核醫(yī)學(xué)課件：實驗核醫(yī)學(xué)

實驗核醫(yī)學(xué)

ExperimentalNuclearMedicine核醫(yī)學(xué)臨床核醫(yī)學(xué)實驗核醫(yī)學(xué)診斷核醫(yī)學(xué)治療核醫(yī)學(xué)體外診斷體內(nèi)診斷內(nèi)照射近距離照射顯像核素檢查非顯像功能測定吸碘率測定腎圖放射性示蹤放射性標(biāo)記動力學(xué)分析活化分析體外放射分析放射自顯影實驗核醫(yī)學(xué)利用核技術(shù)探索生命現(xiàn)象的本質(zhì)和物質(zhì)變化規(guī)律，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論研究，其內(nèi)容主要包括放射性示蹤、標(biāo)記、動力學(xué)分析、體外放射分析、放射自顯影和活化分析等。體外分析(invitroassay)在體外實驗條件下，以放射性核素或其他易于探測物質(zhì)標(biāo)記的配體(ligand)為示蹤劑，以特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，探測微量生物活性物質(zhì)（激素、蛋白質(zhì)、抗原、藥物等）的檢測技術(shù)。標(biāo)記物：放射性核素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)、酶蛋白等。標(biāo)記配體：抗原、抗體、受體、配體、激素、氨基酸、微生物等。特點靈敏度高特異性強精密度好應(yīng)用面廣方法簡便放射免疫分析

(radioimmunoassay,RIA)Yalow和Berson于1959年創(chuàng)立。應(yīng)用放射性核素標(biāo)記抗原作為示蹤劑，通過競爭性結(jié)合反應(yīng)，對胰島素的測定獲得成功。1977年Yalow因此獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎?；驹碓隗w外條件下，利用定量的放射性核素標(biāo)記的抗原（標(biāo)記抗原，*Ag）和非標(biāo)記抗原（標(biāo)準(zhǔn)Ag、被測Ag）同時與限量的特異性抗體（Ab）進行競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)，通過測定放射性免疫復(fù)合物的量來計算被測Ag的濃度。*Ag與Ag免疫活性相同*Ag＋Ag>Ab*Ag＋Ag+Ab*Ag-Ab+*Ag

Ag-Ab+Ag(B)Bind(F)FreeAg=*Ag,AgAb=*AgAbAg>*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag<*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag*AgAb*AgAbAgAb*Ag++++++++++++++++++++2550100200400800*AgAb分離B、FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456Ag濃度B%=B/(B+F)F%=F/(B+F)R=B/F2550100200400800*AgAb分離B、FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456B%？Ag濃度B%標(biāo)準(zhǔn)曲線操作基本步驟1.加樣：加樣總體積要保持一致，所處的介質(zhì)環(huán)境也要一致。2.孵育：根據(jù)不同的分析對象孵育的溫度和時間不同，一般是37℃。3.分離：選擇好的分離方法分離抗原－抗體復(fù)合物（B）和游離抗原（F）。4.測量：測量游離或結(jié)合物部分的放射性。5.數(shù)據(jù)處理：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測物濃度的計算。

實際操作中，一般要設(shè)立幾個反應(yīng)管：1．最大結(jié)合管（Bo）：標(biāo)準(zhǔn)抗原的量為0，只有標(biāo)記抗原和特異性抗體時，標(biāo)記抗原與抗體充分反應(yīng)后分離B和F，所測得的B的放射性為Bo。這是沒有標(biāo)準(zhǔn)抗原與之競爭時，標(biāo)記抗原和抗體的結(jié)合達最大值。2．非特異結(jié)合管（NSB）：標(biāo)記抗原除了要和特異性抗體結(jié)合以外，還要和一些雜質(zhì)蛋白或容器的管壁等結(jié)合，對我們的分析結(jié)果產(chǎn)生影響。NSB管是用蒸餾水代替特異性抗體，在相同條件下反應(yīng)后測得的放射性。3．總放射性管（T）：反應(yīng)后不分離就直接測得的放射性就是總放射性。表示標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物和游離的標(biāo)記抗原的總放射性。4．標(biāo)準(zhǔn)管（B1~Bn）：放有不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原，再加入相同量的標(biāo)記抗原和特異抗體。一般在反應(yīng)后分離出沉淀，測定沉淀的放射性作為B。5．樣品管（Bx）：用同劑量的樣品代替標(biāo)準(zhǔn)管中的標(biāo)準(zhǔn)抗原，在相同條件下反應(yīng)和分離，同樣取沉淀測得其放射性，就可以在繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到樣品的濃度。1.抗體2.標(biāo)記抗原3.非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)抗原（標(biāo)準(zhǔn)品）基本試劑2、標(biāo)記抗原1）比活度和放化純度足夠高比活度——每微克抗原上標(biāo)記放射性核素的千貝可數(shù)（KBq/μg）放化純度——具有免疫活性的標(biāo)記抗原占總放射性的百分數(shù)。>95%2）半衰期足夠長3）保持原有抗原的特性大分子：125I小分子：3Hor125I3、非標(biāo)記抗原（標(biāo)準(zhǔn)品）化學(xué)結(jié)構(gòu)：與被測物化學(xué)結(jié)構(gòu)相同化學(xué)純度：高度純化化學(xué)度量：準(zhǔn)確定量穩(wěn)定性：保持免疫活性不變分離方法雙抗體法沉淀法雙抗體法+沉淀法吸附分離法固相分離法葡萄球菌A蛋白分離法分離方法的要求分離完全、快速、重復(fù)性好。不影響免疫反應(yīng)的平衡：即是要求在分離過程中不使抗原-抗體復(fù)合物解離或形成新的復(fù)合物。受環(huán)境因素（溫度、PH值等）的影響小。操作簡便，分離劑來源豐富、價廉。使用合適的方法以檢查、表示和消除來自試劑藥盒和測量體系的誤差，并使這種誤差降低到某一允許水平。

質(zhì)控目的：1．通過對一批測定結(jié)果的評價，按照要求決定結(jié)果的取舍。2．通過對不同批測定結(jié)果的評價，發(fā)現(xiàn)誤差原因，改善實驗方法，提高檢測質(zhì)量，保證結(jié)果的可靠性。

質(zhì)量控制

(qualitycontrol,QC)質(zhì)量控制指標(biāo)

1、精密度（precision）

即可重復(fù)性2、準(zhǔn)確度（accuracy）

一般要求達到90%~110%

3、靈敏度（sensitivity）最小可測量4、特異性（specificity）

交叉反應(yīng)率5、健全性（perfectly）達到實驗?zāi)繕?biāo)的有效程度6、穩(wěn)定性（stability）保持原有性能不變的能力ABC體外放射分析的質(zhì)控實驗室內(nèi)部質(zhì)控實驗室外部質(zhì)控批內(nèi)質(zhì)控批間質(zhì)控批內(nèi)精密度與偏聽偏信倚分析批間精密度與偏聽偏信倚分析尋找誤差產(chǎn)生的原因、改進分析工作質(zhì)量對某種分析方法、試劑或試劑盒進行綜合評價對不同實驗室的分析工作質(zhì)量進行比較向主管部門提供信息，對方法、試劑（盒）進行改進，促進實驗室內(nèi)部的質(zhì)量控制工作實驗室內(nèi)部質(zhì)控

（internalqualitycontrol，IQC）是一個實驗室內(nèi)部實驗方法的質(zhì)量控制，以便在一個人的同一批或不同批實驗中，不同操作者和不同方法之間有可比性。包括批內(nèi)質(zhì)控和批間質(zhì)控。最高結(jié)合率(B0%)一般要求在30%～50%非特異性結(jié)合率(NSB%)一般要求＜5%最低濃度管結(jié)合率和最高濃度管結(jié)合率之差要求大于30%標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸的參數(shù)要求a、b值穩(wěn)定，r＞0.99ED25、ED50與

ED75指標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)合率在25%、50%和75%時對應(yīng)的抗原濃度值，反映標(biāo)準(zhǔn)曲線的穩(wěn)定性，有助于批間結(jié)果的比較。質(zhì)控圖連續(xù)測定10批以上高、中、低三種已知濃度的質(zhì)控血清，求出各自的均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差x±s，然后作圖。以后每次分析時均要同時測定此高、中、低質(zhì)控血清，將測定值標(biāo)在圖上。

WHO要求，在一次實驗中有下列情況之一者，其結(jié)果應(yīng)予舍棄：①三種QCS中有一個測定值＞3s②三種QCS中在同一方向上有兩種＞2s③三種QCS均在同一方向上＞1s質(zhì)控圖實驗室外部質(zhì)控

（externalqualitycontrol，EQC）目的：提高各實驗室之間檢測結(jié)果的可比性。方法：在權(quán)威機構(gòu)的領(lǐng)導(dǎo)下，使用相同質(zhì)控血清，按照統(tǒng)一的評價方案和方法，對各實驗室之間的測定結(jié)果進行比較分析，發(fā)現(xiàn)誤差，找出原因，提出改進方法，以提高實驗室之間所得結(jié)果的可信性和可比性。免疫放射分析

(immunoradiometricassay，IRMA)將過量的標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合，分離結(jié)合的標(biāo)記抗體與未結(jié)合的多余的標(biāo)記抗體，測定復(fù)合物的放射性，其活度與待測抗原的量呈正相關(guān)。Ag＋*Ab

Ag-*Ab＋*AbAg為抗原，*Ab為標(biāo)記抗體，Ag-*Ab為抗原與標(biāo)記抗體的復(fù)合物。IRMA的實驗方法雙抗體夾心法標(biāo)記第三抗體法雙標(biāo)記抗體法生物素-親和測定系統(tǒng)IRMA的特點標(biāo)記物的放射性活度高反應(yīng)達到平衡快比RIA更高的靈敏度（約10～100倍）比RIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍更寬比RIA的特異性更高穩(wěn)定性好目前僅能檢測大抗原B%B%擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的NSB擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的NSBIRMA的標(biāo)準(zhǔn)曲線及非特異結(jié)合曲線RIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線及非特異結(jié)合曲線IRMA和RIA低劑量區(qū)的不確定因素示意圖RIA++或01IRMA+1IRMA與RIA工作原理的主要區(qū)別RIAIRMA競爭性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)非競爭性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)采用標(biāo)記抗原采用標(biāo)記抗體三種主要反應(yīng)試劑二種主要反應(yīng)試劑所用抗體是限量的所用抗體是過量的*AgAb的量與待測Ag的量呈負相關(guān)Ag*Ab的量與待測Ag的量呈正相關(guān)反應(yīng)到達平衡慢反應(yīng)到達平衡快非特異結(jié)合主要影響高劑量區(qū)非特異結(jié)合主要影響低劑量區(qū)低劑量區(qū)有不確定因素低劑量區(qū)無不確定因素其它體外放射分析法放射受體分析法競爭性蛋白結(jié)合分析法放射酶學(xué)分析法放射微生物分析法放射受體分析法(radioreceptorassay,RRA)基于受體與配體的特異性結(jié)合的分析方法，其競爭結(jié)合原理與放射免疫分析相似。如肽類激素受體、兒茶酚胺受體等。競爭性蛋白結(jié)合分析法(competitiveproteinbindingassay，CPBA)不需要抗體，用血漿或其他生物組織中存在的特異結(jié)合蛋白質(zhì)作為結(jié)合劑對某些物質(zhì)進行微量分析。如甲狀腺激素結(jié)合蛋白、皮質(zhì)類固醇結(jié)合蛋白等。放射酶學(xué)分析法(radioenzymaticassay,REA)以特異酶作為結(jié)合劑。如蛋白激酶測定環(huán)核苷酸。放射微生物分析法(radiomicrobiologicassay)以特異微生物作為結(jié)合劑。如用某種微生物測定葉酸。非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)酶免疫分析技術(shù)熒光免疫分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)

(chemicalluminescentimmunoassay，CLIA)利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)代替放射性核素作為示蹤物的超微量分析技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光物質(zhì)在氧化劑或催化劑的作用下能形成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物，并在退激時將能量轉(zhuǎn)化為光子的物質(zhì)。直接化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析生物發(fā)光免疫分析用酶分子代替放射性核素標(biāo)記抗原或抗體，進行競爭性或非競爭性免疫分析的技術(shù)。應(yīng)用最多的就是酶聯(lián)免疫吸附分析法。結(jié)合了抗原抗體高特異性和酶促反應(yīng)的高敏感性的檢測技術(shù)，靈敏度高，特異性強，易操作。酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)

(enzymeimmunoassay，EIA)

ELISA是用酶分子標(biāo)記抗體，進行與IRMA相似的夾心法免疫反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后分離結(jié)合部分和游離部分，利用結(jié)合部分上的酶分子的催化活性將底物轉(zhuǎn)化為特定的顏色，用分光光度計測定，顏色的深淺和酶量成正比，而酶量又和復(fù)合物的量成正比。常用的酶是辣根過氧化物酶，底物是四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，反應(yīng)后顯黃色。酶聯(lián)免疫吸附分析法

(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)

熒光免疫分析技術(shù)

(fluorescenseimmunoassay，F(xiàn)IA)利用熒光檢測技術(shù)與抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合的一種非放射性免疫分析方法。主要分為以下三種類型：時間分辨熒光免疫分析熒光偏振免疫分析熒光酶免疫分析

微生物——RMA

酶——REA

受體——RRA

特異結(jié)合蛋白——CPBA

改變結(jié)合體對放射性技術(shù)Ag

Ag-Ab

RIA+Ab免疫學(xué)技術(shù)※Ag

※Ag-Ab

改變標(biāo)記物第一階段第二階段第三階段小分子半抗原聯(lián)接125I單克隆技術(shù)固相技術(shù)藥品化Kit理論與實踐上更豐富更完善的RIA1.可測物達300多種2.涉及多個臨床與基礎(chǔ)學(xué)科3.

RIA顯像4.

RIA治療

熒光—FIA—IRMA化學(xué)發(fā)光—CIA

酶—EIA放射自顯影

(Autoradiography,ARG)利用射線使感光材料感光形成潛影，經(jīng)顯影定影后形成圖像，判斷放射性示蹤劑的分布部位和數(shù)量（半定量）的技術(shù)。宏觀自顯影

(macroscopicARG)又稱大體自顯影，觀察范圍較大，分辨率低，只能供肉眼或放大鏡觀察，或根據(jù)黑度判斷示蹤劑的分布和相對數(shù)量。適用于小動物的整體標(biāo)本，大動物的臟器或肢體，以及層析板、免疫沉淀板、骨骼、牙齒的磨片或剖面等。光學(xué)顯微鏡自顯影

(lightmicroscopicARG)借助顯微鏡進行組織或細胞學(xué)觀察，分辨率較高，根據(jù)銀顆粒判斷示蹤劑的分布部位和數(shù)量。適用于組織切片、細胞涂片等標(biāo)本。電子顯微鏡自顯影

(electronmicroscopicARG)用于示蹤劑在亞細胞結(jié)構(gòu)中分布情況的研究，能顯示普通顯微鏡觀察不到的細微結(jié)構(gòu)與放射性核素分布的關(guān)系。適用于細胞超微結(jié)構(gòu)，甚至大分子（DNA、RNA）上的精確定位和定量，也可觀察動態(tài)過程。要求標(biāo)本在100nm以下的超薄切片，乳膠厚度僅相當(dāng)于銀顆粒直徑（約140nm）。感光材料類型組成溴化銀直徑（μm）厚度（μm）用途原子核乳膠溴化銀明膠0.1-0.24光鏡自顯影電鏡自顯影氚片溴化銀碘化銀明膠1.05-103H標(biāo)記化合物的宏觀自顯影X線片溴化銀碘化銀明膠2.5-3.015-30核素能量較高的宏觀自顯影放射性核素的選擇能量低、射程短、半衰期長的核素。純β射線核素(3H、14C、32P、35S、45Ca、59Fe)β、γ衰變核素(131I)電子俘獲衰變的核素(125I、51Cr)γ躍遷的核素(99Tcm)電子俘獲、γ躍遷核素的核素發(fā)射的俄歇電子和內(nèi)轉(zhuǎn)換電子也可形成較好的自顯影圖像。純γ射線穿透力強，自顯影效果差。常用放射性核素放射性示蹤技術(shù)以放射性核素或其標(biāo)記的化合物作為示蹤劑，應(yīng)用射線探測儀器，通過探測標(biāo)記在化學(xué)分子上的放射性核素發(fā)射的射線，來顯示被標(biāo)記化學(xué)分子的蹤跡，用于研究示蹤劑在生物體系或外界環(huán)境中的分布及其變化規(guī)律的一門科學(xué)。是核醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的方法學(xué)基礎(chǔ)。放射性示蹤技術(shù)的特點靈敏度高（-1810~

-1410g）方法簡便、準(zhǔn)確合乎生理條件定性、定量、定位與動態(tài)研究相結(jié)合專業(yè)技術(shù)性強放射性示蹤技術(shù)類型體內(nèi)（invivo）示蹤技術(shù)臟器與組織顯像放射性核素治療功能測定體液與細胞容積測定物質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)化及動態(tài)平衡體外（invitro）示蹤技術(shù)體外放射分析細胞動力學(xué)放射自顯影活化分析放射性核素稀釋法是將待測元素與放射性同位素示蹤劑充分混合，然后分離出一部分純凈待測樣品，測其比活度，由比活度的變化來計算出待測元素的含量?；瘜W(xué)上這種方法常用來測定不易分離組分的含量，可分為正稀釋法和反稀釋法。醫(yī)學(xué)上可用于測定血容量、全身水含量及細胞外液量等。正稀釋法也稱直接稀釋法，是將一種比活度和質(zhì)量已知的放射性核素或其標(biāo)記化合物作為標(biāo)準(zhǔn)物加到含有該放射性核素的穩(wěn)定同位素或其化合物中，混合均勻后分離提出其中的一部分，然后測其比活度，計算待測物的含量。反稀釋法是將一種質(zhì)量已知的穩(wěn)定同位素加到含有其放射性同位素的待測樣品中，混合均勻后分離提純一部分化合物，再測定其比活度，計算出待測樣品中原有放射性同位素的質(zhì)量。摻入試驗3H-TdR摻入DNA作為淋巴細胞轉(zhuǎn)化的指標(biāo)觀察細胞免疫情況；3H-TdR摻入試驗研究細胞周期；125I-UdR摻入RNA試驗研究腫瘤細胞增殖速度、研究各種抗腫瘤藥物作用；通過標(biāo)記不同前身物（如氨基酸、核苷酸等）研究蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的合成、結(jié)構(gòu)、