基因工程制藥專家講座

第四章基因工程制藥基因工程制藥專家講座第1頁(yè)在制藥業(yè)中，醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)經(jīng)歷了3個(gè)不一樣歷史階段:天然藥品經(jīng)過(guò)化學(xué)方法合成藥品基因工程藥品基因工程制藥專家講座第2頁(yè)基因工程藥品3個(gè)階段:其一是細(xì)菌基因工程，即把目標(biāo)基因經(jīng)過(guò)適當(dāng)改建導(dǎo)入大腸桿菌中，再經(jīng)過(guò)細(xì)菌等原核微生物表示目標(biāo)蛋白作為藥品;其二是細(xì)胞基因工程藥品，這是把人或哺乳動(dòng)物基因直接導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，生產(chǎn)有生物活性產(chǎn)品;其三是利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)低成本、高活性藥品。基因工程制藥專家講座第3頁(yè)第一節(jié)基因工程藥品概述第二節(jié)基因工程藥品表示第三節(jié)基因工程藥品生產(chǎn)第四節(jié)基因藥品實(shí)例——轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物制藥基因工程制藥專家講座第4頁(yè)發(fā)覺(jué)和確證藥品靶標(biāo)設(shè)計(jì)新分子產(chǎn)生生物分子庫(kù)新生物分子下游工程生物藥品制劑新生物藥品生物信息學(xué)基因組學(xué)功效基因組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)工程分子結(jié)構(gòu)和活性關(guān)系蛋白質(zhì)化學(xué)NMR，質(zhì)譜X光晶體衍射代謝工程糖基化工程天然配基新型生物藥品研發(fā)流程基因工程制藥專家講座第5頁(yè)第一節(jié)基因工程藥品概述意義：自20世界70年代基因工程誕生以來(lái)，最先應(yīng)用基因工程技術(shù)且當(dāng)前最為活躍研究領(lǐng)域便是醫(yī)藥科學(xué)?；蚬こ碳夹g(shù)迅猛發(fā)展使人們已能夠十分方便有效地生產(chǎn)許多以往難以大量取得生物活性物質(zhì)，甚至能夠創(chuàng)造出自然界中不存在全新物質(zhì)。1982年第一個(gè)基因重組產(chǎn)品——人胰島素在美國(guó)問(wèn)世，吸引和激勵(lì)了大批科學(xué)家利用基因工程技術(shù)研制新藥品，迄今累計(jì)已經(jīng)有近30種基因工程藥品投入市場(chǎng)，產(chǎn)生了巨大社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第6頁(yè)（1）免疫性蛋白，如各種抗原和單克隆抗體；（2）細(xì)胞因子，如各種干擾素、白細(xì)胞介素、集落刺激生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、凝血因子；（3）激素，如胰島素、生長(zhǎng)激素、心素納；（4）酶類(lèi)，如尿激酶、鏈激酶、葡激酶、組織型纖維蛋白溶酶原激活劑、超氧化物歧化酶。一、基因工程技術(shù)可生產(chǎn)藥品和制劑基因工程制藥專家講座第7頁(yè)二、基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品優(yōu)點(diǎn)（1）利用基因工程技術(shù)可大量生產(chǎn)過(guò)去難以取得生理活性蛋白質(zhì)和多肽，為臨床使用提供有效保障；（2）能夠提供足夠數(shù)量生理活性物質(zhì)，方便對(duì)其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)使用范圍；基因工程制藥專家講座第8頁(yè)（3）利用基因工程技術(shù)能夠發(fā)覺(jué)，挖掘更多內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；（4）內(nèi)源生理活性物質(zhì)在作為藥品使用存放不足之處，能夠經(jīng)過(guò)基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造和去除；（5）利用基因工程技術(shù)可取得新型化合物，擴(kuò)大藥品篩選起源?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第9頁(yè)三、我國(guó)基因工程藥品研究和開(kāi)發(fā)起步較晚，基礎(chǔ)較差。α1b型基因工程干擾素是由我國(guó)自行研制開(kāi)發(fā)含有國(guó)際先進(jìn)水平生物高科技結(jié)果，于1997年

經(jīng)過(guò)Ⅲ期臨床，并取得國(guó)家一類(lèi)新藥證書(shū)，成為“863”計(jì)劃生物技術(shù)領(lǐng)域第一個(gè)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化基因工程藥品。當(dāng)前我國(guó)已同意12種基因工程藥品和疫苗上市，在研究開(kāi)發(fā)中也有10余種?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第10頁(yè)我國(guó)已同意上市基因工程藥品和疫苗產(chǎn)品名稱適應(yīng)癥開(kāi)發(fā)及生產(chǎn)單位批按時(shí)間重組人干擾素α1b（外用）病毒性角膜炎長(zhǎng)春生物制品研究所1989年試生產(chǎn)重組人干擾素α1bHBV、HCV上海生物制品研究所等1996年重組人干擾素α2a尖銳濕疣，皰疹等，HBV、HCV新大洲藥業(yè)等1997年重組人干擾素α2bHBV、HCV安徽安科生物工程股份有限企業(yè)等1997年試生產(chǎn)重組人干擾素γ類(lèi)風(fēng)濕麗珠醫(yī)藥（集團(tuán)）有限企業(yè)生物工程企業(yè)等1995年試生產(chǎn)重組人白介素2癌癥輔助療法長(zhǎng)春生物制品研究所等1997年試生產(chǎn)重組人巨噬細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）化療生白細(xì)胞廈門(mén)特寶等1997年試生產(chǎn)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子化療生白細(xì)胞杭州九源基因企業(yè)等1996年試生產(chǎn)基因工程制藥專家講座第11頁(yè)我國(guó)已同意上市基因工程藥品和疫苗產(chǎn)品名稱適應(yīng)癥開(kāi)發(fā)及生產(chǎn)單位批按時(shí)間重組尿激酶心肌梗死溶栓醫(yī)大實(shí)業(yè)（上海）1996年試生產(chǎn)重組人紅細(xì)胞生成素（EPO）再生障礙性貧血南京華欣等1997年試生產(chǎn)重組人胰島素糖尿病通化安泰克1998年重組人生長(zhǎng)激素兒童侏儒癥長(zhǎng)春金賽等1998年試生產(chǎn)重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子創(chuàng)傷、燒傷珠海東大1996年試生產(chǎn)乙型肝炎疫苗預(yù)防乙肝華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任企業(yè)等重組痢疾菌苗預(yù)防痢疾軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院1998年獲新藥證書(shū)重組表皮生長(zhǎng)因子創(chuàng)傷外用中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所獲新藥證書(shū)基因工程制藥專家講座第12頁(yè)四、基因工程藥品生產(chǎn)基本過(guò)程定義：基因工程技術(shù)是指將重組對(duì)象目標(biāo)基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌（或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)重新組合，并使目標(biāo)基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表示?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第13頁(yè)基因工程藥品制造普通流程：（1）取得目標(biāo)基因；（2）組建重組質(zhì)粒；（3）構(gòu)建基因工程菌；（4）培養(yǎng)工程菌；（5）產(chǎn)物分離純化；（6）除菌過(guò)濾；（7）半成品檢定；（8）包裝上游階段下游階段基因工程制藥專家講座第14頁(yè)1、上游階段：首先取得目標(biāo)基因，然后用限制性內(nèi)切酶和連接酶將其插入適當(dāng)載體質(zhì)?；蚴删w中并轉(zhuǎn)大腸桿菌或其它宿主菌（細(xì)胞），方便大量復(fù)制目標(biāo)基因。選擇基因表示系統(tǒng)主要考慮是確保表示功效，其次要考慮是表示量多少和分離純化難易。其中（1）、（2）、（3）步驟屬于上游階段，在試驗(yàn)室完成。2、下游階段：將試驗(yàn)室結(jié)果產(chǎn)業(yè)化、商品化，它主要包含工程菌大規(guī)模發(fā)酵最正確參數(shù)確實(shí)立，新型生物反應(yīng)器研制，高效分離介質(zhì)及裝置開(kāi)發(fā)，分離純化優(yōu)化控制，高純度純品制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表設(shè)計(jì)和制造，電子計(jì)算機(jī)優(yōu)化控制等。上述（4）、（5）、（6）、（7）、（8）等屬于下游階段。基因工程制藥專家講座第15頁(yè)第二節(jié)基因工程藥品表示一、藥品基因分離二、基因表示基因工程制藥專家講座第16頁(yè)一、藥品基因分離當(dāng)前基因工程藥品大都是人基因片段蛋白產(chǎn)物，或糖基化修飾后蛋白產(chǎn)物。真核生物基因普通包含了若干外顯子和內(nèi)含子。因?yàn)閮?nèi)含子不能翻譯產(chǎn)物，所以基因工程藥品表示所使用基因通常是cDNA，即mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第17頁(yè)特定mRNA能夠經(jīng)過(guò)不一樣方法取得。cDNA文庫(kù)直接從特定mRNA分離基因從蛋白質(zhì)分離編碼基因基因化學(xué)合成RT-PCR分離基因基因工程制藥專家講座第18頁(yè)1、mRNA純化2、cDNA第一鏈合成3、cDNA第二鏈合成4、cDNA克隆5、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞6、cDNA文庫(kù)判定7、目標(biāo)cDNA克隆分離和判定（一）cDNA文庫(kù)方法：oligo(DT)親和層析法普通mRNA都帶有3’－polyA，所以能夠用寡聚dT作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下，開(kāi)始cDNA鏈合成。用放射性探針?lè)z測(cè)。以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。（1）核酸探針雜交法（2）免疫反應(yīng)判定法基因工程制藥專家講座第19頁(yè)用于cDNA克隆載體有兩類(lèi)：質(zhì)粒DNA和噬菌體。又將其分為表示型載體和非表示型載體。選取表示型載體能夠增加目標(biāo)基因篩選方法，有利于目標(biāo)基因篩選。cDNA片段與載體連接通常采取下面方法：加同聚尾連接：在載體和cDNA3’末端加上互補(bǔ)同型多聚酶序列。人工接頭連接：所謂人工接頭是指用人工合成、連接在目標(biāo)基因兩端含有一些限制酶切點(diǎn)寡核苷酸片斷?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第20頁(yè)前提：較小蛋白質(zhì)或多肽編碼基因，必須知道目標(biāo)基因核苷酸排列次序，或知道目標(biāo)蛋白質(zhì)氨基酸次序，再按對(duì)應(yīng)密碼子推導(dǎo)出DNA堿基序列。限制：（二）化學(xué)合成法一、不能合成太長(zhǎng)基因。二、人工合成基因時(shí)，遺傳密碼簡(jiǎn)并會(huì)為選擇密碼子帶來(lái)很大困難。三、費(fèi)用高基因工程制藥專家講座第21頁(yè)（三）RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶反應(yīng)法。該方法是mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，不需再合成第二鏈，而是在特異引物幫助下，用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，特異地合成目標(biāo)cDNA鏈，用于重組，克隆?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第22頁(yè)二、基因表示基因表示是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中轉(zhuǎn)錄、翻譯以及全部加工過(guò)程?；虮硎狙芯渴侵竿庠椿蛟谀撤N細(xì)胞中表示活動(dòng)，即剪切下一個(gè)外源基因片斷，拼接到另一個(gè)基因表示體系中，使其能取得現(xiàn)有原生物活性又可高產(chǎn)表示產(chǎn)物。基因工程制藥專家講座第23頁(yè)基因工程重組藥品宿主選擇主要考慮產(chǎn)物活性表示和宿主安全性。普通標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)所用載體體系及各種受體細(xì)胞基因型進(jìn)行選擇，要使重組體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染效率高、能穩(wěn)定傳代、受體細(xì)胞基因型與載體所含選擇標(biāo)識(shí)需匹配。（一）宿主細(xì)胞選擇基因工程制藥專家講座第24頁(yè)1、原核細(xì)胞2、真核細(xì)胞（1）大腸桿菌：當(dāng)前采取最多原核表示體系。（2）枯草芽孢桿菌（3）鏈霉菌（1）酵母：釀酒酵母應(yīng)用廣泛。（2）絲狀真菌（3）哺乳動(dòng)物細(xì)胞（4）植物細(xì)胞基因工程制藥專家講座第25頁(yè)（二）大腸桿菌中基因表示1、載體表示載體必須具備條件：（1）載體能夠獨(dú)立復(fù)制（2）含有靈活克隆位點(diǎn)和方便篩選標(biāo)識(shí)（3）含有很強(qiáng)開(kāi)啟子（4）含有阻遏子（5）有很強(qiáng)終止子（6）有翻譯起始信號(hào)基因工程制藥專家講座第26頁(yè)慣用表示載體：（1）pBV220系統(tǒng)（2）pET系統(tǒng)基因工程制藥專家講座第27頁(yè)2、影響目標(biāo)基因在大腸桿菌中表示原因（1）外源基因拷貝數(shù)（2）外源基因表示效率（3）表示產(chǎn)物穩(wěn)定性（4）細(xì)胞代謝負(fù)荷（5）工程菌培養(yǎng)條件①開(kāi)啟子強(qiáng)弱②核糖體結(jié)合位點(diǎn)③SD序列和起始密碼子ATG間距④密碼子組成基因工程制藥專家講座第28頁(yè)3、真核基因在大腸桿菌中表示形式（1）以融合蛋白表示形式表示藥品基因由一段短原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起蛋白質(zhì)，稱為融合蛋白。（2）以非融合蛋白形式表示藥品基因（3）分泌型表示蛋白藥品基因基因工程制藥專家講座第29頁(yè)1、載體（1）載體復(fù)制序列——包含YEp類(lèi)、YRp類(lèi)、YRp類(lèi)和YIp類(lèi)。（2）克隆載體——因?yàn)閺拇竽c桿菌中制備質(zhì)粒比從酵母中輕易，所以酵母質(zhì)粒加工和制備大部分是經(jīng)過(guò)大腸桿菌進(jìn)行。（3）表示載體——包含普通表示載體和準(zhǔn)確表示載體。（三）酵母中基因表示基因工程制藥專家講座第30頁(yè)2、影響目標(biāo)基因在酵母菌中表示原因（1）外源基因拷貝數(shù)（2）外源基因表示效率（3）外源蛋白糖基化（4）宿主菌株影響表示用酵母宿主菌應(yīng)具備：①菌體生長(zhǎng)力強(qiáng)。②菌體內(nèi)蛋白酶要較弱。③菌株性能穩(wěn)定。④分泌能力強(qiáng)。主要與開(kāi)啟子、分泌信號(hào)和終止序列相關(guān)。基因工程制藥專家講座第31頁(yè)（四）動(dòng)物細(xì)胞中基因表示中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）猴腎細(xì)胞（COS）CHO細(xì)胞屬成纖維細(xì)胞，該細(xì)胞缺乏二氫葉酸還原酶（DHFR），經(jīng)轉(zhuǎn)染可將DHFR重組至細(xì)胞中，含有DHFR表示載體重組CHO細(xì)胞，經(jīng)氨甲喋呤（MTX）培養(yǎng)篩選后可選擇出克隆表示異源基因重組細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表示外源基因主要優(yōu)點(diǎn)——能識(shí)別和剪切外源基因中內(nèi)含子并加工為成熟mRNA?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第32頁(yè)主要載體SV40衍生載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體腺病毒載體（AV）腺相關(guān)病毒載體（AVV）痘苗病毒載體（VV）基因工程制藥專家講座第33頁(yè)三、基因工程菌穩(wěn)定性基因工程菌在傳代過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定現(xiàn)象，又分為分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。分裂不穩(wěn)定是指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定百分比不含質(zhì)粒子代菌現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定是指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能改變?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第34頁(yè)質(zhì)粒穩(wěn)定性分析方法：1、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生原因主要與兩個(gè)原因相關(guān)：一是含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率；二是這兩種菌生長(zhǎng)比速率差異大小?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第35頁(yè)二階段培養(yǎng)法：第一階段先使菌體生長(zhǎng)至一定密度，第二階段誘導(dǎo)外源基因表示。2、提升質(zhì)粒穩(wěn)定性方法基因工程制藥專家講座第36頁(yè)第三節(jié)基因工程藥品生產(chǎn)基因工程制藥專家講座第37頁(yè)一、基因工程藥品生產(chǎn)特點(diǎn)是外源蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)異源表示，不一樣于微生物天然次級(jí)代謝藥品，所以在調(diào)控合成方式上，應(yīng)該主要受限于質(zhì)?；蚴删w內(nèi)在性質(zhì)；是蛋白質(zhì)產(chǎn)物，不一樣于種類(lèi)多樣次級(jí)代謝產(chǎn)物；合成路徑簡(jiǎn)單，沒(méi)有復(fù)雜多酶系統(tǒng)；產(chǎn)物積累主要在胞內(nèi)，分泌型也主要積累在細(xì)胞周質(zhì)中；產(chǎn)物在胞內(nèi)積累通常是以內(nèi)涵體形式；分離純化相對(duì)于次級(jí)代謝產(chǎn)物而言要簡(jiǎn)單、一致；產(chǎn)物分離純化后可能沒(méi)有活性，需要深入復(fù)性。基因工程制藥專家講座第38頁(yè)基因工程藥品是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，含有潛在危險(xiǎn)，所以對(duì)產(chǎn)生菌管理要求嚴(yán)格，應(yīng)該防止各種可能擴(kuò)散污染，必須在合格GMP生產(chǎn)車(chē)間進(jìn)行?；蚬こ趟幤稧MP是對(duì)生產(chǎn)全過(guò)程質(zhì)量管理，包括人員、廠房、設(shè)備，原材料采購(gòu)入庫(kù)、檢驗(yàn)、發(fā)料、加工、制品及半成品檢驗(yàn)、分包裝，成品檢定，產(chǎn)品銷(xiāo)售、運(yùn)輸，用戶意見(jiàn)及使用反應(yīng)處理等在內(nèi)全過(guò)程質(zhì)量管理?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第39頁(yè)二、基因工程菌發(fā)酵基因工程菌培養(yǎng)過(guò)程主要包含：（1）經(jīng)過(guò)搖瓶操作了解工程菌生長(zhǎng)基礎(chǔ)條件，如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分以及碳氮比，分拆表示產(chǎn)物合成、積累對(duì)受體細(xì)胞影響；（2）經(jīng)過(guò)培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制方案以及次序?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第40頁(yè)1、基因工程菌培養(yǎng)方式慣用有：補(bǔ)料分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、透析培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)。基因工程制藥專家講座第41頁(yè)（1）補(bǔ)料分批培養(yǎng)將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體深入生長(zhǎng)培養(yǎng)方式。（2）連續(xù)培養(yǎng)將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至一定濃度后，開(kāi)動(dòng)進(jìn)料和出料蠕動(dòng)泵，以控制一定稀釋率進(jìn)行不間斷培養(yǎng)。（3）透析培養(yǎng)利用膜半透性原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離，經(jīng)過(guò)去除培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物來(lái)解除其生產(chǎn)菌不利影響。（4）固定化培養(yǎng)基因工程制藥專家講座第42頁(yè)2、基因工程菌發(fā)酵工藝基因工程菌發(fā)酵工藝與傳統(tǒng)微生物發(fā)酵工藝區(qū)分：（1）生物材料方面（2）生產(chǎn)目標(biāo)方面基因工程制藥專家講座第43頁(yè)（1）培養(yǎng)基影響慣用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。慣用氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解產(chǎn)物、玉米漿和氨水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等。另外還要加一些無(wú)機(jī)鹽、微量元素、維生素、生物素等。對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型菌株還要補(bǔ)加對(duì)應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。基因工程制藥專家講座第44頁(yè)（2）接種量影響接種量是指移入種子液體和培養(yǎng)液體積百分比。接種量小，不利于外源基因表示，大接種量有利于對(duì)基質(zhì)利用，縮短生長(zhǎng)延遲期，并使生產(chǎn)菌能快速占領(lǐng)整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境，降低污染機(jī)會(huì)，但接種量過(guò)高又會(huì)抑制后期菌體生長(zhǎng)。所以接種量大小取決于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵中生長(zhǎng)繁殖速度。基因工程制藥專家講座第45頁(yè)（3）溫度影響溫度對(duì)基因表示調(diào)控作用可發(fā)生在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或小分子調(diào)整分子合成水平上。在復(fù)制水平上，可經(jīng)過(guò)調(diào)控復(fù)制，改變基因拷貝數(shù)，影響基因表示；在轉(zhuǎn)錄水平上，可經(jīng)過(guò)影響RNA聚合酶作用或修飾RNA聚合酶，來(lái)調(diào)控基因表示；溫度也可在mRNA講解和翻譯水平上影響基因表示，溫度還可能經(jīng)過(guò)細(xì)胞內(nèi)小分子調(diào)整分子量而影響基因表示，也可經(jīng)過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)ppGpp量調(diào)控一系列基因表。溫度還影響蛋白質(zhì)活性和包含體形成?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第46頁(yè)（4）溶解氧影響溶解氧是工程菌發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中影響菌體代謝一個(gè)主要參數(shù)，對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成影響很大。外源基因高效表示和翻譯需要維持較高水平DO2值。通常采取調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速方法，能夠改進(jìn)培養(yǎng)過(guò)程中氧供給，提升活菌產(chǎn)量?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第47頁(yè)（5）誘導(dǎo)時(shí)機(jī)影響普通在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久或?qū)?shù)生長(zhǎng)后期升溫誘導(dǎo)表示?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第48頁(yè)總之，工程菌發(fā)酵工藝優(yōu)化對(duì)異源蛋白表示關(guān)系重大，必須建立最正確優(yōu)化工藝。（6）pH影響pH對(duì)細(xì)胞正常生長(zhǎng)和外源蛋白高效表示都有影響，所以應(yīng)依據(jù)工程菌生長(zhǎng)和代謝情況，對(duì)pH進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第49頁(yè)3、基因工程菌培養(yǎng)設(shè)備發(fā)酵罐組成部分有：發(fā)酵罐體確保高傳質(zhì)作用攪拌器精細(xì)溫度控制滅菌系統(tǒng)空氣無(wú)菌過(guò)濾裝置殘留氣體處理裝置參數(shù)測(cè)量與控制系統(tǒng)培養(yǎng)液配置連續(xù)操作裝置等?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第50頁(yè)三、基因工程藥品分離純化許多醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品都是活性肽或蛋白質(zhì)。這些產(chǎn)品制得含有以下特點(diǎn)：（1）目標(biāo)產(chǎn)物在初始物料中含量較低（2）含目標(biāo)產(chǎn)物初始物料組成復(fù)雜，且影響較大（3）目標(biāo)產(chǎn)物穩(wěn)定性差（4）種類(lèi)繁多（5）應(yīng)用面廣，對(duì)其質(zhì)量、純度要求高，甚至要求無(wú)菌、無(wú)熱原等。所以，為了取得合格目標(biāo)產(chǎn)物，必須建立與上述特點(diǎn)相適應(yīng)醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品分離純化工藝?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第51頁(yè)（一）建立分離純化工藝依據(jù)1、含目標(biāo)產(chǎn)物起始物料特點(diǎn)：（1）菌種類(lèi)型及其代謝特征（2）原材料和培養(yǎng)基起源及其質(zhì)量（3）生產(chǎn)工藝和條件（4）初始物料物理、化學(xué)和生物學(xué)特征。2、物料中雜質(zhì)種類(lèi)和性質(zhì)3、目標(biāo)產(chǎn)物特征4、產(chǎn)品質(zhì)量要求基因工程制藥專家講座第52頁(yè)（二）分離純化基本過(guò)程分離純化是基因工程藥品生產(chǎn)中極其主要一環(huán)。普通不應(yīng)超出4～5個(gè)步驟，包含細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第53頁(yè)（三）分離純化技術(shù)分離純化技術(shù)應(yīng)滿足以下要求：（1）技術(shù)條件要溫和（2）選擇性要好（3）收率要高（4）兩個(gè)技術(shù)之間要能直接銜接（5）整個(gè)分離純化過(guò)程要快基因工程制藥專家講座第54頁(yè)1、細(xì)胞破碎與固液分離（1）細(xì)胞搜集：細(xì)胞搜集慣用是離心分離方法，膜過(guò)濾法液逐步得到廣泛應(yīng)用。（2）細(xì)胞破碎：有機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法。機(jī)械破碎法：高壓勻漿法、超聲破碎法、高速珠磨法、高壓擠壓法非機(jī)械破碎法：酶溶法、化學(xué)滲透法、熱處理法、滲透壓沖擊法等。（3）固液分離：離心沉淀是固液分離主要伎倆，包含高速離心和超速離心。慣用膜過(guò)濾技術(shù)有微濾、超濾和反滲透等?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第55頁(yè)2、目標(biāo)產(chǎn)物分離純化主要依賴色譜分離方法。色譜技術(shù)分為離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠色譜、高壓液相色譜等。蛋白質(zhì)純化方法設(shè)計(jì)通常依據(jù)產(chǎn)物分子物理、化學(xué)參數(shù)和生物學(xué)特征。選擇純化方法應(yīng)依據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)和雜蛋白物理、化學(xué)和生物學(xué)方面性質(zhì)差異，尤其主要是表面性質(zhì)差異。基因工程制藥專家講座第56頁(yè)（1）離子交換色譜（ionexchangechromatography,IEC）基本原理是經(jīng)過(guò)帶電溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換離子進(jìn)行交換，從而到達(dá)分離目標(biāo)。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和表面電荷分布主要影響其離子交換性能，影響蛋白質(zhì)離子交換色譜保留其它原因，還有交換基團(tuán)和交換介質(zhì)種類(lèi)、吸附和洗脫條件等?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第57頁(yè)（2）反相色譜（reversedphasechromatography,RPC）和疏水色譜（hydrophobicinteractionchromatography,HIC）反相色譜和疏水色譜是依據(jù)蛋白質(zhì)疏水性差異來(lái)分離純化?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第58頁(yè)（3）親和色譜（affinitychromatography,AC）親和色譜是利用固定化配基與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間特異生物親和力進(jìn)行吸附。親和色譜過(guò)程大致分為3步：配基固定化;吸附目標(biāo)產(chǎn)物；樣品解吸?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第59頁(yè)（4）凝膠過(guò)濾色譜凝膠過(guò)濾是以含有空隙大小一定多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進(jìn)入孔內(nèi)，在柱中遲緩移動(dòng)，而大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動(dòng)，利用這種移動(dòng)差異可使大分子與小分子分開(kāi)?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第60頁(yè)3、非蛋白質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)去除非蛋白質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)不應(yīng)忽略，在純化過(guò)程中，需尤其注意3種可能存在非蛋白類(lèi)雜質(zhì)，它們是DNA、熱原質(zhì)和病毒?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第61頁(yè)（四）選擇分離純化方法依據(jù)1、依據(jù)產(chǎn)物表示形式來(lái)選擇2、依據(jù)分離單元之間銜接選擇3、依據(jù)分離純化工藝要求來(lái)選擇基因工程制藥專家講座第62頁(yè)四、基因工程藥品質(zhì)量控制1、原材料質(zhì)量控制原材料質(zhì)量控制是要確保編碼藥品DNA序列正確性，重組微生物來(lái)自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以確保產(chǎn)品質(zhì)量安全性和一致性?；蚬こ讨扑帉＜抑v座第63頁(yè)2、培養(yǎng)過(guò)程質(zhì)量控制在工程菌菌種貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過(guò)程中，要求工程菌所含質(zhì)粒穩(wěn)定，一直無(wú)突變；在重復(fù)發(fā)酵中，工程菌表示穩(wěn)定；一直能排除外源微生物