大蒜超氧化物歧化酶分離純化技術(shù)研究進展

大蒜超氧化物歧化酶分離純化技術(shù)研究進展

超氧化物誘導(dǎo)酶（ec1.15.1）被稱為sod。這是一種廣泛存在于動物、植物和好氧微生物細胞中的金屬酶。它可以催化超氧化陽離子自由基o2的脫氧反應(yīng)，平衡身體代謝過程中產(chǎn)生的過多自由基，減輕或消除身體對自由基的損害，抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤抑制、血脂調(diào)節(jié)、抗輻射、消炎和美容。SOD是當(dāng)前生物學(xué)、醫(yī)學(xué)以及化學(xué)研究領(lǐng)域中世界級的課題之一,且在我國已有專著問世。大蒜是百合科(Liliaceae)蔥屬植物生蒜(AlliumsativumL.)的鱗莖,大蒜中SOD的含量比其它植物相對較高。從大蒜中提取SOD,成本低廉,因此研究大蒜SOD的分離純化方法,對SOD生產(chǎn)工藝優(yōu)化及應(yīng)用具有重要意義。1cu/zn-sod與銅原子的構(gòu)象熔點溫度根據(jù)所結(jié)合的金屬輔基不同,將存在于高等生物體內(nèi)的SOD分Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD3種,大蒜SOD屬于Cu/Zn-SOD。Cu/Zn-SOD是由兩個相同亞基構(gòu)成的二聚體蛋白,每個亞基含一個銅原子和一個鋅原子,相對分子質(zhì)量約為16kD。通過對其構(gòu)象熔點溫度的研究表明,Cu/Zn-SOD是迄今發(fā)現(xiàn)熱穩(wěn)定性最高的球蛋白之一。Cu/Zn-SOD的等電點在pH5.3左右,其酸堿穩(wěn)定性好,在pH5.2~9.6之間其催化速率與pH無關(guān),在pH4.5~11.0之間能穩(wěn)定存在。與Fe-SOD、Mn-SOD相比,Cu/Zn-SOD對一些化學(xué)試劑或變性劑的敏感性有明顯的差別。DTT(二巰基蘇糖醇)、氰化物、H2O2、SDS(十二烷基硫酸鈉)和DTDM(4,4′-二硫代二嗎啉)等對SOD的活力影響顯著,并可將其沉淀,但它在其它理化因素作用下相對較穩(wěn)定。以上性質(zhì)也決定了大蒜SOD來源豐富、易于處理,生產(chǎn)工藝也易得到簡化。2大蒜sod的提取、分離和純度2.1磷酸緩沖液浸取大蒜大蒜SOD極性較大,易溶于水,根據(jù)“相似相溶”原理,可用水來浸取大蒜SOD。但磷酸緩沖液可提高浸取效能,增加制品的穩(wěn)定性,減少雜質(zhì),因此實際操作中常采用pH7.8的磷酸緩沖液代替水來浸取大蒜SOD,得到粗提取液。但該方法的缺點是浸出范圍廣,選擇性相對差,容易浸出大量的無效成分,且會引起一些有效成分的水解。2.2破碎過程在東南角超聲波破碎法是一種輔助浸取技術(shù)。超聲波的“空化作用”產(chǎn)生極大的壓力造成被粉碎物細胞壁或整個細胞的破碎,而且整個破碎過程在瞬間完成。超聲波產(chǎn)生的振動作用增加了溶劑的湍流強度及相接觸面積,加快了細胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴散及溶解,從而強化了傳質(zhì),有利于細胞內(nèi)有效成分的提取。馮艷偉等以超聲波破碎法輔助磷酸緩沖液提取大蒜SOD,并通過單因素試驗法得出最佳破碎功率為300W,最佳破碎時間為5min,同時也指出超聲波會使部分酶失活。2.3熱處理小熱值熱變性法是依據(jù)SOD的熱穩(wěn)定性原理設(shè)計的。SOD的熱穩(wěn)定性高,當(dāng)溫度低于60℃時,短時間的熱處理不會使酶活力有明顯的變化,而一般的雜蛋白卻在溫度高于55℃時就易變性沉淀,因此,對大蒜粗提液進行短時間的熱處理可以達到去除雜蛋白的目的。孫永君研究得出提取植物SOD的最適宜溫度為55~65℃,最適宜的熱變時間為15min。張書文等則采用二次變溫?zé)嶙冃苑ǚ蛛xSOD,大大縮短了生產(chǎn)周期,降低了生產(chǎn)成本,提高了產(chǎn)品的收率和質(zhì)量。熱變性法作為一種初步的純化手段,操作簡便,經(jīng)濟實惠,是工業(yè)上常用的分離SOD的方法。2.4有機溶劑分類沉淀法2.4.1丙酮對粗酶液中sod蛋白溶解度的影響利用向蛋白質(zhì)溶液中加入弱極性的有機溶劑,改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù),使不同種類蛋白質(zhì)的溶解度產(chǎn)生不同程度降低的原理可進行蛋白質(zhì)的純化。在粗酶液中逐量加入丙酮,可使SOD及其他雜蛋白的溶解度發(fā)生變化,依次從溶液中沉淀出來。鄧旭等研究認(rèn)為,當(dāng)丙酮加入量達到l.0(V/V)時,SOD比活最高,再加入丙酮將導(dǎo)致SOD活力急劇下降,因此當(dāng)以去除雜蛋白為目的時,丙酮的加入量不宜超過1.0(V/V)。原龍等通過實驗進一步得出,不同的丙酮加入量與攪拌時間會影響SOD的純化結(jié)果,其最佳條件是加入0.6倍體積的丙酮,攪拌15min。2.4.2n-sod法氯仿-乙醇混合液可作為萃取劑將SOD溶解于其中,并將雜蛋白沉淀出來。另外,Cu/Zn-SOD對氯仿-乙醇的作用不敏感,處理12h后,活性沒有明顯的變化,因此用該法粗分離大蒜SOD是可行的。張恒等試驗證實,按氯仿-乙醇(V/V=3:5)混合液為提取液量的2.5倍加入氯仿-乙醇混合液,離心分離后棄去沉淀,可得到較純的SOD酶液。2.5植物sod的溶解特性鹽析法是利用在高濃度的電解質(zhì)溶液內(nèi),蛋白質(zhì)分子表面的水化層被破壞,使蛋白質(zhì)分子中的憎水區(qū)域裸露而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集沉淀的原理進行分離的。硫酸銨因價廉、溶解度大,且能使蛋白質(zhì)的性質(zhì)保持穩(wěn)定而成為最常用的鹽析劑。孫永君通過試驗表明,當(dāng)植物SOD粗提液中硫酸銨的濃度從0開始增加時,其中的一些蛋白質(zhì)的溶解度增加,表現(xiàn)出“鹽溶”特性;但當(dāng)硫酸銨濃度繼續(xù)升高達到50%的飽和濃度時,超過了某些雜蛋白的溶解上限值,其溶解度又會先后以不同的速度下降,分別析出沉淀,而該濃度下植物SOD仍表現(xiàn)出“鹽溶”特性;但由于SOD的沉降系數(shù)較小,當(dāng)硫酸銨的飽和度達到90%時,植物SOD的溶解度才會下降而沉淀析出。孔祥智等則以40%和90%為分步鹽析的最佳硫酸銨飽和點,從大蒜提取物中獲得了SOD和蒜氨酸酶兩種產(chǎn)品。硫酸銨分級鹽析法的優(yōu)點是方便易行,常溫下也不易導(dǎo)致酶失活,純化效果好,與有機溶劑分級沉淀法相比更有利于保持蛋白質(zhì)的生理活性,但分辨率不及有機溶劑分級沉淀法。2.6透析膜的制備透析是利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜,而使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)分開的方法。透析通常不作為純化酶的一種單元操作,但通過透析可除去酶液中的鹽類、有機溶劑、低分子量抑制劑等,所以它在純化過程中極為常用。透析膜的截留極限一般在分子量5000左右,而Cu/Zn-SOD的分子量遠高于此,因此適合于透析法。用透析法提純大蒜SOD的應(yīng)用已有多次報道。2.7膜分離和濃縮膜分離技術(shù)采用了能選擇地透過一種物質(zhì),而阻礙另一種物質(zhì)透過的具有特定性質(zhì)的半透膜,它的實質(zhì)是利用物質(zhì)經(jīng)過膜的傳遞速度不同而使其得以分離。陸俊等探討了以中空纖維超濾膜分離提純大蒜SOD的工藝,通過正交試驗確定出超濾膜分離法的最佳條件為溫度32℃,壓力0.15MPa,透過率90%,并在此基礎(chǔ)上研究了用納濾膜對SOD超濾液進行濃縮純化的工藝條件,指出適宜的納濾條件為溫度32℃,壓力1.4MPa。JingbingWang等研究了以超濾膜高效分離和純化大蒜SOD的方法,采用分子截留量為50kD的PFS膜,當(dāng)攪拌速率為1200rpm,滲透通量為26.5L/(m2·h)時,SOD的純度可達98%,并通過實驗證實,增加介質(zhì)中的銅、鋅離子濃度能顯著提高SOD的比活力(最佳離子濃度為Cu2+62.54mmol/L,Zn2+15.4mmol/L)。膜分離技術(shù)是一項新興的分離純化技術(shù),具有被分離成分穩(wěn)定、分離率高、耗能低、無二次污染、操作方便等優(yōu)點。3大蒜sod的提取大蒜SOD在各領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。在化妝品方面,可利用SOD抗氧化、防衰老的特效,研制大蒜美容水、生發(fā)水、美容霜、護膚霜、發(fā)乳等,現(xiàn)已有多種含大蒜SOD的產(chǎn)品面市;在食品方面,大蒜SOD可作為保健食品的功能因子或食品營養(yǎng)強化劑,如大蒜酒、天然大蒜飲料、SOD酸牛乳、SOD調(diào)味劑等;大蒜SOD還可作為抗氧化劑有效防止罐頭、果汁等食品的變質(zhì)及腐敗現(xiàn)象;也有大蒜SOD作為水果、蔬菜良好保鮮劑的報道。在醫(yī)藥方面,大蒜SOD是抗衰老、抗炎癥和自身免疫疾病患者廣泛應(yīng)用的藥品或藥物原料,大蒜SOD作為牙膏的添加劑,在預(yù)防和治療牙周疾病方面也有很高的利用價值;大蒜SOD無抗體干擾,有望在降血脂、治療癌癥、防御放射性傷害等方面起到重要作用。近年來,國內(nèi)外市場上已出現(xiàn)SOD產(chǎn)品供不應(yīng)求的趨勢。以往SOD的提取多以動物血為原料,但由于原料來源有限,滿足不了市場的需要,因而從植物特別是無污染天然野生植物中提取SOD,逐漸成為科學(xué)界關(guān)注的方向。大蒜SOD與動物SOD性質(zhì)相近,但前者原料來源更為廣泛,取材便利,生產(chǎn)成本低,并符合生態(tài)可持續(xù)發(fā)