雷公藤紅素納米混懸劑的制備及抗腫瘤作用研究

雷公藤紅素納米混懸劑的制備及抗腫瘤作用研究

據(jù)統(tǒng)計，在藥物開發(fā)過程中，70%左右的候選人藥物在制劑開發(fā)階段被溶解和生物利用低。雷公藤紅素（celastrol,Cel），又名南蛇藤素，1936年由趙承瑕首次從傳統(tǒng)中藥雷公藤的根部分離得到，是一種五環(huán)三萜類化合物（化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1)近些年來研究者已通過制劑手段來提高Cel的溶解度和生物利用度，降低毒性。如陳欣妍等1儀器、試藥與培養(yǎng)基ZetasizerNanoZS型粒度儀，英國MalvernInstruments公司；MettlerToledoAL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器，北京恒豐長偉科技有限公司；DX-2700型X射線衍射儀，上海精密儀器儀表有限公司；UltiMate3000高效液相色譜儀，美國戴安有限公司；Biotek酶聯(lián)免疫檢測儀，美國伯騰儀器公司；JEM-1400透射電子顯微鏡，日本電子珠式會社；TecanInfiniteM1000PRO多功能酶標(biāo)儀，力臻卓越（北京）科學(xué)儀器有限公司。Cel，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%，成都阿克丁公司，批號CE-180402；泊洛沙姆188(P-188），中國西格瑪有限公司，批號018K0029；色譜乙腈，賽默飛世爾科技有限公司，批號192855；無水乙醇，分析純，北京化工廠，批號20190118；氧化鋯球，直徑為0.4～0.6mm，長沙華尊陶瓷材料有限公司；二甲基亞砜（DMSO），分析純，北京化工廠。小鼠乳腺癌4T1細胞、人肝癌HepG2細胞、人皮膚惡性黑色素瘤SK-MEL-28細胞、人乳腺癌MCF-7細胞均購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心；RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司，批號AD15805337、AD17218271；胎牛血清（批號2017488）、0.25%Trypsin-EDTA(1×），美國Gibco公司；青霉素和鏈霉素雙抗，美國Hyclone公司，批號20170417。2方法和結(jié)果2.1cel-nsp是用微結(jié)合的方法制備的參照文獻方法2.2飽和和藥物晶體的制備沉淀法是基于“bottom-up”原理制備NSps的常用技術(shù)，該法通過將藥物的良溶劑加入到可互溶的不良溶劑中，藥物因過飽和而析出形成納米尺寸的藥物晶體，最后除去有機溶劑。具體操作如下：精密稱取8mgCel溶于0.8mL無水乙醇中，再稱取1mgP188溶于8mL去離子水中，在超聲（25℃，250W）條件下將藥物的醇溶液緩慢滴入到水相中，45℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，即得CelNSps，記為Cel-NSps(b)。2.3樣品測定和zeta電位分別取上述2種方法制備的Cel-NSps適量，適當(dāng)稀釋后用馬爾文激光粒度儀測定其平均粒徑、PDI及Zeta電位，每個樣品平行測定3次，結(jié)果見圖2。Cel-NSps(a)和Cel-NSps(b)的平均粒徑分別為（215.7±0.7）、（133.1±0.8)nm,PDI分別為0.17±0.02、0.13±0.02,Zeta電位分別為（-18.0±0.6）、（-16.9±1.2)mV。2.4cel-nsps的電鏡觀察將上述2種方法制備的Cel-NSps稀釋到100μg/mL，取6.0μL滴到300目銅網(wǎng)上，靜置5min后用濾紙吸干多余液體，室溫放置20min后，滴加6.0μL2%磷鎢酸負(fù)染色液于銅網(wǎng)上，自然晾干，使用JEM-1400透射電子顯微鏡（TEM）觀察Cel-NSps的形態(tài)，結(jié)果見圖3。微型化介質(zhì)研磨法制備的Cel-NSps(a)呈無規(guī)則形狀，而沉淀法制備的Cel-NSps(b)呈球形，在TEM下2種納米粒的粒徑均小于動態(tài)光散射法（DLS）測得的粒徑，這是因為TEM觀測的是干燥粒子的粒徑，而DLS觀測的是水化粒子的粒徑2.5sps法xrd采用真空冷凍干燥機將上述2種Cel-NSps凍干成粉末，然后與原料藥（Cel）、穩(wěn)定劑（P188）、Cel與P188的物理混合物（8∶1）一起進行XRD分析2.6密封放置穩(wěn)定性研究將微量介質(zhì)研磨法制備的Cel-NSps(a)和沉淀法制備的Cel-NSps(b)密封放置于4℃，分別在0、2、4、8、15、23、30d時取樣測粒徑，結(jié)果見表1,4℃放置30d納米粒粒徑無明顯變化，且無肉眼可見的聚集和沉淀現(xiàn)象，說明2種方法制備的Cel-NSps在4℃下能穩(wěn)定存在30d。2.7介質(zhì)的穩(wěn)定性研究2.7.1cel-nsps在生理介質(zhì)中的粒徑變化2.7.2研磨法制備的納米粒中cel的剩余量將Cel-NSps(a)和Cel-NSps(b)分別與1.8%NaCl、10%Glu和PBS(2×）溶液等體積混合；與人工胃腸液、大鼠血漿按體積比1∶4混合，37℃孵育，并分別于0、2、4、6、8h取樣100μL，用900μL色譜甲醇充分混勻后渦旋10min,HPLC測定Cel質(zhì)量濃度，按下式計算Cel剩余量，剩余量=C從圖5可以看出，研磨法制備的納米粒中Cel在5%Glu、PBS和人工腸液中孵育8h后藥物剩余量大于90%；而在0.9%NaCl、人工胃液和血漿中孵育8h后藥物剩余量最低降到81%，推測和該納米粒在0.9%NaCl中粒徑增大、腸液低pH值以及胃蛋白酶和血漿中蛋白類成分和代謝酶有關(guān)。沉淀法制備的納米粒中Cel在0.9%NaCl、5%Glu、PBS、人工胃液和人工腸液中孵育8h后剩余量大于90%；在血漿中剩余量降到84%，可能是受血漿中蛋白類成分和代謝酶影響。2.8cel-nsps的載劑量測量2.8.1條件1色譜柱為VenusilMPC2.8.2樣品制備及色譜條件考察精密稱取一定量的Cel對照品，用色譜甲醇溶解，按“2.8.1”項色譜條件進樣，觀察峰形、對稱性及有無雜質(zhì)峰干擾。同時，按照“2.2”項方法制備Cel-NSps和不含藥的空白NSps，用色譜甲醇稀釋后按照上述色譜條件進樣，并記錄相應(yīng)色譜圖，結(jié)果見圖6。Cel的保留時間為14.3min，峰形對稱，無拖尾；空白納米粒在14.3min未出峰，說明輔料對Cel的檢測沒有干擾，專屬性良好。2.8.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建參照文獻方法2.8.4進樣和進樣的確定取“2.8.3”項下質(zhì)量濃度為5、50、100μg/mL的Cel溶液于1d內(nèi)重復(fù)進樣5次，考察日內(nèi)精密度；日間連續(xù)進樣5d，考察日間精密度。結(jié)果表明，各質(zhì)量濃度的RSD值均小于5%，表明此方法的精密度良好，符合含量測定的要求。2.9外部釋放研究采用透析袋擴散法考察Cel-NSps的體外釋放情況2.10外細胞毒性試驗將生長至對數(shù)期的4T1、HepG2、SK-MEL-28和MCF-7細胞以每孔8×103不同藥物中cel-nsps的體外釋放比較微型介質(zhì)研磨法是對傳統(tǒng)介質(zhì)研磨法的改良，所需原料藥較少，更適合前期在實驗室的制劑處方及工藝研究。此外，該方法可以大大提高藥物的活性，操作簡單，工藝穩(wěn)定，且無需使用有機溶劑，避免了有機溶劑殘留造成的環(huán)境污染和機體毒性，但是該方法制備的納米粒穩(wěn)定性較差藥物晶型可能影響藥物的釋放、藥效和安全性，研究者應(yīng)關(guān)注制備過程中藥物晶型的改變，一般來說介質(zhì)研磨法可以保持藥物原有的晶型，而沉淀法容易造成藥物晶型的轉(zhuǎn)變2種方法制備的Cel-NSps，藥物、輔料、藥載比都相同，因制備方法不同，導(dǎo)致納米粒在生理介質(zhì)中的粒徑變化和藥物在納米粒中的存在形式不同。難溶性藥物的納米粒在生理介質(zhì)中的粒徑，有時和在純水中相近，有時會比在純水中略大，有時粒徑會增大很多甚至出現(xiàn)聚集沉淀。這種變化與藥物本身的性質(zhì)、輔料性質(zhì)、納米組裝方式，納米粒的電位、水化層和表面性質(zhì)，以及生理介質(zhì)的離子強度都有關(guān)系，迄今尚無形成一套理論能夠解釋不同藥物不同輔料的納米粒在生理介質(zhì)中的粒徑變化。介質(zhì)研磨法制備的納米粒粒徑偏大，在人工胃液中粒徑增大較多；沉淀法制備的納米粒粒徑較小，在各種不同介質(zhì)中均較穩(wěn)定。這可能是由于沉淀法制備的納米粒呈球形，制備過程中穩(wěn)定劑P188能更加均勻地覆蓋在納米粒表面；而研磨法制備的納米粒形狀不規(guī)則，穩(wěn)定劑吸附不如沉淀法。介質(zhì)研磨法通常不改變藥物的晶型，Cel依然是以結(jié)晶狀態(tài)存在；而反溶劑沉淀法的制備過程中，藥物溶解成小分子后再自組裝成納米大小的顆粒，有時會保持原來的結(jié)晶形式，有時會形成能量更高的無定形態(tài)，而本研究中，Cel用反溶劑沉淀法制備的納米粒為無定形狀態(tài)。藥物存在形式的不同，導(dǎo)致體外釋放上的不同。在完全相同的條件下，微量介質(zhì)研磨法制備的Cel-NSps(a)，在144h內(nèi)呈勻速、平穩(wěn)、緩慢的釋放；而反溶劑沉淀法制備的Cel-NSps(b)，因無定形態(tài)處于亞穩(wěn)定的高能狀態(tài)，故先經(jīng)歷1個為期48h的快速釋放相，然后是接近坪值的非常緩慢的慢釋放相。但2種納米粒的體外累積釋放都遠遠超過Ce的物理混懸液。體外細胞毒性實驗為下一步體內(nèi)藥效考察建立動物模型提供了參考依據(jù)，從MTT實驗結(jié)果來看，Cel納米粒對4種細胞的IC綜上所述，本研究通過微型介質(zhì)研磨法和反溶劑沉淀法制備了粒徑小、穩(wěn)定性好、載藥量高、可用于口服或靜脈注射的Cel-NSps，且制備方法簡單，易于工業(yè)化大生產(chǎn)，有望成為繼紫杉醇之后的新一代天然抗腫瘤藥物將Cel-NSps(a)和Cel-NSps(b)分別與1.8%NaCl、10%Glu和磷酸鹽緩沖液（PBS)(2×）溶液等體積混合；與人工胃腸液、大鼠血漿按體積比1∶4混合，37℃孵育，并分別在0、2、4、6、8h取樣測粒徑，觀察有無聚集、沉淀，結(jié)果見圖5。與上述生理介質(zhì)共孵育8h后，Cel-NSps(a)在PBS溶液中粒徑變化較小，且無任何渾濁、沉淀現(xiàn)象，說明CelNSps(a)在PBS中穩(wěn)定性較好，而在0.9%NaCl、5%Glu和人工腸液中，Cel-NSps(a)的粒徑有增大趨勢，但是無沉淀現(xiàn)象，說明Cel-NSps(a)在這3種介質(zhì)中穩(wěn)定性一般，而在人工胃液中Cel-NSps(a)粒徑由215nm增大到919nm，說明Cel-NSps(a)在人工胃液中不能穩(wěn)定存在，可