以鑷子擠出里面的精液放入37℃預(yù)熱的1mLBWW培養(yǎng)液中,在37℃、5%CO瞬間殺精效果測(cè)定瞬間殺精效果,即20s能夠100%制動(dòng)精子的最低藥物濃度(minimaleffectiveconcentration,MEC)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(N-9)和色瑞替尼組。室溫條件下在96孔板內(nèi)用BWW培養(yǎng)液逐孔倍比稀釋藥物,每孔為50μL。96孔板放置在37℃、5%COCASA系統(tǒng)分析化合物制動(dòng)精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)(10~20)×10精子復(fù)活試驗(yàn)選擇經(jīng)MEC色瑞替尼處理后的精子樣本,以BWW培養(yǎng)液300×g離心5min,洗滌2次去除色瑞替尼,加入0.5mLBWW培養(yǎng)液,并在37℃、5%CO低滲膨脹實(shí)驗(yàn)300×g離心5min去除精子懸液中的藥液,200μLBWW培養(yǎng)液重懸后取100μL加入1mL低滲膨脹(hypo-osmoticswelling,HOS)溶液(75mmol/L果糖,20mmol/L檸檬酸鈉)混合,置于37℃溫箱中30min。將混合液滴加在載玻片上,蓋玻片封蓋,倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)顯示特征尾部卷曲或腫脹的精子數(shù)目。精子尾部腫脹率=尾部腫脹數(shù)/精子計(jì)數(shù)的總數(shù)×100%。對(duì)照組中有60%以上的精子出現(xiàn)尾部腫脹,則認(rèn)為HOS實(shí)驗(yàn)正常。流式細(xì)胞儀法檢測(cè)精子存活率采用SYBR-14/PI雙染法觀(guān)察精子存活情況及質(zhì)膜完整性。取5μLSYBR-14加入1mL精子懸浮液中(終濃度為100nmol/L),混勻后37℃、5%CO電子顯微鏡觀(guān)察精子質(zhì)膜的損傷取精子懸液制作涂片,晾干后在2.5%的戊二醛中固定2h,PBS300×g離心5min,洗3次,用1%鋨酸固定,PBS300×g離心5min,洗3次,不同濃度酒精梯度脫水,離子濺射儀鍍金后掃描電子顯微鏡觀(guān)察并記錄。300×g離心5min,沉淀精子,固定脫水,加包埋液浸透固化,切片,染色,透射電子顯微鏡下觀(guān)察拍片。色瑞替尼對(duì)陰道上皮細(xì)胞的影響CCK-8測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VK2/E6E7、End1/E6E7、Ect1/E6E7細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔接種約5000個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)液,PBS洗滌1次,將各培養(yǎng)孔分為對(duì)照組和藥物處理組。在藥物處理組中加入200μL預(yù)先配置好的各濃度梯度的色瑞替尼或N-9溶液,對(duì)照孔加入200μL培養(yǎng)液,分別培養(yǎng)24h、48h后去除培養(yǎng)液,加入不含血清的培養(yǎng)液100μL和10μL的CCK-8試劑。靜置30min后,37℃繼續(xù)培養(yǎng)2h,采用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處吸光度(D)值,測(cè)得細(xì)胞抑制率,計(jì)算半抑制濃度(halfmaximalinhibitoryconcentration,IC藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響將VK2/E6E7、Ect1/E6E7和End1/E6E7細(xì)胞分別接種在細(xì)胞培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)至貼壁細(xì)胞長(zhǎng)至90%,更換培養(yǎng)液,分別用含和不含藥物的角質(zhì)培養(yǎng)基培養(yǎng)6h。用鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)、PI、Hoechst33342溶液分別進(jìn)行細(xì)胞染色(終濃度分別為2μmol/L、4μmol/L和0.5μg/mL)。用激光共聚焦顯微鏡對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行觀(guān)察。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上述各實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)3次,采用Graphpadprism7.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以x結(jié)果色瑞替尼對(duì)精子運(yùn)動(dòng)的抑制色瑞替尼20s內(nèi)100%制動(dòng)精子的MEC精子運(yùn)動(dòng)能力是精子最易觀(guān)察的活性指標(biāo),在觀(guān)察到色瑞替尼的體外精子運(yùn)動(dòng)抑制活性的基礎(chǔ)上,我們參考Sander-Cramer方法色瑞替尼對(duì)精子的制動(dòng)效果為了探究色瑞替尼對(duì)精子的制動(dòng)作用是否有時(shí)間-濃度的依賴(lài)關(guān)系,我們利用CASA系統(tǒng)持續(xù)測(cè)定加藥處理后精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)。色瑞替尼對(duì)人和小鼠精子運(yùn)動(dòng)的抑制作用表現(xiàn)為隨著濃度增加和時(shí)間延長(zhǎng),精子活力(a+b+c級(jí),a+b級(jí))逐漸降低直至無(wú)活動(dòng)精子(圖2)。隨著色瑞替尼濃度的升高,精子活力(a+b+c級(jí),a+b級(jí))降低的越快。當(dāng)色瑞替尼濃度恒定時(shí),隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng),活動(dòng)精子數(shù)量逐漸下降(圖2A、2A′)。可知色瑞替尼對(duì)人類(lèi)及小鼠精子運(yùn)動(dòng)的抑制作用隨著濃度增加而增強(qiáng),且隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng),具有明顯的劑量-時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。由圖2可見(jiàn),30min處理使人和小鼠精子100%制動(dòng)所需的色瑞替尼濃度分別為5和25μmol/L。而相同條件下,使人和小鼠精子100%制動(dòng)所需的N-9濃度為200μmol/L,這表明色瑞替尼對(duì)精子的制動(dòng)活性大于殺精劑N-9。色瑞替尼在2h內(nèi)100%制動(dòng)人精子的濃度低至5μmol/L。精子復(fù)活試驗(yàn)選取20sMEC色瑞替尼處理的100%精子制動(dòng)的樣本,洗去色瑞替尼并加入0.5mLBWW培養(yǎng)液,孵育30~60min,顯微鏡下未觀(guān)察到活動(dòng)精子,即色瑞替尼對(duì)精子的制動(dòng)作用是不可逆的。HOS實(shí)驗(yàn)為了探究色瑞替尼抑制精子運(yùn)動(dòng)的機(jī)制,先以HOS實(shí)驗(yàn)來(lái)確定色瑞替尼作用于精子后精子的質(zhì)膜是否完整?？瞻讓?duì)照組中精子尾部84%發(fā)生腫脹蜷曲,證明精液標(biāo)本及HOS低滲液正常。用N-9處理精子20s后HOS實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)精子尾部幾乎不發(fā)生腫脹(0.62%),提示膜已通透。色瑞替尼組的腫脹發(fā)生率低至4.67%(圖3),提示色瑞替尼MEC在20s內(nèi)能破壞精子質(zhì)膜。流式細(xì)胞儀測(cè)定精子存活率綠色熒光標(biāo)記質(zhì)膜完整的活精子,紅色熒光標(biāo)記質(zhì)膜遭破壞的死亡精子,發(fā)出兩種熒光的雙陽(yáng)性精子為正處于瀕死的過(guò)渡狀態(tài)?？瞻讓?duì)照組活精子比率達(dá)到84%(圖4A),陽(yáng)性對(duì)照N-9處理精子的死亡率達(dá)96.1%(圖4B)。以50μmol/L色瑞替尼處理精子20s,精子膜通透,死亡率達(dá)93.9%(圖4C),5μmol/L色瑞替尼處理精子30min的死亡率達(dá)96.2%(圖4D)。表明色瑞替尼制動(dòng)的精子質(zhì)膜已經(jīng)遭到破壞,并致細(xì)胞死亡。提示與N-9類(lèi)似,色瑞替尼可能是通過(guò)破壞精子質(zhì)膜而對(duì)精子產(chǎn)生制動(dòng)效應(yīng)。掃描及透射電子顯微鏡觀(guān)察精子質(zhì)膜改變掃描及透射電子顯微鏡觀(guān)察空白對(duì)照組精子頭部呈橢圓形,質(zhì)膜表面光滑(圖5A),質(zhì)膜完整(圖5C)。而用20sMEC的色瑞替尼處理精子頭部與尾部結(jié)合處斷裂較多,頭部質(zhì)膜有溶解性改變,尾部有起泡樣改變(圖5B);透射電鏡下可見(jiàn)頂體輕微損傷,頭頸部有斷裂,頭部質(zhì)膜明顯破裂,線(xiàn)粒體部分有明顯損傷(圖5D)。而N-9處理后精子質(zhì)膜破壞嚴(yán)重,大部分精子頂體膜呈溶解性改變色瑞替尼對(duì)上皮細(xì)胞的影響色瑞替尼對(duì)上皮細(xì)胞具有細(xì)胞增殖抑制作用(圖6)。色瑞替尼和N-9對(duì)VK2/E6E7細(xì)胞IC色瑞替尼和N-9分別處理VK2/E6E7細(xì)胞6h后,以鈣綠黃素-AM/PI/Hoechst33342三重染色后放在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察,鈣綠黃素-AM染活細(xì)胞發(fā)出綠色熒光,PI染死細(xì)胞發(fā)出紅色熒光;Hoechst33342染細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光?？瞻讓?duì)照組中VK2/E6E7綠色熒光較多,細(xì)胞形態(tài)完整,細(xì)胞生長(zhǎng)良好;N-9處理后幾乎沒(méi)有綠色熒光,細(xì)胞大部分破裂死亡,細(xì)胞形態(tài)遭到破壞;色瑞替尼處理6h后,有的出現(xiàn)綠色熒光,但形態(tài)不完整(圖7)。可見(jiàn)色瑞替尼對(duì)上皮細(xì)胞膜有一定的損傷。討論我們首次報(bào)道色瑞替尼對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)具有快速制動(dòng)能力。色瑞替尼20s內(nèi)100%制動(dòng)人精子的MEC為(74.87±31.46)μmol/L,與經(jīng)典殺精劑N-9的MEC[(219.75±20.89μmol/L)]比較,色瑞替尼具有更好的殺精制動(dòng)效果。此外,色瑞替尼對(duì)人類(lèi)和小鼠的精子均具有類(lèi)似的精子制動(dòng)作用,提示可能具有共同的作用機(jī)制。我們初步揭示了色瑞替尼體外制動(dòng)精子運(yùn)動(dòng)活性的機(jī)制主要是通過(guò)破壞精子膜的完整性。N-9作用于精子的機(jī)