間接競爭elisa法檢測肉雞中的磺酸類成分

間接競爭elisa法檢測肉雞中的磺酸類成分

獸藥（包括藥物提取物）廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)。它在減少發(fā)病率和死亡率、促進生長、提高飼料利用率和改善食品狀況方面發(fā)揮著重要作用。這是現(xiàn)代牲畜不可或缺的基礎(chǔ)。食用含有殘留獸藥的動物性食品后,一般對人不表現(xiàn)急性毒性作用,但如長時間攝入低劑量殘留獸藥的動物性食品,則可造成獸藥在人體內(nèi)蓄積引起各種組織器官發(fā)生病變,甚至癌變。因而加強獸藥殘留的監(jiān)控和檢測工作具有重要的意義。世界各國對SQX的殘留問題非常重視,并且投入大量經(jīng)費進行危害分析、控制用量及檢測方法等方面的研究。本實驗采用間接競爭ELISA方法對雞肉中的磺胺喹惡啉進行檢測。1材料表面來自于吉林某肉食雞養(yǎng)殖場,隨機抽取23個樣品,宰殺后取胸肉和腿肉。試驗中使用的酶制劑和生化制劑均購自相關(guān)的技術(shù)公司。2方法2.1器振蕩20min用均質(zhì)器均質(zhì)樣本,然后取2.0±0.05g的均質(zhì)物至50mL聚苯乙烯離心管中,加入8mL乙晴,立即用振蕩器振蕩20min,3000r以上離心5min;取上層清液置于2.5mL至10mL干凈的玻璃試管中,于50～60℃水浴氮氣流下吹干;加入1mL正己烷,用渦旋儀渦動20s溶解干燥殘留物,再加入1mL0.2M磷酸鹽緩沖液,用渦旋儀渦動1min,3000r以上離心10min除去上層正己烷相,取下層20L用于分析。2.2測試步驟2.2.1種液體試劑的使用將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出,置于室溫(20～25℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均需搖勻。2.2.22.2.32.2.4編號將待測樣品和標準品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣品和標準品做2孔平行,并記錄標準孔和樣品孔所在的位置。2.2.5免疫二抗反應(yīng)加標準品/樣品各20L到對應(yīng)的微孔中,然后加入酶標二抗50L/孔,再加入抗體工作液80L/孔,輕輕振蕩搖勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)60min。2.2.6吸水紙拍干法小心揭開板膜,將微孔內(nèi)液體甩干,用洗滌工作液250L/孔,充分洗滌4～5次,每次間隔10s,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。2.2.7顯色加入底物液A液50L/孔,再加入底物液B液50L/孔,輕輕振蕩搖勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min。2.2.8酶檢測要求加終止液50L/孔,輕輕振蕩搖勻,設(shè)定酶標儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)),測定每孔OD值。(若無酶標儀,則不加終止液,用目測法可進行判定)。3結(jié)果3.1酰胺喹惡啉殘留量的計算本次實驗實際得出標準品磺胺喹惡啉的殘留量與標準品理論上磺胺喹惡啉的殘留量有一定的偏差見表1。3.223個樣品的sqx保留經(jīng)過分析,試驗中23份樣本的殘留量見表2。4討論4.1固相抗體反應(yīng)固相競爭ELISA法,用來測定小分子抗原,受檢抗原和酶標抗原競爭性地與固相抗體結(jié)合,因此,結(jié)合于固相的酶標抗原量與受檢抗原的量成反比。將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)形成固相抗體,洗滌、封板;待測管中加受檢樣品與一定量酶標抗原的混合液,使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢樣品中無抗原,則酶標抗原能順利的與固相抗體結(jié)合。如果受檢樣品中有抗原,這些抗原會與固相抗體結(jié)合占去了酶標抗原與固相抗體結(jié)合地機會。加底物顯色時,對照孔中由于結(jié)合地酶標抗原量最多,故顏色最深,待測孔顏色越淺,表示樣品中抗原量越多。4.2試驗溶液的選擇4.2.1對藥物的結(jié)合程度由于磺胺類藥物的兩性和極性,使它在不同溶劑中均有一定的溶解度,通過多次萃取即可達到定量回收,但由于樣本基體不同,如其中的脂肪、蛋白質(zhì)、糖分和水分的含量不同,對藥物的結(jié)合程度以及存在的干擾物質(zhì)也有所不同。如飼料樣本的脂肪、蛋白質(zhì)和水分含量均比較少,一般采用含水的提取液比較好。組織樣本中的脂肪含量較高,而磺胺主要為水溶性,一般采用極性有機溶劑進行提取以避免提取過多的脂肪。4.2.2緩沖區(qū)緩沖區(qū)選擇ELLSA用的包被緩沖液有磷酸鹽緩沖液和PBS,經(jīng)大量試驗表明:用磷酸鹽緩沖液的效果好。4.3反應(yīng)溫度和有效溫度的考察溫度對實驗結(jié)果的影響:室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回溫到室溫(20～25℃)會影響實驗結(jié)果,導(dǎo)致所有標準的OD值偏低。本實驗最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。試劑與材料的影響:本實驗中的藥品保存時間過長或者溫度過高都會引起活性下降或失效,因此實驗藥品應(yīng)該規(guī)定實驗溫度和有效期。另外為防