煙草環(huán)斑病毒固體蛋白抗原表位的預(yù)測及表達(dá)載體的構(gòu)建

煙草環(huán)斑病毒固體蛋白抗原表位的預(yù)測及表達(dá)載體的構(gòu)建

草莓環(huán)病毒（trv）屬于豆葉病毒科，是線蟲傳播到多面體病毒的典型類型。該病毒粒子是球狀、等軸、直徑約28nm的二十面體,殼粒由60個外殼蛋白亞基組成。TRSV的自然寄主范圍廣,可侵染54科246種植物。TRSV傳播途徑多樣,可通過種子傳播、嫁接、機(jī)械接種、媒介傳播。TRSV分布于世界50多個國家,我國已從荷蘭進(jìn)口的蘿卜種子、美國進(jìn)口的大豆和塞爾維亞進(jìn)口的葵花種子等進(jìn)口貨物中截獲了煙草花葉病毒,并將其列入中國進(jìn)境檢疫性有害生物名錄。為防止其通過進(jìn)出口貿(mào)易傳入我國,需要加大檢驗(yàn)檢疫力度。近年來,國內(nèi)關(guān)于煙草環(huán)斑病毒的研究報道較多,但主要集中在生物學(xué)的研究和檢測方法的建立。早期的研究工作多在病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、病毒粒體細(xì)胞間傳播過程和電化學(xué)酶聯(lián)免疫分析等方面。分子檢測的研究主要體現(xiàn)在建立各種不同的方法。楊翠云等建立了RT-PCR和IC-RT-PCR檢測方法。易汪雪等建立了單管實(shí)時熒光RT-PCR方法。常規(guī)的RT-PCR方法檢測也有相關(guān)的報道。以上檢測方法雖能提高檢驗(yàn)檢疫工作效率,但是在檢測過程中因檢測樣品較多,需要使用大量的抗血清,其中大部分是價格昂貴的進(jìn)口血清,加之進(jìn)口血清到貨時間周期長,故不便于檢測工作的順利開展。國內(nèi)有關(guān)TRSV抗血清制備的報道中,制備的血清為多克隆抗體或只是原核表達(dá)載體的構(gòu)建,尚未見TRSV單克隆抗體制備的研究與報道。由于多抗血清的特異性和效價都存在一定的局限,所以無法保障檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。筆者根據(jù)綜合預(yù)測結(jié)果,有針對性地擴(kuò)增煙草環(huán)斑病毒殼蛋白抗原表位基因所在結(jié)構(gòu)域,獲取了其外殼蛋白的外源融合蛋白,并通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備特異性強(qiáng)、靈敏度高的TRSV單克隆抗體,旨在為準(zhǔn)確、快速檢疫煙草花葉病毒提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1小鼠骨髓balb/c小鼠供試細(xì)胞的制備煙草環(huán)斑病毒(TRSV)從來自云南的文殊蘭上分離得到;E.coliDH5α、TOP10菌種;BALB/c小鼠,SP2/0骨髓瘤細(xì)胞等供試細(xì)胞均由云南出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心提供?？寺≥d體pMD18-T購自TaKaRa公司;原核表達(dá)試劑盒pBAD/TOPO?ThioFusionTMExpressionKit購自Invitrogen公司。1.2trsv表面蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析首先,利用軟件ClustalX(1.83)、MEGA5.0和BioEdit7.0對TRSV所有分離物核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(multiplesequencealignment)分析各自的保守區(qū)域。其次,通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果最可靠的同源模型化的方法,分析TRSV外殼蛋白有3個主要結(jié)構(gòu)域,顯示外殼蛋白模擬結(jié)構(gòu)中暴露在表面的位點(diǎn)。第三,采用不同的計算方法和軟件分析TRSV外殼蛋白的抗原表位、氨基酸彈性、表面可及性分析、抗原指數(shù)、β片層和卷曲結(jié)構(gòu)、α螺旋和β轉(zhuǎn)角。第四,根據(jù)以上3個方面的研究結(jié)果,確定TRSV外殼蛋白抗原表位在不同結(jié)構(gòu)域中所在的區(qū)域。1.3ssv-cp基因擴(kuò)增采用Invitrogen公司的Trizol方法提取病毒總RNA。溶解在30μLDEPC處理的水中,-70℃下保存。根據(jù)GenBank中已報道的TRSV-CP基因序列(登錄號:AF461163,AF461164,AY363727,AY787756,L09205,NC005096)保守區(qū),結(jié)合抗原表位預(yù)測的結(jié)果,設(shè)計了特異性引物。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。F-primerTRSV-CP1:5′-ATGGGGCCCGTCATTGATCGT-3′(1～21);R-primerTRSV-CP1:5′-GAACAAAGTGGCGGAGCGACC-3′(1044～1024)。1.4pcr擴(kuò)增片段大小檢測cDNA第一鏈的合成,反應(yīng)體系為20μL,在0.5mLPCR反應(yīng)管中,先加入總RNA5μL,Radomprimer(10pmol/μL)1μL,AMV(10U/μL)1μL,5×Buffer5μL,dNTP(2.5mmol/L)2μL,RNaseInhibitor(40U/μL)1μL,DEPC處理水5μL。反應(yīng)條件:25℃10min,42℃90min,95℃5min,4℃5min。PCR反應(yīng)體系為20μL:ddH2O4μL;dNTP(2.5mmol/L)2μL;10×LATaqBuffer5μL;Upprimer(10pmol/μL)2μL;Downprimer(10pmol/μL)2μL;cDNA3μL;LATaqpolymerase(1U/μL)2μL。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃5min;變性94℃50s,退火58℃60s,延伸72℃90s,30個循環(huán);72℃10min;16℃保存。取PCR產(chǎn)物5μL,Marker為DL2000,1.5%瓊脂糖凝膠電泳,觀察所擴(kuò)增片段的大小。采用TaKaRa公司的DNA凝膠回收試劑盒純化DNA。1.5酶切鑒定及分析將PCR產(chǎn)物回收純化后,按載體操作手冊進(jìn)行連接,連接反應(yīng)體系組成:PCR回收純化產(chǎn)物4.5μL(50～250ng);10×LigaseBuffer1μL;載體DNA0.5μL;T4DNALigase1μL;加ddH20至終體積;置于4℃過夜。用NcoⅠ和EcoRⅤ進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切體系(100μL):10×Buffer20μL;NcoⅠ2μL;EcoRⅤ2μL;pBAD/TOP-CP10μL;ddH2O66μL;混勻后置于37℃過夜。酶切產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。將經(jīng)酶切鑒定為陽性的克隆進(jìn)行序列測定。將鑒定正確的重組子(命名為pBAD/TOP-TRSV-CP)送上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測定。1.6阿拉伯糖誘導(dǎo)的d400將上述測序后正確的菌落在平板LB(Amp,100μg/mL)上劃線,將單菌落接種于3mL液體LB(Amp,100μg/mL)中,37℃下120r/min振蕩培養(yǎng)至D600=1～2。將30μL菌液分別加入已準(zhǔn)備的含有3mL液體LB(Amp,100μg/mL)的5個凍存管中,37℃下120r/min振蕩培養(yǎng)至D600=1～2。上述3mL的正處于對數(shù)生長期中期的培養(yǎng)物,以不同終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%、0.02%、0.002%、0.0002%的阿拉伯糖溶液進(jìn)行誘導(dǎo),37℃下120r/min振蕩培養(yǎng)4h。按Invitrogen公司的ProBondTMPurificationSystem說明書中純化多聚組胺酸融合蛋白的步驟以Ni2+-NTA方法從表達(dá)培養(yǎng)菌液中純化重組蛋白,表達(dá)產(chǎn)物的SDS凝膠電泳參照朱常香等的方法進(jìn)行。1.7聚丙烯酰胺酸融合蛋白的活性采用Invitrogen公司的ProBondTM多聚組胺酸融合蛋白純化試劑盒的抗V5的抗體(結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記,即Anti-V5-HRP)作為與靶蛋白結(jié)合的特異抗體進(jìn)行Westernblot分析。1.8elisa方法第3次免疫7d后,每只小鼠斷尾采血100μL,在選擇抗原的最佳包被濃度、最佳包被條件和抗體最佳工作濃度、最佳反應(yīng)時間等條件的基礎(chǔ)上,建立間接ELISA方法。用該方法檢測小鼠免疫后的抗體水平以及篩選陽性細(xì)胞孔。1最佳包被條件的確定用包被液分別按1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600稀釋抗原為最佳包被濃度,然后分別加到酶標(biāo)板中,每孔加100μL,在最佳包被條件下進(jìn)行包被。2清潔板棄去包被液拍干后,每孔加洗滌液200μL,4min后棄洗滌液。如此重復(fù)3次。3封閉每孔加封閉液200μL,37℃孵育1h,棄封閉液。洗滌同上。4抗寒性將抗體稀釋到最佳濃度,加到酶標(biāo)板中,每孔加100μL,37℃溫箱分別孵育30、60、90、120min,篩選最佳反應(yīng)時間。5清潔板同上。62添加酶標(biāo)記二醇將抗體按1∶5000稀釋到最佳濃度,每孔100μL,37℃溫箱分別孵育30、60、90、120min,篩選最佳反應(yīng)時間。7清潔板同上。8優(yōu)雅加底物液,每孔100μL,37℃避光放置10min。9停止加終止液終止顯色反應(yīng),每孔50μL,用酶標(biāo)儀測定D450值。10評估結(jié)果以P/N≥2.1且P/N值最大時所對應(yīng)的反應(yīng)時間為最佳反應(yīng)時間。1.9單克隆抗體的制備病毒提純參照明艷林等的方法進(jìn)行。通過4次免疫5只6周齡的BALB/c小鼠,采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備單克隆抗體。1.10trsv單克隆抗體與armv、lsv、slrsv的交叉反應(yīng)性單克隆抗體的純化采用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行。采用間接ELISA方法檢測TRSV單克隆抗體與LoMV、ArMV、LSV、SLRSV的交叉反應(yīng)性。用Biotech公司的免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)亞類鑒定試劑盒鑒定單抗的抗體亞類。2結(jié)果與分析2.1出現(xiàn)的表位區(qū)利用軟件綜合分析,預(yù)測TRSV外殼蛋白抗原表位區(qū)可能位于C端319～328、384～388、420～430、480～487、495～511位氨基酸殘基附近。2.2pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定用設(shè)計的CP基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析,顯示擴(kuò)增片段大小約1044bp,與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化克隆到pMD-18T載體上進(jìn)行雙酶切,經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,將經(jīng)酶切鑒定為陽性的克隆進(jìn)行序列測定。將鑒定正確的重組子(命名為pMD-18T-TRSV-CP)送上海生工生物技術(shù)公司測序。測序結(jié)果表明,本試驗(yàn)所擴(kuò)增的序列與GenBank中已報道的TRSV-CP基因序列同源性達(dá)到94%～99%。確認(rèn)所挑選的菌落為含有插入目的片段的重組子。2.3cp基因界cp-pcr對達(dá)重組質(zhì)粒的鑒定用質(zhì)粒提取試劑盒提取pBAD-TRSV-CP重組表達(dá)質(zhì)粒,用NcoⅠ和EcoRⅤ對表達(dá)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,CP基因正向插入的質(zhì)粒產(chǎn)生約3.6、1.1、0.6kb的3條片段,均與預(yù)期的目的條帶大小基本一致(圖2)。將鑒定正確的重組子(命名為pBAD-TRSV-CP)送上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測定,測序結(jié)果與預(yù)期的一致。2.4重組蛋白的純化SDS分析結(jié)果表明,經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá),可產(chǎn)生約54.7ku的特異蛋白條帶,且以終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)4.5h后的表達(dá)量最高(圖3)。經(jīng)誘導(dǎo)的陽性對照菌和未經(jīng)誘導(dǎo)菌株的菌液中未見相應(yīng)的條帶,據(jù)此可初步確定重組表達(dá)質(zhì)粒pBAD/TOP-TRSV-CP中外殼蛋白基因得到表達(dá)。誘導(dǎo)培養(yǎng)后收獲的菌體經(jīng)高壓破碎儀破碎,離心取上清液為粗提物,經(jīng)SDS分析,沉淀中無目的蛋白,說明已經(jīng)完全獲得了目的蛋白。粗提的重組蛋白質(zhì)經(jīng)Ni2+-NTA純化和SDS電泳分析,結(jié)果只有1條分子質(zhì)量為54.7ku的蛋白質(zhì)條帶(圖4)。圖4中的泳道3與4作為菌液純化前后的對比,證實(shí)重組核蛋白得到了很好純化。將pBAD-TRSV-CP重組載體表達(dá)的重組CP蛋白經(jīng)SDS電泳后,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上,加入His標(biāo)簽標(biāo)記的鼠抗抗體完成免疫學(xué)反應(yīng),顯色后出現(xiàn)與重組融合蛋白分子質(zhì)量相應(yīng)大小的條帶(圖5),說明所表達(dá)的TRSV-CP蛋白具有良好的免疫學(xué)活性。2.5elisa法檢測小鼠抗體效能根據(jù)小鼠血清的方陣滴定試驗(yàn)結(jié)果,確定純化TRSV的最佳包被質(zhì)量濃度為5μg/mL,按照P/N≥2.1的判斷標(biāo)準(zhǔn),免疫小鼠的抗體效價達(dá)到了1∶5120以上,可用于細(xì)胞融合。通過優(yōu)化間接ELISA方法的各種孵育條件,最終確定抗原的最佳包被條件為37℃孵育1h,放置4℃過夜;一抗的最佳反應(yīng)時間為37℃孵育90min;酶標(biāo)抗體的最佳孵育時間為60min。2.6小鼠igg中的cp蛋白表達(dá)由于胎生牛血清中支原體的污染,試驗(yàn)最終只獲得1株雜交瘤細(xì)胞株(6D2),其單抗亞型測定結(jié)果為IgG2a,輕鏈的亞型均為k鏈。純化的McAb經(jīng)SDS電泳分析表明,得到的McAb均有2條明顯的電泳條帶(圖6),大小分別在53ku和22ku左右,與BALB/c小鼠IgG的重鏈和輕鏈理論值一致。Westernblot雜交結(jié)果顯示,6D2細(xì)胞株分泌的單克隆抗體均能識別TRSV中的CP蛋白。陽性雜交瘤細(xì)胞株6D2細(xì)胞上清分別與用不同病毒建立的間接ELISA進(jìn)行反應(yīng),細(xì)胞上清與TRSV的病毒粗提液的ELISA反應(yīng)時呈陽性,而與其他病毒LoMV、ArMV、LSV、SLRSV的粗提液建立的ELISA反應(yīng)時均為陰性,健康植株葉片提取液為陰性對照材料,結(jié)果表明單抗具有良好的特異性。3trsv抗血清原表位的檢測煙草環(huán)斑病毒是中國檢疫性有害生物,無論是檢疫工作還是常規(guī)檢驗(yàn)都需要大量抗血清完成初期的ELISA鑒定。目前,國內(nèi)制備的抗血清都是多抗血清,不僅特異性差、效價低,而且勞動強(qiáng)度大。本試驗(yàn)采用生物信息學(xué)的方法,綜合預(yù)測了TRSV外殼蛋白主要分布于β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲區(qū)域、親水性和表面可及性參數(shù)較高區(qū)域,分別位于C端319～328、384～388、420～430、480～487、495～511位氨基酸殘基附近的抗原表位。TRSV外殼蛋白抗原表位的分析結(jié)果,可為制備具有強(qiáng)免疫性免疫原和獲得特異性強(qiáng)且靈敏度高的抗血清提供理論依據(jù),研究成果的應(yīng)用將有望改變我國一直進(jìn)口高價血清的被動局面。單克隆抗體制備周期長、環(huán)節(jié)多,影