間接競爭elisa法檢測肉雞中的磺酸類成分

間接競爭elisa法檢測肉雞中的磺酸類成分

獸藥（包括藥物提取物）廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)。它在減少發(fā)病率和死亡率、促進(jìn)生長、提高飼料利用率和改善食品狀況方面發(fā)揮著重要作用。這是現(xiàn)代牲畜不可或缺的基礎(chǔ)。食用含有殘留獸藥的動(dòng)物性食品后,一般對人不表現(xiàn)急性毒性作用,但如長時(shí)間攝入低劑量殘留獸藥的動(dòng)物性食品,則可造成獸藥在人體內(nèi)蓄積引起各種組織器官發(fā)生病變,甚至癌變。因而加強(qiáng)獸藥殘留的監(jiān)控和檢測工作具有重要的意義。世界各國對SQX的殘留問題非常重視,并且投入大量經(jīng)費(fèi)進(jìn)行危害分析、控制用量及檢測方法等方面的研究。本實(shí)驗(yàn)采用間接競爭ELISA方法對雞肉中的磺胺喹惡啉進(jìn)行檢測。1材料表面來自于吉林某肉食雞養(yǎng)殖場,隨機(jī)抽取23個(gè)樣品,宰殺后取胸肉和腿肉。試驗(yàn)中使用的酶制劑和生化制劑均購自相關(guān)的技術(shù)公司。2方法2.1器振蕩20min用均質(zhì)器均質(zhì)樣本,然后取2.0±0.05g的均質(zhì)物至50mL聚苯乙烯離心管中,加入8mL乙晴,立即用振蕩器振蕩20min,3000r以上離心5min;取上層清液置于2.5mL至10mL干凈的玻璃試管中,于50～60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈?加入1mL正己烷,用渦旋儀渦動(dòng)20s溶解干燥殘留物,再加入1mL0.2M磷酸鹽緩沖液,用渦旋儀渦動(dòng)1min,3000r以上離心10min除去上層正己烷相,取下層20L用于分析。2.2測試步驟2.2.1種液體試劑的使用將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出,置于室溫(20～25℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均需搖勻。2.2.22.2.32.2.4編號(hào)將待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔所在的位置。2.2.5免疫二抗反應(yīng)加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品各20L到對應(yīng)的微孔中,然后加入酶標(biāo)二抗50L/孔,再加入抗體工作液80L/孔,輕輕振蕩搖勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)60min。2.2.6吸水紙拍干法小心揭開板膜,將微孔內(nèi)液體甩干,用洗滌工作液250L/孔,充分洗滌4～5次,每次間隔10s,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。2.2.7顯色加入底物液A液50L/孔,再加入底物液B液50L/孔,輕輕振蕩搖勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min。2.2.8酶檢測要求加終止液50L/孔,輕輕振蕩搖勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)),測定每孔OD值。(若無酶標(biāo)儀,則不加終止液,用目測法可進(jìn)行判定)。3結(jié)果3.1酰胺喹惡啉殘留量的計(jì)算本次實(shí)驗(yàn)實(shí)際得出標(biāo)準(zhǔn)品磺胺喹惡啉的殘留量與標(biāo)準(zhǔn)品理論上磺胺喹惡啉的殘留量有一定的偏差見表1。3.223個(gè)樣品的sqx保留經(jīng)過分析,試驗(yàn)中23份樣本的殘留量見表2。4討論4.1固相抗體反應(yīng)固相競爭ELISA法,用來測定小分子抗原,受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭性地與固相抗體結(jié)合,因此,結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量成反比。將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)形成固相抗體,洗滌、封板;待測管中加受檢樣品與一定量酶標(biāo)抗原的混合液,使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢樣品中無抗原,則酶標(biāo)抗原能順利的與固相抗體結(jié)合。如果受檢樣品中有抗原,這些抗原會(huì)與固相抗體結(jié)合占去了酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合地機(jī)會(huì)。加底物顯色時(shí),對照孔中由于結(jié)合地酶標(biāo)抗原量最多,故顏色最深,待測孔顏色越淺,表示樣品中抗原量越多。4.2試驗(yàn)溶液的選擇4.2.1對藥物的結(jié)合程度由于磺胺類藥物的兩性和極性,使它在不同溶劑中均有一定的溶解度,通過多次萃取即可達(dá)到定量回收,但由于樣本基體不同,如其中的脂肪、蛋白質(zhì)、糖分和水分的含量不同,對藥物的結(jié)合程度以及存在的干擾物質(zhì)也有所不同。如飼料樣本的脂肪、蛋白質(zhì)和水分含量均比較少,一般采用含水的提取液比較好。組織樣本中的脂肪含量較高,而磺胺主要為水溶性,一般采用極性有機(jī)溶劑進(jìn)行提取以避免提取過多的脂肪。4.2.2緩沖區(qū)緩沖區(qū)選擇ELLSA用的包被緩沖液有磷酸鹽緩沖液和PBS,經(jīng)大量試驗(yàn)表明:用磷酸鹽緩沖液的效果好。4.3反應(yīng)溫度和有效溫度的考察溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響:室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回溫到室溫(20～25℃)會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。本實(shí)驗(yàn)最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。試劑與材料的影響:本實(shí)驗(yàn)中的藥品保存時(shí)間過長或者溫度過高都會(huì)引起活性下降或失效,因此實(shí)驗(yàn)藥品應(yīng)該規(guī)定實(shí)驗(yàn)溫度和有效期。另外為防