2023卵母細胞體外成熟技術發(fā)展現(xiàn)狀及應用進展

2023卵母細胞體外成熟技術發(fā)展現(xiàn)狀及應用進2023卵母細胞體外成熟技術發(fā)展現(xiàn)狀及應用進展卵母細胞體外成熟(invitromaturation,IVM)技術是一種在體外誘導卵丘■卵母細胞復合物成熟到MII階段的技術。為提高未成熟卵母細胞的IVM率，IVM培養(yǎng)系統(tǒng)在發(fā)展中不斷改進，包括培養(yǎng)方案、培養(yǎng)液的改良及培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化，并已發(fā)展出卵母細胞成熟率高于常規(guī)IVM培養(yǎng)方案的雙期IVM培養(yǎng)方案，IVM的臨床妊娠率也得到了有效改善。IVM因可避免卵巢過度刺激，現(xiàn)已廣泛應用于多囊卵巢綜合征患者；另也適用于有卵巢儲備但對外源性促性腺激素無反應的卵巢抵抗綜合征患者；此外，IVM還可與生育力保存技術結合，適用于需進行生育力保存的癌癥患者等。本文綜述了IVM技術目前的發(fā)展現(xiàn)狀及應用進展，也為IVM未來方向做一簡要概括?！娟P鍵詞】卵母細胞；體外成熟；多囊卵巢綜合征；卵巢抵抗綜合征；生體外受精(invitrofertilizationzIVF)作為輔助生殖技術(assistedreproductivetechnologies,ART)中的重要一環(huán)，最初是在卵母細胞體夕卜成熟(invitromaturation,IVM)技術的基礎上發(fā)展而來[1-2L為提高IVF成功率，臨床上常規(guī)使用外源性促性腺激素的促排卵方案來增加卵泡的募集以獲得多個同時成熟的卵子。但促排卵方案的使用卻同時增加了卵巢過度刺激綜合征了卵巢過度刺激綜合征(ovarianhyperstimulationsyndrome,OHSS) [2]及其他有關卵巢刺激(ovarianstimulation,OS)的風險。尤其是在患有多囊卵巢(polycysticovaries,PCO)和多囊卵巢綜合征(polycysticovariansyndrome,PCOS)的不孕或具有卵巢高反應性的患者中，OHSS不僅影響卵子質量,甚至會危及患者生命。近年來隨著IVM技術的不斷發(fā)展,只需低劑量甚至不使用促性腺激素促排卵即可獲取未成熟卵母細胞進行IVM培養(yǎng)。因此，IVM技術在臨床上越來越受PCOS等易患OHSS風險的患者青睞。然而，有研究報道IVM來源的卵母細胞成熟率低，卵母細胞成熟后行卵胞質內單精子注射(intracytoplasmicsperminjection,ICSI)后正常受精比例低，形成的胚胎發(fā)育潛力較差[3L此夕卜，也有研究認為IVM來源卵母細胞受精后的囊胚植入和活產率要低于常規(guī)IVF方案來源的卵母細胞[4],這可能是由于卵母細胞發(fā)育的核質成熟不同步所造成[5L盡管如此，IVM技術已經在臨床實踐中取得了一系列的進步[6L本綜述針對目前為止IVM技術的研究進展作一簡要概述?！?IVM技術簡介與發(fā)展IVM是一種改良的IVF技術，是指從竇卵泡中獲得卵丘-卵母細胞復合體(cumulusoocytecomplexes,COCs),在體外通過適當?shù)呐囵B(yǎng)系統(tǒng)將卵母細胞培養(yǎng)至成熟階段并獲得受精能力的方法。IVM技術首次報道于1935年Pincus等[7]應用兔卵所進行的卵母細胞IVM,接著又報道了此后，研究者意識到IVM技術可以避免此后，研究者意識到IVM技術可以避免OHSS的發(fā)生尤其適合患有PCO和PCOS的不孕患者[21另外對于各種促排卵方案中回收的未成熟卵母細胞進行IVM治療，可以盡可能減少這部分卵母細胞的浪費。近年來,對于那些沒有特定風險、不愿接受激素刺激、在腫瘤治療前需要緊急進行生育力保存的患者也將IVM技術作為一個重要的備選方案[5,11-121此外,IVM技術可以在月經周期的任何時間進行,這也是其具有重要應用價值之處。使用人卵母細胞進行的IVM[8L20世紀60年代，從動物到人卵母細胞IVM,再到未成熟卵母細胞IVM后的成功受精,IVM技術在Edwards的帶領下發(fā)展迅速[91直至1991年Cha等[10]報道了第1例IVM活產后代，該研究所用卵母細胞來自于未受刺激的被切除的供體卵巢，這一報道在當時引起了學者極大的關注。二.IVM技術及培養(yǎng)體系的優(yōu)化研究進展1.IVM方案：一直以來，由于IVM的定義未達成統(tǒng)一,臨床IVM方案的實施在各個中心也并不相同。根據2021年美國生殖醫(yī)學協(xié)會(AmericanSocietyforReproductiveMedicine,ASRM)的最新指南,臨床IVM是指患者在未接受或接受最小卵泡刺激素(follicle-stimulatinghormone,FSH)刺激(通常處理3d)且不伴或伴有最小人絨毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin,hCG)劑量啟動(單次10000U注射)后，U注射)后，從卵泡中收集未成熟卵母細胞進行IVM[13L目前公認的臨床IVM方案主要有兩種，即常規(guī)IVM方案和雙期IVM方案[141其中常規(guī)IVM方案又根據卵母細胞收集前是否接受hCG刺激分為兩種：①在無hCG的啟動方案中，患者通常在無或連續(xù)3d的最小FSH刺激后收集未成熟卵母細胞，將未成熟的GV期COCs在體外直接培養(yǎng)至MU期;②在使用hCG的啟動方案中,患者會在進行卵母細胞采集之前的36-38h接受hCG處理[2],在這種方案中會收集到MU期、MI期和GV期的卵母細胞，并且大多數(shù)卵母細胞處于GV期。對采集到的MH期卵母細胞需要在采集當日進行ICSI授精，而MI期和GV期卵母細胞則需在體外進行IVM,培養(yǎng)成熟后行ICSI授精。雙期IVM方案是基于常規(guī)IVM方案上的一個改進，是在常規(guī)IVM方案基礎上增加了pre-IVM的Pre-IVM培養(yǎng)期間使用C型利鈉肽(C-typenatriureticpeptide,CNP)來抑制GV期卵母細胞自發(fā)恢復減數(shù)分裂，維持卵丘細胞和卵母細胞之間的縫隙連接通訊(gapjunctioncommunication,GJC),促進卵母細胞獲得后期的發(fā)育能力[1,14L隨后再將COCs移入促進減數(shù)分裂恢復的培養(yǎng)基中進行常規(guī)IVM培養(yǎng)。在體內，CNP是由卵泡壁層顆粒細胞分泌，其受體NPR2主要表達于卵丘細胞。當CNP與NPR2結合后，卵丘細胞環(huán)鳥昔酸(cyclicguanosinemonophosphate,cGMP)水平增高，cGMP經縫隙連接傳遞至卵母細胞抑制磷酸二酯酶胞抑制磷酸二酯酶3A(phosphodiesterase3AzPDE3A)的活性，阻礙環(huán)磷腺昔(cyclicadenosine-3',5'-mconophosphate,cAMP)降解，而高水平的cAMP可維持細胞處于減數(shù)分裂抑制狀態(tài)，這有利于促進核質同步成熟和提高卵母細胞發(fā)育潛力[15-16L有動物實驗研究證實，CNP介導的雙期IVM方案可以顯著提高IVM技術的效率和可行性[17-18L因此，這種雙期IVM培養(yǎng)方案也在近年來被逐步應用于人IVMO有研究報道表明，采用CNP介導的雙期IVM培養(yǎng)方案顯著提高了人IVM卵母細胞成熟率和優(yōu)質囊胚率，特別是對于經最小卵巢刺激后收集獲得的小竇卵泡(直徑6mm)來源的卵母細胞[14,19-20L此外，CNP介導的雙期IVM培養(yǎng)方案沒有增加囊胚的非整倍體率，且與標準IVM相比,這種方案顯著提高了PCOS患者的卵母細胞成熟率和臨床妊娠率[211但在目前有限的研究中，雙期IVM與標準IVM活產率相當[21],要確保雙期IVM方案的安全性和有效性還需要更廣泛的臨床研究及隨訪跟蹤。2.IVM培養(yǎng)液的改良：對卵母細胞來說,只有胞核和胞質同步成熟的卵母細胞才具備良好的受精能力及胚胎發(fā)育潛能[4L而IVM卵母細胞的發(fā)和胞質成熟的同步性喪失，這是影響IVM卵母細胞來源優(yōu)質囊胚比率下降的主要因素。這種自發(fā)成熟導致GJC的過早斷裂，引起一些有益成分如首先，培養(yǎng)液成分應極大程度接近體內生理環(huán)境首先，培養(yǎng)液成分應極大程度接近體內生理環(huán)境，包括保持COCs的結構完整性[23]和維持減數(shù)分裂停滯。因此，向培養(yǎng)液中添加CNP或CAMP水解抑制劑(如IBMX)可有效阻止減數(shù)分裂的恢復,并使COC結構得以保留。其次，體內卵泡的生長依賴多種激素的相互作用,因此在IVM培養(yǎng)基中常添加重組FSH、hCG、黃體生成素(luteinizinghormonexLH\胰島素和雌二醇等激素中的一種或幾種。其中FSH是IVM培養(yǎng)基中最基礎的激素補充物，添加濃度范圍一般為0.075-0.75U/mL。FSH主要是通過增加COCs中cAMP的濃度來延緩卵母細胞減數(shù)分裂進程以促進卵母細胞核質成熟[24L雖然也有研究人員習慣聯(lián)合使用FSH與LH或hCG[25-26],但哺乳動物的實驗研究結果卻認為LH主要是通過作用于壁層顆粒細胞而不是COCs來促進和調節(jié)卵母細胞成熟。因此，IVM培養(yǎng)基中添加LH的作用可能并不明顯。mRNA、基質和營養(yǎng)物質的部分丟失，而這些成分又是成功受精和胚胎發(fā)育所必需的[221因此，在培養(yǎng)液中進行成分優(yōu)化也是改善IVM結局的有效途徑。由于卵泡環(huán)境中還存在許多生長因子包括像表皮細胞生長因子 (epidermalgrowthfactorzEGF)樣多肽類生長因子,這些生長因子在體內卵母細胞成熟過程中會發(fā)生生理性上調，影響卵丘細胞葡萄糖代謝和卵母細胞線粒體功能。同樣地，在體外向卵母細胞線粒體功能。同樣地，在體外向IVM培養(yǎng)液中添加EGF樣多肽類生長因子會影響COCs代謝，有利于提高卵母細胞成熟率,這一結果已在多種動物以及人的IVM實驗中得到證實[19,21z271蛋白質是人IVM培養(yǎng)中必不可少的成分，常見來源包括母體血清、人卵泡液或人血清白蛋白等。由于血清成分復雜，其中含有卵母細胞成熟所必需的生長因子和氨基酸，但也含有許多正常卵泡發(fā)育環(huán)境中沒有的成分，這些成分可能會影響卵母細胞的發(fā)育[23L發(fā)育能力降低和細胞凋亡增加，這也是IVM和體外胚胎發(fā)育效率低下的主要原因。鑒于此，研究人員針對具有抗氧化特性的化合物在IVM中進行了相關實驗[27-28L在IVM培養(yǎng)液中添加谷胱甘肽前體、胱氨酸和半胱氨酸等形式的抗氧化劑已被證實可以改善隨后的囊胚發(fā)育[27L有研究顯示，添加左旋肉堿(L-肉堿)的IVM培養(yǎng)液提高了小鼠等哺乳動物的卵母細胞發(fā)育能力，并能顯著提高卵子發(fā)育到囊胚階段的能力[271Zou等[29]的研究顯示，在人卵母細胞體外培養(yǎng)過程中添加濃度為10-5mol/L的褪黑素,可以顯著提高GV和MI期卵母細胞成熟率,高質量囊胚率也顯著增加，這與低劑量的褪黑素處理可顯著減少過量的活性氧和氧化應激對卵母細胞的損害有關。近來，Cao等[25]的研究首次評估了橄皮素對人卵母細胞的影響，結果顯示楹皮素可顯著提高IVM成功率,改過降低與年齡相關的線粒體氧化應激水平、減少凋亡程度和促進自噬來改善衰老卵母細胞的質量。與年齡相關的生育力下降除了與過量的活性氧增加氧化損傷導致卵母細胞年齡相關的生育力下降除了與過量的活性氧增加氧化損傷導致卵母細胞成熟不良外，還與非整倍體增加有關。輔酶Q10也是一種重要的膜相關抗氧化劑，特別是在抑制脂質過氧化和DNA氧化方面。Ma等[30]的研究首次證實在IVM培養(yǎng)液中添加50mmol/L輔酶Q10可顯著提高高齡女性卵母細胞成熟率，減數(shù)分裂后的非整倍體率也顯著下降。3.IVM培養(yǎng)體系的優(yōu)化：在體內，未成熟卵母細胞是在卵泡內生長成熟,而卵泡具有良好的三維立體結構。所以，研究者們研究采用三維培養(yǎng)系統(tǒng)來嘗試進行IVM培養(yǎng)體系的優(yōu)化。三維培養(yǎng)體系是通過利用膠原蛋白、料為細胞的體外生長提供接近體內生理環(huán)境的三維微環(huán)境。三維培養(yǎng)系統(tǒng)可根據需要適時調整培養(yǎng)條件，為卵母細胞不同階段的生長發(fā)育提供合適的激素、生長因子、生物信號分子和其他有利于細胞生存的物質,以維持卵泡體外生長發(fā)育的良好環(huán)境[31L來發(fā)展出的海藻酸鹽凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)已成功應用于人卵泡體外生長，并顯著提高了IVM效率[32L也有研究認為JVM培養(yǎng)前，使用三維膠原凝膠(含磷酸二酯酶3抑制劑)對人COCs或裸卵和卵丘細胞共培養(yǎng)兩種方式進行預培養(yǎng)，可顯著提高IVM的效率[331Combelles等[34]使用由一滴被疏水性粉末顆粒包裹的液體組成的微滴三維生物反應器進行卵母細胞IVM，其成熟率與使用三維膠原凝膠與卵丘細胞共培養(yǎng)的結果沒有顯著差異。三維培養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)展為人類卵母細胞IVM的研究開辟了新的前景。我們相信，隨著3D培養(yǎng)系統(tǒng)的進一步發(fā)展,該技術有望成為提高人類卵母細胞發(fā)育能力的一種有效方法。IVM技術的提高人類卵母細胞發(fā)育能力的一種有效方法。IVM技術的主要優(yōu)勢在于減少了促性腺激素對卵巢的刺激，因此已廣泛用于PCOS患者進行未成熟卵母細胞IVM培養(yǎng);對外源性促性腺激素無反應,但有卵泡儲備的抵抗性卵巢綜合征患者同樣也適用。在生育力保存方面，IVM可與成熟卵母細胞或卵巢組織冷凍保存技術相結合,適用于因醫(yī)療或社會原因導致的有卵巢功能喪失危險的患者，經卵巢組織移植后有復發(fā)風險及不能因卵巢刺激延遲治療的癌癥患者，如卵巢癌、白血病、神經刺激的青春期前的女性。1.IVM技術在PCOS中的應用:PCOS是一種與AE卵功能障礙性不孕有關的、青春期和育齡期女性最常見的內分泌疾病，常伴有高雄激素及胰島素抵抗。因PCOS患者體內的高卵泡儲備,即有較多未成熟卵母細胞的特點使其成為IVM的最佳適應證。1994年，Trounson等[35]團隊報道了首例由未經治療的PCOS患者來源的未成熟卵母細胞行IVM后獲得活產。但在隨后的幾十年里,PCOS患者IVM的著床率和妊娠率并不高[36L而隨著近來IVM技術的迅速發(fā)展，如前文所述雙期IVM方案的使用顯著提高了IVM的效率(包括成熟率、著床率和活產率)[37L盡管IVM本身的治療方案中可以不使用促性腺激素以避免OHSS的發(fā)生,三.IVM技術的臨床應用但在臨床IVM但在臨床IVM中，普遍的共識是認為FSH的使用可以提高PCOS女性卵母細胞成熟潛力。因此，在治療周期開始時一般使用低劑量FSH或人絕經期促性腺激素(humanmenopausalgonadotropin,hMG)處理增加募集的竇卵泡數(shù)[37-38]。FSH處理的短啟動方案被認為是進行PCO/PCOS患者助孕較為普遍接受和有效的方法[39L與傳統(tǒng)IVF-胚胎移植治療相比JVM除了消除或降低與卵巢刺激有關的OHSS等并發(fā)癥的風險外，IVM還具有成本低(促性腺激素藥物的費用減少X安全、更方便(無須頻繁進行卵泡監(jiān)測)等優(yōu)勢[4L2.IVM技術在卵巢抵抗綜合征(resistanceovariansyndrome,ROS)中的應用：促性腺激素ROS是一種罕見的內分泌疾病,其特征是促性腺激素增高的性腺功能減退[40],通常是由FSH受體的基因突變引起，臨床上常有原發(fā)性或繼發(fā)性閉經及不孕癥[41LROS患者的抗苗勒管激素水平和竇卵泡計數(shù)正常[39],但由于ROS患者的卵泡對內源性或外源性FSH無反應導致無法在體內產生成熟卵母細胞，因此無法通過傳統(tǒng)的ART方法懷孕。在早期，一些ROS患者只能通過接受卵子捐獻獲得妊娠。目前，隨著IVM技術的不斷改進，IVM已成為治療ROS的可靠選擇[413.IVM技術應用于女性生育力保存:近年來,經治療后的癌癥患者生存率越來越高，但女性患者在接受放、化療后常會伴隨卵巢功能減退甚至喪失。為保留生育能力，患者可以在癌癥治療前進行生育力保存，即進行卵母細卵巢組織的冷凍保存(ovariantissuecryopreservationQTC)[42[421對于不能延誤治療的患者,可以在月經周期的任何時期進行未成熟卵母細胞采集，以進行隨后的IVM[37,43L對不能接受促性腺激素治療的青春期前女性，或雌激素受體呈陽性且FSH會誘導高雌二醇血癥的乳腺癌患者等，經陰道卵泡抽吸或卵巢組織切割獲得的卵母細胞進行IVM培養(yǎng)被認為是較為合適的生育力保存技術[441而對于卵巢惡性侵襲風險高的患者，如交界性卵巢癌、白血病、神經母細胞瘤、伯基特淋巴瘤等，卵巢組織移植存在再引入腫瘤的風險，而卵巢組織切割來源(oocytesfromovariantissue,OTO)-IVM將會是最為有效的保存生育力的方法，已有研究報道雙期IVM方案應用于OTO-IVM獲得了良好的結果[45-46LIVM技術雖然有其獨特的優(yōu)勢并已在臨床應用中得到認可，但與傳統(tǒng)IVF和活產率均有待提高。為進一步提高IVM效率及其臨床應用，需要不斷探索和優(yōu)化:①繼續(xù)深入研究卵母細胞生長發(fā)育機制，發(fā)現(xiàn)、發(fā)展新的IVM培養(yǎng)體系，優(yōu)化培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)液成分，為卵母細胞提供更好的體外發(fā)育環(huán)境；②嘗試發(fā)展更為有效的卵母細胞抽吸技術，提高未成熟卵母細胞回收率;③IVM作為生育力保存的一個方案，為最大限度提高癌癥患者治療后的生育能力，可將傳統(tǒng)OS與OTO-IVM.卵巢組織低溫保存技術結合到卵母細胞IVM的臨床實踐中，以提高患者臨床妊娠率；④將卵泡體外生長技術與pre生長技術與pre-IVM相結合進行研究，尋找能夠在減數(shù)分裂成熟前支持卵母細胞生長和分化的IVM培養(yǎng)方案，以實現(xiàn)早期卵泡的開發(fā)利用；⑤朝著零刺激的方向發(fā)展，使ART領域實現(xiàn)需要最小或零卵巢刺激；⑥未來應對接受IVM治療的患者和通過該技術出生的兒童進行必要的長期隨訪,隨訪內容應包括代謝、心血管疾病的監(jiān)控以及生長參數(shù)和智力發(fā)展的評估。對不同方案下出生的IVM兒童及培養(yǎng)基改進后的IVM結局也要進行后續(xù)調研以確定IVM安全性和培養(yǎng)基改進效果。我們相信，隨著IVM技術的不斷發(fā)展和進步，必將進一步推動人類ART的發(fā)展，提高卵子利用、臨床妊娠以及卵子成熟異常等相關疾病的治療。[1]GongX,LiH,ZhaoY.Theimprovementandclinicalapplicationofhumanoocyteinvitromaturation(IVM)[J].ReprodSciz2021.DOI:10.1007/S43032-021-00613-3.[2]YangZY,ChianRC.Developmentofinvitromaturationtechniquesforclinicalapplications^].FertilSteril,2017,108(4):577-584.DOI:10.1016/j.fertnstert.2O17.08.020.]allsML,HunterT,RyanJRetal.Invitromaturationasanalternativetostandardinvitrofertilizationforpatientsdiagnosed參考文獻withwithpolycysticovaries:acomparativeanalysisoffresh,frozenandcumulativecycleoutcomes[J].HumReprod,2015,30(1):88-96.DOI:10.1093/humrep/deu248.[4]Sauerbrun-CutlerMT,VegaM,KeltzM,etal.InvitromaturationanditsroleinclinicalassistedreproductivetechnologyfJ].ObstetGynecolSurv,2015,70(1):45-57.DOI:10.1097/QGX.0000000000000150.[5]SonWY,HendersonS,CohenY,etal.Immatureoocyteforfertilitypreservation^].FrontEndocrinol(Lausanne),2019,10:464.DOI:10.3389/fendo.2019.00464.[6]PracticeCommitteesoftheAmericanSocietyforReproductiveMedicinetSoRBzTechnologists,theSocietyforAssistedReproductiveTechnology.Invitromaturation:acommi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