水稻原生質(zhì)體分離及轉(zhuǎn)化

水稻原生質(zhì)體分離及轉(zhuǎn)化作者：植物逆境與光合實(shí)驗(yàn)室|發(fā)表日期：2014-04-11實(shí)驗(yàn)?zāi)康模河糜谧鰺晒舛ㄎ弧IFC、Co-IP實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料和試劑：生長8-10d的水稻組培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5mL移液槍、5mL槍頭、12mLBD管、1.5mLEP管、100mL錐形瓶、圓形培養(yǎng)皿、濾網(wǎng)(20mmx20mm)、離心機(jī)、搖床等。溶液的配制：母液的配制：1、 0.2MMES(pH5.7)2、 0.8MMannitol(甘露醇)3、 1MCaCl24、 2MKCl5、 2MMgCl26、 10%BSA[FlukaPEG400081240]以下如有上述母液，則都是使用的母液酶解液：20mL x2MES 0.5MannitolmL-35：『…，ddH2OmL55°C10min冷卻至RT后加入200uLCaCl2加入200uL10%BSAMmg:20mLMESmLMannitolmLMgCl2mLddH2OmL7.515mL0.150.3g0.0750.15g1.83.6mLx20.20.4mL510mL0.0750.15mL4.7259.45mLPEG-CaCl2:PEG-CaCl2:20mLMannitolmLCaCl2mLPEG4000gddH2OmLx22.5mL12mL48g3TOC\o"1-5"\h\zmLW5:200mLMES 2mLNaCI 1.8gCaCl22H2O 3.67525gKCI 0.5mLddH2O 197.5mL具體實(shí)驗(yàn)步驟：1、 從培養(yǎng)基上切取培養(yǎng)8-10d的水稻幼苗，去除幼苗外層包裹的葉子。2、用干凈的刀片將幼苗切成很細(xì)的粉末狀碎片（越細(xì)越好，有利于酶解），大概切到水稻幼苗莖稈的中間段即可（剩余未切割的部分可以扔掉）。3、將酶解液（約20mL）倒入100mL錐形瓶中，然后輕輕地將細(xì)碎的幼苗倒入錐形瓶中（注意不要撒到錐形瓶壁上），然后輕輕地?fù)u晃，使其均勻分散。4、 黑暗條件下（用不透光的黑色塑料袋包裹即可，下同）置于搖床中（60rpm/min）搖晃5h，使細(xì)胞充分酶解。此時(shí)也可以將PEG-CaCl2溶液一同置于搖床上搖晃，使溶質(zhì)充分溶解。5、 從搖床中取下已經(jīng)酶解好原生質(zhì)體的錐形瓶，用手輕輕搖勻后，再用移液槍吸取錐形瓶中已經(jīng)酶解好的液體，讓其經(jīng)過過濾網(wǎng)（20mmx20mm）過濾后流入到BD管中。6、 接著用W5溶液來洗滌錐形瓶中剩余的殘?jiān)?，然后同樣用移液槍將其吸出，?jīng)過過濾網(wǎng)后流入到BD管中，此步驟按照需要重復(fù)2-3次（盡量收集到更多的原生質(zhì)體），所需要收集原生質(zhì)體的BD管數(shù)按照需要來決定。7、 收集完后，將含有原生質(zhì)體的BD管置于離心機(jī)中，1200rpm離心3min。8、 去掉BD管中的上清后，用W5溶液（約6mL）洗滌沉淀，然后1200rpm離心3min。9、 重復(fù)步驟8一到兩次。10、 去掉BD管中的上清，再在含有沉淀的BD管中加入mmg（加入的量根據(jù)液體的顏色來自行判斷），然后將其混勻。11、 Mmg加入完畢并混勻后，可吸取其中少量液體到計(jì)數(shù)板上，然后置于顯微鏡下觀察（主要是查看原生質(zhì)體是否完整、濃度是否達(dá)到和是否還含有大量的雜質(zhì)），有時(shí)候憑經(jīng)驗(yàn)而可以省去這一步。12、 接著將BD管中的液體轉(zhuǎn)移到事先已經(jīng)裝有質(zhì)粒的另外的BD管中（加入的量根據(jù)每100uL原生質(zhì)體中加入10-20ug質(zhì)粒來確定，如果是雙轉(zhuǎn)，則每一種質(zhì)粒都要加入這么多的樣，即雙倍的質(zhì)粒），在這里可以轉(zhuǎn)小量GFP對(duì)照來測(cè)定原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率。13、 再加入等體積（原生質(zhì)體+質(zhì)粒）的PEG-CaCl2溶液（溶液比較粘稠，注意慢慢吸取），輕輕混勻。14、 黑暗條件下靜置15min（讓質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中）。15、 然后加入1-2倍體積的W5溶液（終止反應(yīng)）。16、 混勻后，1200rpm離心3min，倒去上清。17、 在沉淀中加入少量W5（約1mL）混勻。18、 最后將其吸取倒入事先加有6mLW5的培養(yǎng)皿（事先經(jīng)過胎牛血清潤洗，以便原生質(zhì)體均勻分散在培養(yǎng)皿中）中，并混勻。19、 黑暗條件下靜置培養(yǎng)16h（讓質(zhì)粒在原生質(zhì)體中表達(dá)出蛋白）。20、 從黑暗中取出培養(yǎng)的原生質(zhì)體，待吸去培養(yǎng)皿中一部分清澈的液體后，再用槍頭將培養(yǎng)皿中剩余的液體和原生質(zhì)體打勻，然后用移液槍將其吸取至新的BD管中。21、 接著將BD管中的原生質(zhì)體分裝到1.5mL的EP管中（分裝的管數(shù)按需求決定）。22、 此時(shí)可在EP管中加入不溶的PGN和Chitin進(jìn)行處理，處理濃度為200ug/mL,處理時(shí)間為10min，處理時(shí)可上下顛倒搖晃EP管，這能讓PGN和Chitin充分處理到原生質(zhì)體。23、 然后將EP管置于離心機(jī)中，12000rpm，離心1min。24、 吸去EP管中的上清液，然后迅速將其置于液氮中，最后置于-80°C中凍存，待需要使用時(shí)再取出。一、4注意：1、 配制溶液前需配制相關(guān)試劑母液，而且需要過濾除菌。2、 溶液配制好后也需要過濾除菌。3、 所用的器具最好是平時(shí)專門使用的，防止交叉污染。4、 由于原生質(zhì)體容易破裂，所以搖晃、打勻和轉(zhuǎn)移原生質(zhì)體的時(shí)候動(dòng)作必須要輕。實(shí)驗(yàn)一：GFP轉(zhuǎn)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率觀察黑暗條件下靜置培養(yǎng)16h（讓質(zhì)粒在原生質(zhì)體中表達(dá)出蛋白），取出已表達(dá)出GFP蛋白的原生質(zhì)體，將原生質(zhì)體打勻后再將其吸入2mLEP管，然后1200rpm離心3min，吸取大部分上清后再打勻原生質(zhì)體，最后吸取少量原生質(zhì)體置于載玻片上，接下來便可在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光了。實(shí)驗(yàn)二：用于BIFC實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)三：用于Co-IP實(shí)驗(yàn)此方案來源于YangZhang,JianbinSuandHongbinWang*.Ahighlyefficientricegreentissueprotoplastsystemfortransie