海南省澄邁縣斑熱自然疫源地調(diào)查

海南省澄邁縣斑熱自然疫源地調(diào)查

海南省位于中國的最南端。它是中國的第二個(gè)島嶼，屬于亞熱帶。獨(dú)特的氣候及地理?xiàng)l件是媒介傳播疾病尤其是立克次體病高發(fā)地區(qū)。2007年12月我們對澄邁縣西達(dá)農(nóng)場1例先后診斷為闌尾炎、貓抓病、淋巴瘤患兒發(fā)熱期血標(biāo)本分離培養(yǎng)立克次體,獲得1株斑點(diǎn)熱群立克次體(Hainan1),經(jīng)分子遺傳學(xué)及血清學(xué)表型分析證實(shí)該分離株與黑龍江立克次體遺傳關(guān)系密切,血清型明顯不同(待發(fā)表)。據(jù)此,我們于2008年1-2月連續(xù)3次對該地區(qū)進(jìn)行了現(xiàn)場流行病學(xué)及實(shí)驗(yàn)室調(diào)查。1材料和方法1.1試驗(yàn)對象和樣本的收集1.1.1病例選擇選擇及資料收集3次共調(diào)查全縣10個(gè)村健康成年人812人(男408人,女404人,平均年齡36歲),可疑患者成年人21例(男8例,女13例,平均年齡32歲),270名學(xué)齡前兒童(男150名,女120名,平均年齡4.2歲)及16例皮疹可疑患兒(男7例,女9例,平均年齡3.4歲)?？梢刹±x為有野外工作史或接觸蜱或近期蜱叮咬史,同時(shí)伴有發(fā)熱、頭痛、皮疹、肌肉痛、乏力等單一表現(xiàn)或多癥狀。調(diào)查對象資料收集包括性別、年齡、職業(yè)、既往病史尤其是蜱、螨叮咬及接觸史、近期皮疹或其他臨床表現(xiàn)等?？梢苫颊卟杉?ml枸櫞酸鈉抗凝血用于病原分離,非抗凝血2ml分離血清用作抗體檢測。1.1.2不同動(dòng)物體內(nèi)dna的采集活體捕捉44只嚙齒動(dòng)物[10只黃胸鼠,8只褐家鼠,15只針毛鼠(Rattusfulvescens),1只白腹巨鼠(Rattusedwardsi),6只赤腹松鼠(Callosciuruserythraeus),3只紅頰長吻松鼠(Dremomysrufigenis)]乙醚麻醉采集體表媒介,同時(shí)現(xiàn)場分類鑒定,并心臟采血分成2管,一管非抗凝血分離血清用于抗體檢測,血塊用于提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。另一管枸櫞酸鈉抗凝血用于病原體分離。本次共采集253只硬蜱、26只螨、15只蚤。媒介按農(nóng)戶及來源動(dòng)物個(gè)體分11組蜱,螨及蚤各2組。媒介研磨液提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。18份農(nóng)戶家犬血液標(biāo)本在當(dāng)?shù)孬F醫(yī)配合下采集。1.2實(shí)驗(yàn)室檢測1.2.1實(shí)驗(yàn)菌株的制備采用間接免疫熒光檢測法(IFA)檢測抗體?？乖杀臼彝ㄟ^細(xì)胞培養(yǎng)原發(fā)患者斑點(diǎn)熱群立克次體分離株制備。實(shí)驗(yàn)操作按WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。按國際普遍接受的臨界值IgG抗體>1∶80為陽性參考值。1.2.2groel基因分析患者、鼠血、犬血及媒介研磨液采用德國試劑盒按說明書進(jìn)行(Qiagen)DNA提取。健康人血標(biāo)本(采集其他地區(qū))按同樣操作提取DNA作為陰性對照。海南斑點(diǎn)熱群立克次體本土分離株細(xì)胞培養(yǎng)物提取DNA作為陽性對照。對上述標(biāo)本巢式PCR擴(kuò)增熱休克蛋白groEL基因。PCR陽性產(chǎn)物直接商業(yè)測序(北京擎科生物技術(shù)有限公司)。1.2.3細(xì)菌細(xì)胞層染色及遺傳穩(wěn)定性檢測患者及鼠血病原體分離培養(yǎng)采用Shellvial培養(yǎng)方法。取0.5ml抗凝血加到含有L929細(xì)胞單層細(xì)胞的Shellvial培養(yǎng)瓶(CatNo129AX/1,BibbysterilinLtdUnitedkingdom),3000r/min,30min棄上清,細(xì)胞層用MEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)洗滌2次,再加1ml新鮮MEM培養(yǎng)基,37℃,5%CO2培養(yǎng)。5d后隔日行Gimanze染色以及用莫氏立克次體,西伯利亞立克次體以及恙蟲病東方體混合抗血清進(jìn)行IFA檢測。采用原核細(xì)菌16SrRNA基因通用引物及斑點(diǎn)熱群立克次體特異ompA基因鑒定分離株。PCR產(chǎn)物送公司商業(yè)測序。1.2.4斑馬熱群立克次體的分型為鑒定當(dāng)?shù)胤蛛x株與遺傳親緣關(guān)系較近的斑點(diǎn)熱群立克次體表型是否存在差異,按傳統(tǒng)的鼠血清型分型方法,對本實(shí)驗(yàn)分離到病原體與黑龍江立克次體進(jìn)行了比較。1.3gebakbrt比較分析序列t檢驗(yàn)確定抗體滴度差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GenBankBlast比較分析序列。采用MEGA4.0軟件進(jìn)行進(jìn)化分析。1.4流行病的現(xiàn)場處理1.4.1發(fā)燒患者通過當(dāng)?shù)匦l(wèi)生院防疫科對發(fā)熱可疑患者免費(fèi)發(fā)放強(qiáng)力霉素(多西環(huán)素),按說明書進(jìn)行口服治療至少15d。1.4.2克林波特的消除免費(fèi)發(fā)放殺蟲劑,按說明書對農(nóng)戶居室游離的蜱以及家畜體表蜱進(jìn)行消殺處理。1.4.3防止并發(fā)癥本次調(diào)查還組織當(dāng)?shù)馗骷塁DC對臨床醫(yī)生進(jìn)行了該病的防控知識培訓(xùn),要求醫(yī)生一旦高度懷疑此病,立即經(jīng)驗(yàn)用藥,防止并發(fā)癥,降低病死率。通過鄉(xiāng)鎮(zhèn)各級行政管理部門進(jìn)行農(nóng)民衛(wèi)生防疫宣傳,強(qiáng)調(diào)人畜分舍,防止蜱的叮咬,一旦被叮咬后出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛等癥狀,就近就醫(yī)進(jìn)行特異抗生素治療。2結(jié)果2.1陰山山地干草原區(qū)澄邁縣位于海南島北部,坐標(biāo)為北緯19°23′~20°01′,東經(jīng)109°45′~110°15′。熱帶季風(fēng)氣候,雨量充沛,年均降雨量1790.7mm。地勢南高北低,南部為丘陵山地,中部為河積平原,北部為臺(tái)地和海積平原。全縣轄10個(gè)鎮(zhèn)及6個(gè)農(nóng)場和3個(gè)林場。其共同特點(diǎn)是鄉(xiāng)村多植被茂密,雜草叢生,農(nóng)村地區(qū)居住環(huán)境衛(wèi)生狀況較差,農(nóng)戶普遍人畜同院養(yǎng)殖水牛、犬、貓、雞、鴨等家畜。前2次調(diào)查的69戶居民中,9戶農(nóng)舍土沙墻壁縫隙(圖1A)及室內(nèi)雜物中可見到處爬動(dòng)蜱(圖1B),墻壁可見捻死蜱后遺留下的斑斑血跡(圖1C)。2.2種植或橡膠種植調(diào)查的812名健康成年人及21例可疑患者全部為農(nóng)業(yè)人群,主要從事家畜養(yǎng)殖或橡膠種植。21例中,12例有皮疹,主要為斑丘疹,4例發(fā)熱,2例肌痛,2例乏力,1例患有精神病,17例回憶有蜱叮咬史或蜱接觸史。10人有體表蟲咬焦痂。43名(15%)學(xué)齡前兒童有皮疹或蟲咬焦痂(圖2)。2.3血液清學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果2.3.1igg抗體檢測按IgG抗體滴度>1∶80為陽性結(jié)果判定,前2次調(diào)查的21例發(fā)熱可疑患者(成年人)及居住村正常人(23人)血清抗體均為陽性,患者平均滴度為186,健康人為174,t檢驗(yàn)二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.82)。16例兒童IgG抗體陽性率為37.5%(6/16)。第3次現(xiàn)場采集的全縣10個(gè)村的789份健康人血清IgG抗體陽性率為45.75%(361/789)。2.3.2家庭的狗和老鼠家犬IgG抗體陽性率高達(dá)88.9%(16/18)。44只鼠為11.4%(5/44),陽性標(biāo)本均來自野生針毛鼠。2.4小鼠血dna檢測結(jié)果21例成年人患者及16例兒童患者血液DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增groEL基因,15例擴(kuò)增陽性(40.5%)。鼠血DNA該基因檢出陽性率為15.9%(7/44)。家犬檢出率為16.7%(3/18)。蜱標(biāo)本檢出率為54.5%(6組/11組)。2組螨及2組蚤均100%擴(kuò)增陽性。2.5立克次體形態(tài)檢測從21例發(fā)熱成年人及16例患兒血液標(biāo)本分離11株斑點(diǎn)熱群立克次體。通過Gemineze及IFA染色均符合立克次體形態(tài)染色特點(diǎn)。PCR擴(kuò)增分離株16SrRNA、ompA、groEL及17kD基因及測序證實(shí)為斑點(diǎn)熱群立克次體。15只針毛鼠血液標(biāo)本,分離到7株斑點(diǎn)熱群立克次體,同樣采用上述基因擴(kuò)增鑒定分離株結(jié)果顯示與人源分離株100%同源。2.6gjb基因片段與gpa/3gmpa片段的關(guān)系病原分離培養(yǎng)陽性11例,9例血液DNA巢式PCR擴(kuò)增groEL基因陽性,序列與相應(yīng)分離株100%同源(588bp)。所有分離株16SrRNA(830bp)、groEL(588bp)及ompA(634bp)基因序列片段與當(dāng)?shù)厥装l(fā)病例患兒分離株(Hainan1)、黑龍江立克次體(R.heilongjiangensis)及廣東連平縣野鼠分離株GDM17、GDM15及GDM18相應(yīng)基因100%同源。17kD基因(289bp)與黑龍江立克次體及GDM17相應(yīng)基因99%同源。11株病原分離株檢測的基因片段沒有發(fā)現(xiàn)差異序列。本調(diào)查海南斑點(diǎn)熱群立克次體優(yōu)勢流行株(以Hainan1株為代表)17kD基因與GenBank收錄的其他斑點(diǎn)熱群立克次體相應(yīng)基因進(jìn)化分析見圖3。2.7與特色鼠源檢測及熱群分析對比采用傳統(tǒng)鼠血清分型對該地區(qū)原發(fā)分離株Hainan1與黑龍江立克次體進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),同廣東野鼠分離株相似,本次分離的11株人源及7株鼠源斑點(diǎn)熱群立克次體分離株與黑龍江立克次體之間SPD值均>3。2.8家犬所采集的蛛種經(jīng)系統(tǒng)分類鑒定,當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶家室采集的游離蜱及水牛、家犬體表采集的蜱種至少有3個(gè)種、屬。分別是鈍形扇頭蜱(圖4A為雌,B為雄)、中華血蜱(圖4C為腹面,D為背面)以及微小牛蜱(圖4E腹面,F背面)。3立克次體的血清型差異研究本調(diào)查所有斑點(diǎn)熱患者經(jīng)特效抗生素強(qiáng)力霉素治療后痊愈,多數(shù)患者體表皮疹消退,少數(shù)患者可見皮疹后色素沉著。然而,采用殺蟲劑對蜱消殺后,絕大多數(shù)農(nóng)戶仍然存在大量活蜱,農(nóng)戶環(huán)境衛(wèi)生無顯著改觀。當(dāng)?shù)鼐用褚騻鹘y(tǒng)風(fēng)俗,不愿承認(rèn)家居蜱是該類疾病的真正原因,多數(shù)人寧愿承認(rèn)家里墻壁上捻死蜱后留下的血跡是蜱叮咬犬的血,而不是人的血。本調(diào)查以1名先后診斷為闌尾炎、貓抓病及淋巴瘤患兒病原學(xué)證據(jù)為線索,先后對該患者居住村、鄰村甚至整個(gè)澄邁縣不同地理位置及特征的10個(gè)自然村進(jìn)行了現(xiàn)場調(diào)查。通過對斑點(diǎn)熱患者、農(nóng)業(yè)高危正常人群、家犬、小嚙齒動(dòng)物及媒介蜱、螨及蚤等病原學(xué)研究、分子生物學(xué)研究以及血清學(xué)調(diào)查證實(shí)了海南斑點(diǎn)熱自然疫源地。11株人源及7株鼠源立克次體分子遺傳學(xué)及血清表型研究證實(shí)該地區(qū)優(yōu)勢流行株為黑龍江立克次體遺傳關(guān)系密切而血清型不同的斑點(diǎn)熱群立克次體,分離株基因序列分析顯示,本地流行株為同一克隆系,PCR擴(kuò)增患者、鼠、家犬等血液DNAgroEL基因后,序列分析支持上述結(jié)果。除了黑龍江立克次體外,本地流行株還與中國廣東省連平縣6株野鼠(2株針毛鼠、2株白腹巨鼠及2株社鼠)斑點(diǎn)熱群立克次體分離株遺傳關(guān)系密切。但二者之間血清型是否存在差異需進(jìn)一步研究。血清流行病學(xué)調(diào)查顯示澄邁縣高危農(nóng)業(yè)人群對這一新發(fā)斑點(diǎn)熱群立克次體流行株的IgG抗體陽性率為46.1%,兒童為37.5%,家犬為88.9%,鼠類為11.4%。說明該病原體存在普遍人群感染狀況。此次調(diào)查獲得的野鼠分離株全部來自當(dāng)?shù)匾吧樏?以前研究顯示廣東省連平2株斑點(diǎn)熱群立克次體野鼠分離株也來自野生針毛鼠。何劍峰等報(bào)道從廣東地區(qū)野生針毛鼠體表寄生蜱分離到2株西伯利亞立克次體。蜱分類鑒定結(jié)果顯示當(dāng)?shù)仳绶N至少存在鈍形扇頭蜱、鈍刺血蜱以及微小牛蜱3種,而PCR檢測分析結(jié)果顯示采集蜱、螨及蚤等標(biāo)本均擴(kuò)增到與分離株100%同源的groEL基因序列。由此,我們推測,當(dāng)?shù)匕唿c(diǎn)熱傳播可能與多種媒介有關(guān)。然而,本研究沒有對不同種類蜱進(jìn)行病原攜帶率檢測,也沒有對螨及蚤進(jìn)行分類,因此進(jìn)一步調(diào)查當(dāng)?shù)貍鞑?yōu)勢媒介及種類以及其他媒介傳播立克次體病原體攜帶狀況十分必要。1993年,林碧瑚等從血清學(xué)及病原學(xué)上證實(shí)海南島存在斑點(diǎn)熱,采用西伯利亞立克次體抗原檢測海南興隆農(nóng)場、三亞市、?？谑?、瓊中市等地區(qū)采集的532份人血清標(biāo)本進(jìn)行IFA檢測,發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)厝巳喊唿c(diǎn)熱群立克次體IgG抗體陽性率為30.8%,并從20例發(fā)熱患者血液中分離到12株立克次體,PCR證實(shí)7株為斑點(diǎn)熱群立克次體,但該研究沒有對分離株的遺傳學(xué)及血清學(xué)表型進(jìn)行深入鑒定。斑點(diǎn)熱群立克次體是蜱、螨及蚤傳的一類病原體,目前,世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)10余種致病菌。中國病原學(xué)證實(shí)的種類有黑龍江立克次體、西伯利亞立克次體內(nèi)蒙古亞種、西伯利亞立克次體西伯利亞亞種。黑龍江立克次體致病性在中國周邊國家如前蘇聯(lián)遠(yuǎn)東及日本先后證實(shí)。西伯利亞立克次體內(nèi)蒙古亞種也在法國南部及非洲得到證實(shí),現(xiàn)認(rèn)為該病原體主要引起淋巴腺炎。西伯利亞立克次體西伯利亞亞種在我國分布廣泛,西到新疆,南到廣東等全國范圍內(nèi)已經(jīng)分離到20余株病原體。盡管斑點(diǎn)熱群立克次體流行病學(xué)調(diào)查顯示,中國病原譜多樣,但該類疾病在臨床上很少被認(rèn)識,且因缺乏必要的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù),結(jié)果導(dǎo)致患者多器官受累,甚至死亡,本調(diào)查的首發(fā)病例就是典型的例子。海南省存在新發(fā)斑點(diǎn)熱的流行。加強(qiáng)當(dāng)?shù)丶爸苓叺貐^(qū)立克次體病的診斷及鑒別診斷能力、減