種子室內(nèi)檢驗技術(shù)-玉米種子鹽溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳測定程序

種子生產(chǎn)與經(jīng)營專業(yè)玉米種子鹽溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳操作程序

從玉米種子中提取的鹽溶蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠的分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)和電泳系統(tǒng)的電荷效應(yīng)作用下得到良好的分離，通過顯色顯示蛋白質(zhì)譜帶類型。

不同玉米品種由于遺傳基礎(chǔ)不同，種子內(nèi)所含的蛋白質(zhì)種類也有差異，這種差異可利用電泳圖譜加以鑒別，從而對品種真實性和純度進(jìn)行鑒定。一、樣品制備

從送驗樣品中隨機(jī)數(shù)取玉米種子100粒在單粒粉碎器中單粒粉碎后，分別收集到1.5ml離心管中，按體積比約1:1的量加入樣品提取液，搖勻，放置5min后，再搖一次，30min后，用離心機(jī)離心15min，取上清液點樣。一、樣品制備一、樣品制備二、凝膠制備

1、膠室制備

將洗凈晾干的兩塊玻璃板裝入膠條中，然后將膠條固定在電泳槽內(nèi)，保持水平，短板向正極，擰緊螺栓，備用。二、凝膠制備2、封底縫

根據(jù)電泳槽大小，取適量分離膠溶液于燒杯中，用微量進(jìn)樣器加入適量3%的過氧化氫溶液（一般5ml膠液，加20μl3%的過氧化氫溶液）迅速搖勻，并從長玻璃板外側(cè)沿玻璃板倒下，放正電泳槽震動幾下，5min后膠液凝固，將底縫封住。二、凝膠制備

3、灌分離膠

量取分離膠混合液適量，加入3%過氧化氫溶液（一般每15ml分離膠液，加20μl3%的過氧化氫溶液）迅速搖勻，將電泳槽傾斜，將分離膠混合液倒入兩玻璃板之間，高度距短玻璃板上沿1.2cm，放正電泳槽并在實驗臺上振動幾下后，迅速用預(yù)先準(zhǔn)備好的注射器沿玻璃板上沿注入正丁醇溶液（注意：動作要輕，不能沖壞膠面）。5~10min后膠凝固，用注射器吸出膠面上的正丁醇溶液，并用去離子水沖洗膠面2~3次，倒出去離子水，用濾紙吸干二、凝膠制備

4、灌濃縮膠

量取濃縮膠混合液適量，加入3%過氧化氫溶液（一般每5ml濃縮膠液，加40μl3%的過氧化氫溶液）迅速搖勻，倒入兩玻璃板之間，馬上插好樣品梳，用夾子夾住。二、凝膠制備三、點樣

小心拔出樣梳，吸去樣品槽中的水，用微量進(jìn)樣器吸取5~20μl玉米蛋白質(zhì)提取液上清液，依次在樣品槽中按粒點樣，每點一次后，要用去離子水清洗進(jìn)樣器2~3次。四、電泳

1、注入電極緩沖液（上槽浸沒樣品槽，下槽超過鉑絲）。2、打開電泳儀電源，將電壓調(diào)到500v。3、甲基綠指示劑綠線下移至膠底部邊緣0.5~1.0cm處時，關(guān)閉電泳儀。四、電泳五、染色1、卸板

到出電極緩沖液，將玻璃板和密封膠條一同取出，卸下密封膠條，用不銹鋼刀撬開玻璃，用撥板針剝離凝膠板，剝離完后將凝膠板進(jìn)入染色液中。2、染色

染色時間12h。3、洗板

將染色過的膠板放入白磁盤中，用刷子沾取的0.5%洗衣粉水洗刷膠板表面，然后用水沖洗干凈。五、染色六、鑒定

不同品種的電泳圖譜可按其數(shù)目、寬窄、顏色、深淺、相對遷移率等進(jìn)行鑒別。

根據(jù)醇溶蛋白譜帶的組成和帶型的一致性，并與標(biāo)準(zhǔn)樣品電泳圖譜相比較，鑒定種子真實性以及測定品種純度。種子生產(chǎn)與經(jīng)營專業(yè)電泳法測定品種純度的程序電泳法測定品種純度的程序藥品的配制樣品提取液凝膠溶液電極緩沖液樣品的提取凝膠的制備加樣和電泳染色和譜帶分析一、藥液的配制

不同電泳方法提取液和提取的程序不同，應(yīng)按具體方法配制提取液和操作。二、樣品的提取

不同電泳方法提取液和提取的程序不同，應(yīng)按具體方法配制提取液和操作。1、清蛋白

能溶于水。包括大多數(shù)酶蛋白。通?？捎猛っ鸽娪痉椒ㄨb定。

2、球蛋白

難溶于水，能溶于稀鹽溶液；玉米鹽溶蛋白電泳鑒定方法就是對球蛋白進(jìn)行鑒定。

3、醇溶蛋白

不溶于水，但能溶于70～80％的乙醇。小麥和大麥種子醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳。

4、谷蛋白

不溶于水、醇，可溶于稀酸、稀堿中。二、樣品的提取三、凝膠的制備連續(xù)電泳只有分離膠（小麥、大麥PAGE電泳）；不連續(xù)電泳有分離膠和濃縮膠（玉米鹽溶蛋白電泳鑒定方法）。以TEMED（四甲基乙二胺）為催化劑的凝膠系統(tǒng)，溫度低于20℃聚合變慢，可將密封好的玻璃板適當(dāng)預(yù)熱至30～35℃。樣品梳取出后，將槽內(nèi)殘余的溶液用針管吸出。三、凝膠的制備連續(xù)電泳只有分離膠（小麥、大麥PAGE電泳）；不連續(xù)電泳有分離膠和濃縮膠（玉米鹽溶蛋白電泳鑒定方法）。以TEMED（四甲基乙二胺）為催化劑的凝膠系統(tǒng)，溫度低于20℃聚合變慢，可將密封好的玻璃板適當(dāng)預(yù)熱至30～35℃。樣品梳取出后，將槽內(nèi)殘余的溶液用針管吸出。四、加樣和電泳加樣量應(yīng)根據(jù)提取液中蛋白質(zhì)的含量確定，一般10～30μl。四、加樣和電泳電泳時一般采用穩(wěn)壓（農(nóng)業(yè)部玉米鹽溶蛋白電泳鑒定方法：穩(wěn)壓500V）。一般以凝膠板在電泳時不過熱為準(zhǔn)。電泳時為了指示電泳的過程，可加入指示劑，根據(jù)指示劑移動的速度確定電泳時間。（1）對陽離子電泳系統(tǒng)（pH＜pI時，酸性電泳）：可用甲基綠作指示劑。（2）對陰離子電泳系統(tǒng)（pH＞pI時；堿性電泳）用溴酚藍(lán)作指示劑。五、染色蛋白質(zhì)目前用得較多的染色液是10％三氯乙酸（可以10～12％）、0.05～0.1％考馬斯亮藍(lán)R—250，該染色液染色后一般不需要脫色。六、譜帶分析根據(jù)蛋白譜帶的組成及帶型的一致性，區(qū)分本品種和異品種。雜種F1表現(xiàn)為雙親共顯性：即在父母本中所具有的蛋白質(zhì)譜帶，在F1代種子內(nèi)同時出現(xiàn)，沒有新的譜帶產(chǎn)生。（雙親中有差異的蛋白譜帶，同時在F1出現(xiàn)，稱為互補(bǔ)帶）根據(jù)互補(bǔ)帶的有無區(qū)分自交粒和雜交粒。在互補(bǔ)帶存在的條件下：六、譜帶分析（1）如果同時