表面活性劑協(xié)同發(fā)酵谷氨酸工藝的研究

表面活性劑協(xié)同發(fā)酵谷氨酸工藝的研究

2004年，中國的糧氨酸鈉（味精）產(chǎn)量超過100萬噸，達(dá)到世界第一。味精生產(chǎn)企業(yè)正向大型化、集約化發(fā)展,生產(chǎn)水平不斷提高,但是與一些西方國家比較,我國的生產(chǎn)效率還有待更進(jìn)一步的提高,生產(chǎn)成本也急需更進(jìn)一步的下降,因此提高谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸率是一個亟待解決的問題。表面活性劑是在加入很少量時既能大大降低溶劑的表面(界面)張力的一大類有機(jī)化合物國內(nèi)外的研究表明,將表面活性劑作為發(fā)酵促進(jìn)劑的研究越來越多,主要應(yīng)用在以發(fā)酵法生產(chǎn)酶制劑大多數(shù)專家認(rèn)為由于表面活性劑獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征,使其具有增加細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的作用,從而使代謝產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外,消除了代謝產(chǎn)物的負(fù)反饋?zhàn)饔?完成產(chǎn)物在發(fā)酵液中的蓄積,最終達(dá)到了提高產(chǎn)率的目的。基于以上原理,為了使谷氨酸生產(chǎn)產(chǎn)率進(jìn)一步提高,本文選擇了幾種新型的表面活性劑與傳統(tǒng)的表面活性劑作為谷氨酸發(fā)酵促進(jìn)劑作比較,在搖瓶條件下研究了各種表面活性劑對細(xì)菌生長及其谷氨酸在細(xì)胞外累積的影響,同時亦為表面活性劑作為發(fā)酵促進(jìn)劑的原理研究提供有效的數(shù)據(jù)支持。1材料和方法1.1主要材料和設(shè)備1.1.1蘑菇谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)T-613,廣州市微生物研究所保存菌種。1.1.2試劑、實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品十二烷基硫酸鈉(SDS)、吐溫60(Tween-60)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、正丁醇(Butanol)、異丙醇(Isopropanol)、二甲基亞砜(DMSO)均為市售分析純化學(xué)試劑;芹菜素硬脂酸酯(PGS),溴化五甲基二乙撐基三硬脂基三銨(3-RdienQ)、聚氧乙烯基失水山梨醇單脂肪酸酯三季銨鹽(CTTE)、N,N,N’-五甲基二乙烯三聚氧乙烯硬脂酸酯(MDTPS)為本實(shí)驗(yàn)室自行合成;二甲基-乙基-甜菜堿(DEBT)為廣州慧源綠色生物化工有限公司提供(編號為企業(yè)產(chǎn)品代號)?？梢姺止夤舛扔?Spectrumlab22PC):上海棱光技術(shù)有限公司;生化培養(yǎng)箱(DGG-9070B型):上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;新型恒溫振蕩器(ZHWY-21020C):上海智城分析儀器制造有限公司;超凈化工作臺(ZHJY-1214B):上海智城分析儀器制造有限公司;超聲波超微粉碎機(jī)(Scientz-08):常州諾基儀器有限公司。1.1.3培養(yǎng)基及溶液配制斜面培養(yǎng)基:蛋白胨1.0%,牛肉膏1.0%,氯化鈉0.5%,瓊脂2.0%,pH值7.0;32℃恒溫培養(yǎng)12~16h,保存于4℃冰箱待用。種子培養(yǎng)基:葡萄糖3.0%,玉米漿1.0%,尿素0.5%(分消),磷酸氫二鉀0.1%,七水硫酸鎂0.04%,七水硫酸亞鐵2×10發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖13.0%,玉米漿0.6%,初始培養(yǎng)基尿素0.6%(分消),三水磷酸氫二鈉0.7%,七水硫酸鎂0.06%,氯化鉀0.05%,七水硫酸亞鐵2×10表面活性劑溶液的配制:將SDS、Tween-60、DEBT均配制為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.0%的溶液待用;將CTAB、PGS、3-RdienQ、CTTE、MDTPS均配置為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的溶液待用。1.2分析1.2.1測定氨基酸含量茚三酮比色法1.2.2待測細(xì)胞的制備超聲波細(xì)胞破碎法:取一定量的發(fā)酵液置于離心管中,在10000r/min高速離心10min,蒸餾水清洗細(xì)胞2次,得到待測細(xì)胞;利用超聲波細(xì)胞破碎儀,破碎30min,濾去菌體,得到上層清液,按照上述茚三酮比色法測量。1.2.3檢測細(xì)菌的生長量將發(fā)酵液稀釋10倍使用分光光度計在650nm處測定吸光度OD1.2.4測定殘?zhí)橇坎捎觅M(fèi)林試劑法。1.2.5ph測試使用精密pH試紙檢測。2結(jié)果與分析2.1菌種產(chǎn)酸率的確定凍干菌種經(jīng)活化培養(yǎng)后,篩選產(chǎn)酸率高且產(chǎn)酸比較穩(wěn)定的菌株,接保藏斜面保藏于4℃冰箱中,待用。為了更好確定加入表面活性劑的時間和劑量,研究了本菌種的基本發(fā)酵特性如圖1,圖2所示。由圖1知,隨著發(fā)酵時間的推移,由于菌種對尿素的利用和谷氨酸的產(chǎn)生,使發(fā)酵體系的pH下降,當(dāng)pH下降到7.0以下時,及時向體系中補(bǔ)充一定量的尿素,一方面為菌種生長與產(chǎn)酸提供所必需的氮源,另一方面尿素被菌種利用時所產(chǎn)生的NH從圖2可知,本菌種的適應(yīng)期一般為2~3h,由于種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基成分基本相同,因此適應(yīng)期比較短;對數(shù)生長期在10~20h;穩(wěn)定期為20~40h;產(chǎn)酸期為16~48h。在沒有添加表面活性劑的情況下,菌種產(chǎn)酸率基本穩(wěn)定在3.0%左右。本實(shí)驗(yàn)選用菌種產(chǎn)酸率較目前生產(chǎn)菌種的產(chǎn)酸率相差較大,是因?yàn)楸疚膶儆诨A(chǔ)研究范疇,實(shí)驗(yàn)選用發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸的原始菌種,此菌種是從土壤中直接分離純化而得,并未進(jìn)行定向誘變育種。另外取得高產(chǎn)菌種實(shí)屬不易,對于企業(yè)而言,生產(chǎn)菌種為技術(shù)核心,具有高度的機(jī)密性,索取此類高產(chǎn)生產(chǎn)菌種不易;對于擁有高產(chǎn)菌種的高校和研究機(jī)構(gòu),其研究成果有較高的經(jīng)濟(jì)價值,亦不輕易外傳。但是基礎(chǔ)研究表明生產(chǎn)谷氨酸的菌種都屬于細(xì)菌,細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝循環(huán)基本一致,產(chǎn)酸機(jī)理也相差無幾,因此可以認(rèn)為在選用原始菌種的發(fā)酵體系中,根據(jù)有無使用表面活性劑的對比實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)——產(chǎn)酸率所提高的相對比率可較好反映表面活性劑作為谷氨酸發(fā)酵促進(jìn)劑的功效性,對谷氨酸發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)具很大的參考價值。2.2陽離子表面活性劑的殺菌效果本實(shí)驗(yàn)選擇了8種表面活性劑和三種常用有機(jī)溶劑分別為SDS、Tween-60、DEBT、CTAB、PGS、3-RdienQ、CTTE、MDTPS、Butanol、Isopropanol、DMSO。由于各種表面活性劑的性質(zhì)各異,對微生物的毒性也不同,因此在添加劑量與加入時間上亦存在差異。一般來說陽離子表面活性劑對生物的毒性較大,非離子表面活性劑毒性小,對生物的生長影響較弱,陰離子表面活性劑的毒性和殺菌力介于兩者之間由表1可見,除了SDS、Butanol外,其他7種表面活性劑和2種溶劑在特定的加入劑量和加入時間對該菌種產(chǎn)酸率有一定程度的提高,這可能是因?yàn)镾DS所帶負(fù)電抑制谷氨酸的分泌;Butanol效果不佳的原因在于其殺菌能力較強(qiáng),菌種對其較為敏感。對于毒性較大的陽離子表面活性劑3-RdienQ加入劑量要少且加入時間在產(chǎn)酸期,否則會抑制產(chǎn)酸;對于毒性較小的非離子和兩性表面活性劑加入劑量在體積分?jǐn)?shù)為0.1%~1.0%較為有效,加入時間在菌種生長的對數(shù)期較為有效;對于作為非離子表面活性劑的PGS情況特殊,該菌種對其比較敏感,加入劑量要控制在體積分?jǐn)?shù)為0.01%~0.1%,加入時間在產(chǎn)酸期。綜合比較認(rèn)為CTTE與DMSO的效果相對較好,可將產(chǎn)酸率分別提高26.13%和22.22%。2.3不同體積分?jǐn)?shù)的ctte表面活性劑對產(chǎn)酸率的影響在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CTTE與DMSO,CTTE加入時間為4h,DMSO加入時間為16h,最終測定各個樣品的產(chǎn)酸率和OD從圖3可知,當(dāng)加入CTTE表面活性劑的體積分?jǐn)?shù)在0~0.16%之間時,谷氨酸發(fā)酵的產(chǎn)酸率均較空白實(shí)驗(yàn)有一定程度的提高,其中當(dāng)加入體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.08%時,谷氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大值6.15%,比對照實(shí)驗(yàn)產(chǎn)率提高了28.39%;同時從最終OD從圖4可知,當(dāng)加入DMSO的體積分?jǐn)?shù)在0~0.16%之間,谷氨酸發(fā)酵的產(chǎn)酸率均較空白實(shí)驗(yàn)有一定程度的提高,其中當(dāng)加入體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.10%時,谷氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大值6.09%,比對照實(shí)驗(yàn)產(chǎn)率提高了25.57%;同時從最終OD2.4最佳劑量確定因?yàn)楸砻婊钚詣┚哂懈淖兗?xì)胞膜通透性和殺菌作用,不同的加入時間直接影響細(xì)菌的生長代謝。因此通過改變表面活性劑的加入時間,尋找最佳的加入時間對發(fā)酵產(chǎn)酸具有重要的意義,結(jié)果如圖5、圖6所示。實(shí)驗(yàn)中表面活性劑的添加劑量為上述實(shí)驗(yàn)所得到的最佳劑量,即CTTE添加體積分?jǐn)?shù)為0.08%,DMSO添加體積分?jǐn)?shù)為0.10%。從圖5可知,將CTTE在發(fā)酵菌種的生長對數(shù)期加入或者是在產(chǎn)酸期后期加入,即0~6h或者20h以后加入對發(fā)酵產(chǎn)酸率有一定程度的抑制作用,特別是在發(fā)酵前期0h~6h加入,產(chǎn)酸率明顯降低,同時菌種的OD從圖6可知,DMSO表面活性劑在發(fā)酵菌種的生長對數(shù)期加入對發(fā)酵產(chǎn)酸率有一定的促進(jìn)作用,特別是在發(fā)酵5~10h加入,產(chǎn)酸率達(dá)到了最大值6.21%,較空白實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)酸率提高了23.95%。而從最終OD2.5ctte與dmso協(xié)同使用對產(chǎn)酸率的影響由于CTTE與DMSO各有利弊,前者可以較大程度提高產(chǎn)酸率,但是發(fā)酵周期相對較長,同時前者的加入對于菌種的生長有一定程度的影響;后者的加入對于菌種的生長沒有很大的影響,并且產(chǎn)酸率有一定程度的提高,并且它可以縮短發(fā)酵的周期,因此考慮將兩種表面活性劑協(xié)同使用,發(fā)揮各自的優(yōu)勢,彼此掩蓋對方的不足,進(jìn)一步提高谷氨酸的發(fā)酵產(chǎn)率。為了得到CTTE與DMSO的協(xié)同效果,設(shè)計正交試驗(yàn)表L從表3可知,A因素的三個水平的優(yōu)劣順序?yàn)镵驗(yàn)證正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳工藝條件,按照優(yōu)化工藝參數(shù)進(jìn)行新一批發(fā)酵,設(shè)置空白實(shí)驗(yàn)與之相比較,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。從產(chǎn)酸率曲線可看出,在加入MDSO和CTTE之后,菌種產(chǎn)酸的初始時間提前了4h,并且產(chǎn)酸的速率也較空白實(shí)驗(yàn)有所提高。當(dāng)空白實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵44h后,達(dá)到產(chǎn)酸率最大值4.8%,而發(fā)酵36h后有表面活性劑的體系產(chǎn)酸率達(dá)到最大值6.55%,殘?zhí)琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)也下降到了1.0%以下,其產(chǎn)酸率提高了36.46%;產(chǎn)酸率達(dá)到最大值后繼續(xù)發(fā)酵,則產(chǎn)酸率有所下降,主要是因?yàn)榫N對谷氨酸有一定的利用能力。從最終OD2.6產(chǎn)品的發(fā)酵效率加入MDSO和CTTE后,細(xì)胞膜中脂肪酸的比例發(fā)生了變化,使菌體細(xì)胞膜的通透性增大,更加有利于谷氨酸向細(xì)胞外分泌,從而減小了產(chǎn)物對于菌體代謝的負(fù)反饋?zhàn)饔?提高了谷氨酸的轉(zhuǎn)化效率,從而達(dá)到了縮短發(fā)酵周期的目的,有效地提高了生產(chǎn)效率。從圖7可知,在加入MDSO和CTTE的發(fā)酵條件下,谷氨酸的發(fā)酵達(dá)到產(chǎn)酸最大值的時間較空白實(shí)驗(yàn)分別提前了8h,即發(fā)酵周期從原來的44h縮短為36h。因此在兩種表面活性劑聯(lián)合使用時,可以縮短發(fā)酵周期,降低發(fā)酵的能量消耗,很大程度的提高了生產(chǎn)的效率,降低了生產(chǎn)的成本。2.7表面活性劑促進(jìn)有關(guān)酵母菌種染色的情況由于表面活性劑具有特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu),即親水基團(tuán)和疏水基團(tuán),當(dāng)溶液體系中的表面活性劑濃度達(dá)到其臨界膠束濃度之后,會表現(xiàn)出一些特殊界面性質(zhì),其中有一個就是可以與某些色素結(jié)合起來,形成一個聚集體。另外在微生物學(xué)中的染色方面,革蘭氏染色和實(shí)驗(yàn)室簡易染色被廣為使用,并且得知微生物活體細(xì)胞染色較為困難,一般在染色以前都是將其固定在載玻片上,從而進(jìn)行觀察。倘若表面活性劑與細(xì)胞表面結(jié)合或者是沉積,則通過對活體的染色可以在顯微鏡下觀察得到。由圖8可以觀察到:發(fā)酵體系在加入表面活性劑之前,對于T-613活體細(xì)胞很難染色,菌體本身仍然透明,并且可以清楚觀察少數(shù)菌體已經(jīng)兩兩成對,呈八字形,這是即將進(jìn)入產(chǎn)酸期的一個特征。由圖9可以觀察到:一半以上的菌體已經(jīng)可以被染成藍(lán)色,仍然存在一少部分菌體沒有被染色,這一現(xiàn)象說明在表面活性劑加入后,在菌體表面進(jìn)行了沉積和結(jié)合,從而是活體細(xì)菌可以進(jìn)行染色,另外一部分沒有被染色是因?yàn)槌练e的濃度還沒有達(dá)到表面活性劑的臨界膠束濃度。不排除有菌種死亡的情況,但是不可能被染色的全部死亡,因?yàn)榫N的產(chǎn)酸率還在不斷的提高,未被染色的菌種比例不可能發(fā)酵產(chǎn)生大量的谷氨酸。由圖10可以觀察到:全部的菌體已經(jīng)可以被染成藍(lán)色,這一現(xiàn)象說明在表面活性劑加入后,在菌體表面進(jìn)行了沉積和結(jié)合,改變了細(xì)胞的通透性,從而是活體細(xì)菌可以進(jìn)行染色,并且此時由于表面活性劑的加入,或多或少會對菌種的生長造成影響,并且可能殺死一部分菌種,因此會在穩(wěn)定期較大增加菌種的死亡率,提前進(jìn)入衰亡期,這也是發(fā)酵周期縮短的一個重要原因。3表面活性劑加入對氨基酸發(fā)酵的影響3.1通過對MDSO和CTTE的加入時間和加入劑量的單因素實(shí)驗(yàn)分析可知,MDSO表面活性劑在菌種生長對數(shù)期8h加入體積分?jǐn)?shù)為0.08%,則可以將谷氨酸發(fā)酵的產(chǎn)酸率提高24.14%,而在產(chǎn)酸初期20h加入體積分?jǐn)?shù)為0.10%的CTTE,可以將谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸率提高23.95%,可見兩種表面活性劑作為谷氨酸發(fā)酵促進(jìn)劑的有顯著效果的。3.2研究了兩種表面活性劑同時加入的協(xié)同效果,研究結(jié)果表明:菌種生長對數(shù)期(10h)