細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)置、設(shè)備和準(zhǔn)備工作

細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)置、設(shè)備和準(zhǔn)備工作細(xì)胞生物學(xué)2010-04-0810:41:44閱讀12評論0字號：大中小一、細(xì)胞培養(yǎng)實驗室的設(shè)置及設(shè)備（一）細(xì)胞培養(yǎng)實驗室的設(shè)置組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與其他一般實驗室工作的主要區(qū)別在于要求保持無菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響。目前，超凈工作臺的廣泛使用，很大程度上方便了組織細(xì)胞培養(yǎng)工作，并使一些常規(guī)實驗室有可能用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)實驗室應(yīng)能進(jìn)行六方面的工作：無菌操作、孵育、制備、清洗、消毒滅菌處理、儲藏。1．無菌操作區(qū)（1）無菌操作室：無菌操作區(qū)只限于細(xì)胞培養(yǎng)及其他無菌操作的區(qū)域，最好能與外界隔離，不能穿行或受其他干擾。理想的無菌操作室應(yīng)劃為三部分：a） 更衣室一一供更換衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。b） 緩沖間一一位于更衣間與操作間之間，目的是為了保證操作間的無菌環(huán)境，同時可放置恒溫培養(yǎng)箱及某些必需的小型儀器。c） 無菌操作間一一專用于無菌操作、細(xì)胞培養(yǎng)。其大小要適當(dāng)，且其頂部不宜過高（不超過2.5m）以保證紫外線的有效滅菌效果；墻壁光滑無死角以便清潔和消毒。工作臺安置不應(yīng)靠墻壁，臺面要光滑壓塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖組織及酚紅顯示pH的觀察。無菌操作間的空氣消毒：紫外線燈一－產(chǎn)生臭氧，并且室內(nèi)溫度及濕度均較高，不利于工作人員健康?？諝膺^濾的恒溫恒濕裝置一－最好。表1潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度級別表潔凈度級別塵粒最大允許數(shù)／立方米微生物最大允許數(shù)浮游菌／立方米沉降菌／皿100級3,50005110000級350,0002,0001003100000級3,500,00020,00050010300000級10,350,00060,000-15無臭氧紫外線消毒器電子消毒滅菌器一－在高壓電場作用下，電子管的內(nèi)外電極發(fā)生強烈電子轟擊，使空氣電離而將空氣中的氧轉(zhuǎn)換成臭氧。臭氧是一種強氧化劑，能同細(xì)菌的胞膜及酶蛋白氫硫基進(jìn)行氧化分解反應(yīng)，從而靠臭氧氣體彌漫性擴(kuò)散達(dá)到殺菌之目的，消毒時沒有死角。消毒后空間的殘留臭氧只需30?40min即能自行還原成氧氣，空氣不留異味，消毒物體表面不留殘毒。（2）凈化工作臺：操作簡單，安裝方便，占用空間小且凈化效果很好。一般細(xì)菌培養(yǎng)室使用的凈化工作臺主要有兩種：a）側(cè)流式或稱垂直式b）外流式或稱水平層流式。凈化工作臺工作原理（大致相同）—－通常是將室內(nèi)空氣經(jīng)粗過濾器初濾，由離心風(fēng)機壓入靜壓箱，再經(jīng)高效空氣過濾器精濾，由此送出的潔凈氣流以一定的均勻的斷面風(fēng)速通過無菌區(qū)，從而形成無塵無菌的高潔凈度工作環(huán)境。側(cè)流式工作臺—－空氣凈化后的氣流由左或右側(cè)通過工作臺面流向?qū)?cè)，也有從上向下或從下向上流向?qū)?cè)，形成氣流屏障保持工作區(qū)無菌。工作臺結(jié)構(gòu)為封閉式。外流式（水平式）工作臺—－凈化后的空氣面向操作者流動，因而外方氣流不致混入操作，但進(jìn)行有害物質(zhì)實驗操作則對操作者不利。工作臺結(jié)構(gòu)為開放式（已少用）。凈化工作臺應(yīng)用注意：（1） 凈化工作臺應(yīng)安裝在隔離好的無菌間或清潔無塵的房間內(nèi)，以免塵土過多易使過濾器阻塞，降低凈化效果，縮短其使用壽命。（2） 新安裝的或長期未使用的工作臺，工作前必須對工作臺和周圍環(huán)境用真空吸塵器或不產(chǎn)生纖維的工具進(jìn)行清潔工作，然后再采用藥物滅菌法或紫外線滅菌進(jìn)行滅菌處理。（3） 使用凈化工作臺前，應(yīng)先用75%酒精擦洗臺面，并提前以紫外線滅菌燈照射30?50min處理凈化工作區(qū)內(nèi)積存的微生物。關(guān)閉滅菌燈后應(yīng)啟動風(fēng)機使之運轉(zhuǎn)兩分鐘后再進(jìn)行培養(yǎng)操作。（4） 凈化工作區(qū)內(nèi)不應(yīng)存放不必要的物品，以保持潔凈氣流流型不受干擾。（5）注意凈化區(qū)內(nèi)氣流的變化，一旦感到氣流變?nèi)?，如酒精燈火焰不動，加大電機電壓仍未見情況改變則說明濾器已被阻塞，應(yīng)及時更換。一般情況下，高效過濾器三年更換一次。更換高過濾器應(yīng)請專業(yè)人員操作，以保持密封良好。粗過濾器中的過濾布（無紡布）應(yīng)定期清洗更換，時間應(yīng)根據(jù)工作環(huán)境潔凈程度而定，通常間隔3-6個月進(jìn)行一次。（6） 凈化工作臺使用完畢應(yīng)及時清理工作臺面上的物品并用酒精擦洗臺面使之始終保持潔凈。（7） 凈化工作臺應(yīng)定期進(jìn)行功能測試，檢查凈化工作臺各項工作指標(biāo)是否達(dá)到要求，例如進(jìn)行無菌試驗，定期檢查臺面空氣的潔凈度是否達(dá)標(biāo)。超凈工作臺的無菌程度檢查超凈工作臺在消毒處理后，無菌試驗前及操作過程中需檢查空氣中菌落數(shù)；取直徑約90mm平皿，在超凈工作臺內(nèi)點燃酒精燈，在酒精燈旁，以無菌操作，將平皿半開注入溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20ml,制成平板，在30?35°C預(yù)培養(yǎng)48小時，證明無菌后將平板3個，以無菌方式帶入超凈工作臺內(nèi)左、中、右各放一個；打開平皿蓋扣置，平板在空氣中暴露30分鐘后將平皿蓋蓋好，置30?35C培養(yǎng)48小時，取出檢查，100級清潔度要求：3個平皿上生長的菌落數(shù)平均不得超過1個。超凈工作臺應(yīng)定期請有關(guān)部門檢查其潔凈度，應(yīng)達(dá)到100級（一般用塵埃粒子計數(shù)儀）檢測塵埃粒徑S5祄的粒數(shù)不得超過3.5個/升；空氣流量應(yīng)控制在0.75~1.0m3/s；細(xì)菌菌落數(shù)平均＜1個，可根據(jù)無菌狀況必要時置換過濾器。2．孵育區(qū)本區(qū)對無菌的要求雖不比無菌區(qū)嚴(yán)格，但仍需清潔無塵，因此也應(yīng)設(shè)置在干擾少而非來往穿行的區(qū)域。孵育可在孵箱或可控制溫度的溫室中進(jìn)行，后者費用高，一般實驗室多采用孵箱進(jìn)行工作。3．制備區(qū)在該區(qū)主要進(jìn)行培養(yǎng)液及有關(guān)培養(yǎng)用的液體等的制備。4．儲藏區(qū)主要存放各類冰箱、干燥箱、液氮罐、無菌培養(yǎng)液、培養(yǎng)瓶等，此環(huán)境也需要清潔無塵。5．清洗和消毒滅菌區(qū)清潔和消毒滅菌區(qū)應(yīng)與其他區(qū)域分開，主要進(jìn)行所有細(xì)胞培養(yǎng)器皿的清洗、準(zhǔn)備、消毒及三蒸水制備等工作。（二）細(xì)胞培養(yǎng)實驗室的設(shè)備組織細(xì)胞培養(yǎng)室除一般實驗室的普通常規(guī)設(shè)備外，尚有一些特殊需要的設(shè)備?；究煞譃閮纱箢悾旱谝活悶槌Ｓ玫幕驹O(shè)備；第二類為較高級的特殊設(shè)備。常用的基本設(shè)備（1）儀器：a）顯微鏡：倒置顯微鏡一一是組織細(xì)胞培養(yǎng)室所必需的日常工作常規(guī)使用設(shè)備之一，便于掌握細(xì)胞的生長情況并觀察有無污染等。一一若有條件，尚可配置帶有照相系統(tǒng)的高質(zhì)量相差顯微鏡、解剖顯微鏡、熒光顯微鏡、錄像系統(tǒng)或縮時電影拍攝裝置等，以便隨時觀察、記錄、攝影細(xì)胞生長情況。a）培養(yǎng)箱：體外培養(yǎng)的細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞一樣，需要在恒定的溫度下生存，大多數(shù)情況下，最適溫度是37°C，溫差變化一般不應(yīng)超過±0.5°C，細(xì)胞在溫度升高2°C時，持續(xù)數(shù)小時即不能耐受，40°C以上將很快死亡。因此需要有能控制溫度的培養(yǎng)箱，如具有較高靈敏度的恒溫培養(yǎng)箱及CO2培養(yǎng)箱。恒溫培養(yǎng)箱一一應(yīng)選隔水式或晶體管自控溫培養(yǎng)箱，此類培養(yǎng)箱靈敏度高，溫度控制較穩(wěn)定。一般的恒溫培養(yǎng)箱價格較便宜，其缺點是只宜于作密閉式培養(yǎng)。CO2培養(yǎng)箱一一目前多數(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)室已廣泛使用。CO2培養(yǎng)箱的優(yōu)點是能夠提供進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時所需要的一定量的CO2（常用濃度為5%），易于使培養(yǎng)液的pH保持穩(wěn)定，適用于開放或半開放培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞的器皿可用培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶；當(dāng)使用培養(yǎng)瓶時，可將瓶蓋略微旋松，使培養(yǎng)瓶內(nèi)與外界保持通氣狀態(tài)。由于這種培養(yǎng)方法培養(yǎng)器皿內(nèi)部與外界相通，培養(yǎng)箱內(nèi)空氣必須保持清潔，應(yīng)定期以紫外線照射或酒精消毒。同時培養(yǎng)箱應(yīng)放置盛有無菌蒸餾水的水槽，防止培養(yǎng)液蒸發(fā)，使箱內(nèi)相對濕度始終保持為100%。c） 干燥箱：用于細(xì)胞培養(yǎng)箱的有些器械、器皿需要烘干后才能使用，玻璃器皿等須干熱消毒。干熱消毒時，電熱干燥箱升溫較高，一般需達(dá)到160C以上。通常使用鼓風(fēng)式電熱干燥箱。其優(yōu)點是溫度均勻、效果較好，缺點是升溫過程較慢。升溫時不能先升溫后鼓風(fēng)而應(yīng)鼓風(fēng)與升溫同時開始，至100C時，停止鼓風(fēng)，應(yīng)避免包裹器皿的紙或棉花燒焦，燒焦的碎屑可影響細(xì)胞的生長。消毒后，不能立即打開箱門以免驟冷而導(dǎo)致玻璃器皿損壞，應(yīng)等候溫度自然下降至100C以下方可開門。d） 水純化裝置：細(xì)胞培養(yǎng)對水的質(zhì)量要求較高，細(xì)胞培養(yǎng)以及與細(xì)胞培養(yǎng)工作相關(guān)的液體的配制用水必須事先嚴(yán)格純化處理。水純化時可采用離子交換裝置或蒸餾器。離子交換純水尚不能有效去除有機物，因此用水時尚需再次蒸餾。進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時配制各種培養(yǎng)液及試劑等均需使用三次蒸餾水：即使是用于玻璃器皿的沖洗，也應(yīng)使用二次以上蒸餾水。目前國內(nèi)使用較多的是自動雙重純水蒸餾器（石英管加熱），使用方便，安全、蒸餾速度快（1600ml/h）。使用注意：oa不可采用普通自來水蒸餾，以免蒸餾器內(nèi)很快結(jié)成水垢影響蒸餾效果；同時，還需視蒸餾器內(nèi)存水垢程度定期徹底清洗蒸餾器。ob正確的使用方法是將經(jīng)金屬蒸餾器蒸餾的蒸餾水加入玻璃蒸餾器內(nèi)進(jìn)行再次蒸餾。一般配制培養(yǎng)液的用水應(yīng)在配液前蒸餾，不宜使用存放數(shù)日的三蒸水，以免影響培養(yǎng)用水的質(zhì)量。目前市場上供應(yīng)的是含有各種級別和類型的采用一種或多種純化方法相結(jié)合的使普通水純化為純水和超純水的純水系統(tǒng)可供選擇。例如：設(shè)計靈活的可以掛壁、也可為臺式，也可以有儲水箱、也可直接用分液槍的純水裝置；還可根據(jù)各類實驗用水需求選擇配備有效殺菌或去除DNA酶、RNA酶、蛋白酶等，甚至可有效去除掉熱源、內(nèi)毒素的超濾型純水器。e） 冰箱：細(xì)胞培養(yǎng)室必須配備oa普通冰箱或冷藏柜——儲存培養(yǎng)液、生理鹽水、Hank's液試劑等培養(yǎng)用的物品及短期保存組織標(biāo)本。ob低溫冰箱（-20°C）、超低溫冰箱——用于儲存需要冷凍保存生物活性及較長時期存放的制劑，如酶、血清等。——細(xì)胞培養(yǎng)室的冰箱應(yīng)屬專用，不得存放易揮發(fā)、易燃燒等對細(xì)胞有害的物質(zhì)，且應(yīng)保持清潔。f） 細(xì)胞冷凍儲存器：儲存器常用的是液氮容器。根據(jù)使用需要分為不同的類型及多種規(guī)格。選擇購置液氮容器時要綜合考慮容積大小，取放使用方便及液氮揮發(fā)量（經(jīng)濟(jì)）三種因素。液氮容器的大小可自25L?500L，可以儲存1ml的安瓿250?15000個左右。液氮溫度可低達(dá)-196C，使用時應(yīng)防止凍傷。由于液氮不斷揮發(fā)，應(yīng)注意觀察存留液氮情況，及時定期補充液氮，避免揮發(fā)過多而致細(xì)胞受損。目前，國內(nèi)各類實驗室已廣泛使用新型的細(xì)胞冷凍儲存器。市場所提供的各種新型的細(xì)胞冷凍儲存器具有性能優(yōu)異，使用方便等特點。例如：——可通過先進(jìn)的電子控制器實現(xiàn)凍存自動化并監(jiān)測液氮水平和樣品溫度，確保樣品溫度始終處于設(shè)定溫度點；——可配備先進(jìn)的報警系統(tǒng)，分別警報液氮液面、溫度、電池、電壓、電源等失常情況：——同時具備熱氣體旁路系統(tǒng)，防止高于-130C的暖空氣進(jìn)入液氮罐，從而更有效地保護(hù)樣品，防止升溫。另外，多種規(guī)格的先進(jìn)液氮運輸，供應(yīng)罐系列不僅移動方便，還可通過連接管給儲存罐補充液氮，提高工作效率，保證樣品安全。g） 離心機：進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時，常規(guī)需要進(jìn)行制備細(xì)胞懸液、調(diào)整細(xì)胞密度、洗滌、收集細(xì)胞等工作,通常需要使用離心機。oa一般可常規(guī)配置4000rpm的國產(chǎn)臺式離心機，例如細(xì)胞沉降，使用80?100g的離心機即可，離心力過大有時可能引起細(xì)胞的損傷。ob另外，可根據(jù)需要添置其他類型如大容量或可調(diào)節(jié)溫度的離心機等oc若需特殊用途，例如某些細(xì)胞的分離制備需梯度離心，則需另行配置實驗所需的具備其他特殊功能的離心機。h） 天平：常用的有扭力天平、精密天平及各種電子天平。分析天平的感量為O.lmg、O.OImg和O.OOImg。根據(jù)稱取物質(zhì)的量和稱量精度的要求，選擇適宜級別的天平。要求精密稱定時，當(dāng)取樣量大于100mg選用感量為O.lmg天平，在100—10mg選用感量為0.01mg天平，小于10mg選用感量為0.001mg天平。i） 消毒器：直接或間接與細(xì)胞接觸的物品均需消毒滅菌處理。常用：oa手提式高壓蒸汽消毒器Ob目前市場上，具有高效、安全、方便等性能，適用于各種器皿、液體、培養(yǎng)基的高壓滅菌裝置已在流通（如脈動真空滅菌器）?？晒┦褂谜咴跍缇耐瑫r監(jiān)測滅菌容器內(nèi)的壓力和溫度，確保滅菌質(zhì)量和安全，并可通過記憶（儲存）支持系統(tǒng)改變各種參數(shù)（例如滅菌、排氣、加熱等參數(shù)），即使在進(jìn)行滅菌時發(fā)生停電故障，仍可保留所設(shè)定的參數(shù)j） 濾器：目前細(xì)胞培養(yǎng)工作中采用的培養(yǎng)用液，包括人工合成培養(yǎng)液、血清、消化用胰酶等常含有維生素、蛋白、多肽、生長因子等物質(zhì)，這些物質(zhì)在高溫或射線照射下易發(fā)生變性或失去功能，因而上述液體多采用濾過消毒以除去細(xì)菌。目前常使用的濾器有Zeiss濾器、玻璃濾器和微孔濾器，各種濾器有其使用原理和特點。2）培養(yǎng)用器皿：a）培養(yǎng)器皿：供細(xì)胞接種、生長等用的器皿，可由透明度好、無毒的中性硬質(zhì)玻璃或無毒而透明光滑的特制塑料制成。（a） 玻璃培養(yǎng)器皿的優(yōu)點是多數(shù)細(xì)胞均可生長，易于清洗、消毒，可反復(fù)使用，并且透明而便于觀察；缺點是易碎，清洗時費人力。（b） 塑料制培養(yǎng)器皿的優(yōu)點是一次性使用，廠家已消毒滅菌密封包裝，打開即可用于細(xì)胞培養(yǎng)操作。常用的培養(yǎng)器皿：培養(yǎng)瓶：由玻璃或塑料制成。主要用于培養(yǎng)、繁殖細(xì)胞。進(jìn)行培養(yǎng)時培養(yǎng)瓶瓶口加蓋螺旋瓶蓋或膠塞，膠塞多用于密封培養(yǎng)。國產(chǎn)培養(yǎng)瓶的規(guī)格以容量（ml）表示，如250ml、100ml、25ml等；進(jìn)口培養(yǎng)瓶則多以底面積（cm2）表示。培養(yǎng)皿：由玻璃或塑料制成，供盛取、分離、處理組織或做細(xì)胞毒性、集落形成、單細(xì)胞分離、同位素?fù)饺?、?xì)胞繁殖等實驗使用。常用的培養(yǎng)皿規(guī)格有10cm、9cm、6cm、3.5cm等。多孔培養(yǎng)板：為塑料制品。可供細(xì)胞克隆及細(xì)胞毒性等各種檢測實驗使用。其優(yōu)點是節(jié)約樣本及試劑，可同時測試大量樣本，易于進(jìn)行無菌操作。培養(yǎng)板分為各種規(guī)格，常用的規(guī)格有：96孔、24孔、12孔、6孔、4孔等。各種單層生長的細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中長滿時可獲得的細(xì)胞數(shù)，主要是取決于器皿的底表面積和細(xì)胞體積的大小。常用培養(yǎng)器皿及可獲得的細(xì)胞數(shù)（以Hela細(xì)胞為例）見表2。表2常用的培養(yǎng)器皿及可獲得的細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)器皿底面（cm2）加培養(yǎng)液量（ml）可獲細(xì)胞量96孔培養(yǎng)板0.320.11x10524孔培養(yǎng)板21.05x10512孔培養(yǎng)板4.52.01x1066孑L培養(yǎng)板9.62.52.5x1064孔培養(yǎng)板285.07x1063.5cm培養(yǎng)皿83.02.0x1066cm培養(yǎng)皿215.05.2x106cm培養(yǎng)皿4910.012.2x106cm培養(yǎng)皿5510.013.7x10625cm塑料培養(yǎng)瓶255.05x10675cm塑料培養(yǎng)瓶7515~302x10725ml玻璃培養(yǎng)瓶194.03x106100ml玻璃培養(yǎng)瓶37.510.06x106250ml玻璃培養(yǎng)瓶7815.07x1072500ml旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶700100~2502.0x108b） 培養(yǎng)操作有關(guān)的器皿：oa貯液瓶：主要用于存放或配制各種培養(yǎng)用液體如培養(yǎng)液、血清及試劑等。貯液瓶分為各種不同規(guī)格，如1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、5ml等。ob吸管：主要分為刻度吸管、無刻度吸管。刻度吸管主要用于吸取、轉(zhuǎn)移液體，常用的有ml、2ml、5ml、10ml等規(guī)格。無刻度吸管分為直頭吸管及彎頭吸管，除可以作吸取、轉(zhuǎn)移液體外，彎頭尖吸管還常用于吹打、混勻及傳代細(xì)胞。oc加樣器（移液器）：用于吸取、移動液體或滴加樣本?？筛鶕?jù)需要調(diào)節(jié)量的大小，吸量準(zhǔn)確、方便。尤以微量加樣器，可保證實驗樣品（或試劑）含量精確，重復(fù)性良好。目前，可高溫