免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座

免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry）又稱免疫細(xì)胞化學(xué)。它是組織化學(xué)分支，它是用標(biāo)識(shí)特異性抗體（或抗原）對(duì)組織內(nèi)抗原（或抗體）分布進(jìn)行組織和細(xì)胞原位檢測(cè)技術(shù)。免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第1頁

基本原理抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合原理，經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)識(shí)抗體顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量研究。免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第2頁免疫組化特點(diǎn)特異性強(qiáng)

敏感性高

定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功效相結(jié)合

免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第3頁免疫組化作用

凡是組織細(xì)胞內(nèi)含有抗原性物質(zhì)，如肽類、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、受體、表面抗原等等均可用免疫組織化學(xué)方法顯示。免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第4頁試驗(yàn)所用標(biāo)本石蠟切片是制作組織標(biāo)本最慣用、最基本方法，對(duì)于組織形態(tài)保留好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察；還能長久存檔，供回顧性研究。免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第5頁試驗(yàn)設(shè)備恒溫冰凍切片機(jī)、脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)、攤片機(jī)、烤片機(jī)、冰箱、電磁爐、高壓鍋、染色架以及離心機(jī)和免疫組化試劑等免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第6頁免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第7頁免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第8頁

脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第9頁

免疫組化技術(shù)分類1、免疫熒光方法2、免疫酶標(biāo)方法3、免疫膠體金技術(shù)4、免疫鐵蛋白法5、放射免疫自顯影法免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第10頁酶聯(lián)免疫組織化學(xué)ABC法

S-P法免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第11頁免疫組化操作步驟免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第12頁一.石蠟切片制作1、固定：取組織，用PBS沖洗，放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液內(nèi)固定12h2、脫水：倒去固定液，用蒸餾水沖洗3次，再用50%酒精沖洗2次，用酒精逐層脫水，70%酒精1天，80%酒精過夜，95%酒精3h，無水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2h3、透明：1:1無水酒精二甲苯45min，二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各30min4、包埋：（恒溫箱內(nèi)進(jìn)行）浸入石蠟，1:1二甲苯石蠟（58℃）45min，石蠟（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5h，用石蠟（Ⅲ）包埋組織免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第13頁5、切片：包埋后組織塊經(jīng)修整后，用切片機(jī)切成5-7μm，石蠟帶6、貼片：將組織石蠟塊在50℃溫水中展片，然后用處理潔凈載玻片撈片，組織帶可黏在載玻片上（洗片：1%HCl浸泡過夜、蒸餾水沖洗、95%酒精浸泡2h后擦干→涂膠：防脫劑多聚賴氨酸）7、烤片：68℃恒溫箱內(nèi)烤片2h免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第14頁二.SP（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)）三步法染色步驟1、脫蠟、水化

60℃×20分鐘→二甲苯2×10分鐘100%絕對(duì)乙醇:2×5分鐘;95%ethanol2minutes；95%乙醇2分鐘80%ethanol2minutes；70%ethanol2minutes；distilledwater:5min；蒸餾水:5分鐘PBS洗3次×3min。免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第15頁2、阻斷：3%H2O2去離子水（或80%甲醇）孵育10min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性3、PBS沖洗2-3次，每次5min4、抗原修復(fù)：置0.01M枸櫞酸緩沖液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加緊冷卻至室溫5、PBS沖洗2-3次，每次5min6、封閉：滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，甩去多出液體7、滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1h，或者37℃1h，或者4℃過夜（需在37℃復(fù)溫45min）8、PBS沖洗2-3次，每次5min免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第16頁9、滴加辣根過氧化物酶標(biāo)識(shí)Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置1h，或37℃1h10、PBS沖洗2-3次，每次5min11、滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30min-1h12、PBS沖洗2-3次，每次5min13、顯色：DAB顯色5-10min，在顯微鏡下掌握染色程度（胞漿呈棕色者判定為陽性細(xì)胞）（顯色劑配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）（A：DABB：H2O2C：磷酸緩沖液）免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第17頁14、自來水沖洗10分鐘終止反應(yīng)15、復(fù)染：蘇木精復(fù)染2min，鹽酸酒精分化16、自來水沖洗10-15min17、常規(guī)脫水

50%ethanol1-2min，70%ethanol1-2min95%ethanol1-2min；95%ethanol1-2min；100%absoluteethanol:(1-2)min。透明：Xylene1×(1-2)min→Xylene2×(1-2)min封片（用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上）、鏡檢免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第18頁三.二步法免疫組化染色步驟二甲苯脫蠟，梯度酒精置換二甲苯PBS沖洗3次，每次3分鐘依據(jù)每一個(gè)抗體要求，對(duì)組織抗原進(jìn)行對(duì)應(yīng)修復(fù)

0.3%過氧化氫甲醇液阻斷20分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性PBS沖洗、浸泡5分鐘，3次正常山羊血清室溫封閉10分鐘免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第19頁甩去血清，加入適當(dāng)稀釋一抗，37℃孵育60分鐘或4℃過夜PBS沖洗，浸泡5分鐘，3次滴加多聚螯合物，37℃孵育30分鐘PBS沖洗，浸泡5分鐘，3次新鮮配置酶底物顯色液DAB顯色3－10分鐘流水沖洗蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡觀察拍照IPP軟件分析光密度免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第20頁幾個(gè)抗原修復(fù)方法真空負(fù)壓抗原修復(fù)法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇真空負(fù)壓處理5分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），真空負(fù)壓干燥箱預(yù)先調(diào)至95℃，真空負(fù)壓處理10分鐘。

⑤待修復(fù)注降至室溫一，PBS洗3次，隨即按選好免疫組化染色方法進(jìn)行染色。

免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第21頁微波輻射抗原修復(fù)法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），于微波爐內(nèi)微波輻射10分鐘，如檢測(cè)Er和Pr則需要20輻射分鐘左右。

⑤待修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨即按選好免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行染色。

免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第22頁高壓抗原修復(fù)法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④切片放入抗原修復(fù)液中，邊同容器放入高壓鍋中加熱至沸騰。蓋上壓力閥至噴汽后連續(xù)1－4分鐘。

⑤待修復(fù)液恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，隨即按選好免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行染色。

免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第23頁電爐加熱抗原修復(fù)法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④將切片放入抗原修復(fù)液中于電爐上加熱，不時(shí)用溫度計(jì)測(cè)量溫度，當(dāng)達(dá)92℃后，即可拔離電源，當(dāng)溫度低于92℃時(shí)，再插上電源，如此重復(fù)連續(xù)至10分鐘左右。

⑤待抗原修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨即按選定免疫組化染色方法進(jìn)行染色。

免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第24頁胰蛋白酶消化法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④PBS洗3次，1分鐘/次。

⑤滴上自配或商品化胰蛋白酶，處理切片20分鐘左右。

⑥PBS洗3次，2分鐘/次。

⑦后按選好免疫組化染色方法進(jìn)行染色。

免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第25頁所用試劑1.PBS：0.01M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)

配制--取NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4?12H2O3.63g或Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，溶于900ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至7.4，加水定容至1L，常溫保留備用2.包埋劑：石蠟3.防脫劑：多聚賴氨酸（PLL5g+蒸餾水1000ml）、APES（3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷）免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第26頁4.固定液：4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH7.4)

配制–a.0.1M磷酸鹽緩沖液：取A液400ml與B液80ml混合后，調(diào)pH于7.4，再定容至500mlA液：0.1mol/LNa2HPO4（Na2HPO4?12H2O35.8g加水定容至1000ml）B液：0.1mol/LNaH2PO4（NaH2PO4?2H2O15.6g加水定容至1000ml）b.4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液：取20g多聚甲醛溶于500ml0.1M磷酸鹽緩沖液中，加熱并攪拌約2-3h后溶解5.細(xì)胞通透液：由終濃度分別為0.3%雙氧水和0.3%TritonX-100（曲拉通X-100又稱清潔劑）混合而成。配制方法是先用微波加熱36mlPBS，再接著加120ulTritonX-100，并加熱一會(huì)兒，冷卻至臨用前加0.4ml30％H2O2。免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第27頁6.抗原修復(fù)液：0.01M枸櫞酸緩沖液（PH6.0），或0.01M檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）配制--取A液8ml與B液42ml混合后加水至400ml，調(diào)pH于6.0，再定容至500mlA液：0.1mol/L檸檬酸（C6H8O7?H2O21.01g加水定容至1000ml）B液：0.1mol/L檸檬酸鈉（Na3C6H5O7?2H2O29.41g加水定容至1000ml）7.5％羊血清或封閉血清，用PBS稀釋。含0.03％H2O20.05％DAB二氨基聯(lián)苯胺（避光）：用20×DAB（1％，10mg/ml）5ul＋0.1ul30%H2O2＋95ulPBS。8.一抗（特異結(jié)合底物1:100）

、二抗均用PBS稀釋。9.二甲苯、梯度酒精（100％×2、95％、80％、70％、50％）、雙蒸水、中性樹膠（封裱劑）。10.顯色劑：DAB試劑盒、蘇木素染液免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第28頁免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)1、每批染色都要有特異性陽性對(duì)照和陰性對(duì)照為基礎(chǔ)，才能對(duì)染色結(jié)果做判斷；2、陽性表示必須在細(xì)胞和組織特定抗原部位才能視為陽性；3、陰性結(jié)果不能視為抗原不表示，即陰性結(jié)果無判斷意義；陽性結(jié)果有強(qiáng)弱、多少之分，哪怕一個(gè)細(xì)胞陽性，只要是在抗原所表示部位，也有診療意義。4、當(dāng)免疫組化結(jié)果與HE切片診療有矛盾時(shí)，以HE切片診療為準(zhǔn)。5、應(yīng)用“反正法”確保免疫組化在診療中準(zhǔn)確性。6、防止假陰性和假陽性發(fā)生。免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第29頁

免疫組化應(yīng)用范圍在常規(guī)病理診療中應(yīng)用免疫組化主要有8個(gè)方面：1、對(duì)腫瘤組織起源進(jìn)行判別診療；2、對(duì)腫瘤良惡性進(jìn)行綜合判斷；3、發(fā)覺微小轉(zhuǎn)移灶；4、激素受體檢測(cè)以指導(dǎo)臨床治療；5、激素類細(xì)胞定性和定位，以明確內(nèi)分泌細(xì)胞類型和功效狀態(tài)。6、指導(dǎo)腫瘤預(yù)后，如PgP、CerbB-2、P53等。7、指導(dǎo)腫瘤分期；8、免疫性疾病輔助診療，如腎小球腎炎、一些皮膚疾病等組織內(nèi)免疫復(fù)合物檢測(cè)。免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第30頁免疫組化染色中常見問題及對(duì)策免疫組化操作方法比較簡(jiǎn)單，然而在實(shí)際工作中也會(huì)碰到一些麻煩，如脫片、無特異性表示或表示較弱、染色過強(qiáng)、背景染色強(qiáng)、定位不好等。引發(fā)上述問題原因較多，主要有組織固定、脫水不良或浸蠟溫度過高造成抗原丟失；抗原未修復(fù)；抗體或工作液失效、抗體稀釋不妥；在一定溫度下抗原孵育時(shí)間不足、一抗和二抗不匹配；顯色劑失效或配置方法失誤等。所以，良好組織固定和脫水及適當(dāng)浸蠟溫度是做好免疫組化前提。中性福爾馬林固定有利于正確結(jié)果顯示。免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第31頁1、脫片可能原因與對(duì)策整批切片脫片可能是載玻片未處理，玻片上有油污未清洗或未涂抹防脫片膠，或烤片時(shí)間不足致粘片不牢靠。單張切片及整塊組織脫片除了上述原因外，需考慮抗體熱修復(fù)時(shí)液體溫度過高和時(shí)間過長，或沖洗時(shí)用力過猛等原因。免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第32頁2、無特異性表示原因問題確認(rèn)染色過程次序是否正確；是否忽略了某一過程；是否孵育了足夠時(shí)間；是否使用了正確抗體，以及二抗是否和一抗一致匹配。底物顯色系統(tǒng)是否失效。

解決方法重新試驗(yàn)，設(shè)置陽性對(duì)照，以驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果；仔細(xì)確定一抗與二抗種屬；更換顯色劑（DAB或AEC）;不得使用過期試劑盒，不一樣批號(hào)試劑盒不能混用；免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第33頁3、表示較弱

問題標(biāo)本固定方式不妥或固定時(shí)溫度過高，使部分組織抗原被破壞；抗原修復(fù)方式不妥；抗體濃度過低，或者孵育溫度、時(shí)間不夠；沖洗后切片殘留多出緩沖液。假如陰性對(duì)照沒有反應(yīng)，陽性對(duì)照反應(yīng)良好，而標(biāo)本弱陽性，應(yīng)考慮查標(biāo)本本身原因。

解決方法新鮮組織及時(shí)固定，預(yù)防自溶，固定時(shí)間不超出二十四小時(shí)；封閉時(shí)間不超出10分鐘，或參考產(chǎn)品說明；注意復(fù)染時(shí)間提升抗體濃度，孵育時(shí)間不少于60分鐘（室溫低于15℃，改在37℃溫箱孵育或4℃冰箱過夜）免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第34頁4、染色過強(qiáng)

問題抗體濃度過高或孵育時(shí)間過長孵育溫度過高，＞37℃顯色速度過快或顯色時(shí)間過長；

解決方法降低抗體濃度、孵育時(shí)間；室溫1小時(shí)或4℃過夜；縮短顯色時(shí)間；顯色時(shí)間不超出5～10分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn)；免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第35頁5、非特異性背景染色

問題操作過程中沖洗不充分；加試劑后切片干燥；組織切片折疊；組織中含過氧化物酶未阻斷；組織中含內(nèi)源性生物素；組織抗原彌散；切片粘附劑過厚；血清蛋白封閉不充分；

解決方法每步?jīng)_洗3×5′；預(yù)防切片干燥（必要時(shí)重做）勿以折疊處觀察染色結(jié)果；可配置新鮮3%雙氧水封閉，孵育時(shí)間延長；正常非免疫動(dòng)物血清再封閉；組織及時(shí)固定，固定液要合標(biāo)準(zhǔn)重新配置粘附劑涂液；延長血清封閉時(shí)間；免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第36頁6、染色定位不好除包括抗體原因外，應(yīng)注意標(biāo)本本身前期處理及詳細(xì)操作方法等。免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座第37頁7、封片時(shí)注意事項(xiàng)⑴封片時(shí)動(dòng)作快⑵切片入二甲苯后起白霧，為脫水未盡⑶記住切片組織面⑷防脫片處理⑸蓋片必須大于組織塊⑹封固劑不要滴得太多，也不要太少，預(yù)防氣泡產(chǎn)生。免疫組織化學(xué)技術(shù)專家講座